CN114410758A - 一种高效高特异性检测hpa基因型的方法和试剂盒 - Google Patents

一种高效高特异性检测hpa基因型的方法和试剂盒 Download PDF

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CN114410758A CN202110601183.2A CN202110601183A CN114410758A CN 114410758 A CN114410758 A CN 114410758A CN 202110601183 A CN202110601183 A CN 202110601183A CN 114410758 A CN114410758 A CN 114410758A
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吴惠容
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Abstract

一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒，包括以下步骤：步骤1、多组HPA引物组与检测模板退火；步骤2、在DNA聚合酶的作用实现模板退火延伸；步骤3、延伸产物结合荧光基团显色或荧光探针在DNA聚合酶外切酶活性下释放报告基团；步骤4、通过熔解曲线或不同荧光探针标记实现对不同的HPA基因型进行检测实现了对HPA1～6,15,21多个位点基因的检测；实现了高效特异性检测HPA基因型的多态性；采用双系统的报告系统，极大提高检测灵敏度和特异性；高效高特异性的富集技术，实现了低起始量样本检测。

Description

一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体为一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒。
背景技术
血小板(blood platelet，PLT)：哺乳动物血液中有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。体积小，无细胞核，形状不规则，有质膜，没有细胞核，一般呈圆形。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为1～3×105/mm3)，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。
血小板膜含有多种蛋白质，这些蛋白质连接有大量的碳水化合物支链而成为糖蛋白。血小板糖蛋白不仅对维持血小板型态和完整性非常重要，同时构成血小板的各种受体，使血小板发挥止血及相关功能。血小板糖蛋白基因发生变异时，可改变血小板糖蛋白结构和表达水平，进而影响血小板的黏附、聚集和血栓形成。
血小板抗原根据其分布情况可分为两大类型：一是与其他细胞或组织共有的抗原(ABH、HLA-I类等)；二是血小板本身特有的抗原(human platelet antigen，HPA)
1.2.1血小板相关抗原：包括人类白细胞抗原(HLA-I类)和红细胞ABO血型系统，其中约80％的免疫性PTR是由抗体不合引起。
1.2.2血小板特异性抗原：通过检出相应抗体而发现，截止目前已确定了HPA-1、2、3、4、5、15六个系统24个血小板抗原，每个抗原系统是由共显性双等位基因控制。其中约20％的免疫性PTR是由HPA抗体不合引起。
1.3与血小板抗原相关疾病的形成
血小板抗原根据其分布情况可分为两大类型：一是与其他细胞或组织共有的抗原(ABH、HLA-I类等)；二是血小板本身特有的同种抗原(human platelet antigen，HPA)，由血小板特有的抗原决定簇组成，HPA不匹配可引起血小板同种免疫反应，产生血小板同种抗体，一般由输血、妊娠或骨髓移植等免疫刺激而产生，导致同种免疫性血小板减少，诱发如输血后血小板减少性子癜(Post-Transfusion Purpura，PTP)、血小板输注无效(PlateletTransfusion Refractoriness，RTP)、自身免疫性血小板减少症(AutoimmuneThrombocytopenia，AITP)、新生儿同种异体免疫性血小板减少症(Neonatal AlloimmuneThrombocytopenia，NAITP)等疾病，同时在临床移植中还会引起移植排斥。
1.4血小板输注
血小板数低于正常值时会引起一系列病症：多发性瘀斑、粘膜出血、手术后大量出血、胃肠道大量出血、中枢神经系统内出血等，严重时可危及生命。重症再生障碍性贫血、急性白血病、癌症、血小板无力症、巨血小板综合征、血小板型血管性血友病等患者需要输注血小板才能延续生命。
血小板输注可能会出现血小板输注无效(platelet refractoriness，PTR)，研究报道80％的PTR是由非免疫性因素造成，另有20％是由免疫性因素造成。非免疫因素有：血小板制品的品质、感染发热、脾肿大、弥散性血管内凝血、药物、骨髓移植。免疫因素由血小板相关抗原及血小板特异性抗原所造成，血小板相关抗原包括人类白细胞抗原(HLA-I类)和红细胞ABO血型系统，其中约80％的免疫性PTR是由抗体不合引起；血小板特异性抗原为HPA-1、2、3、4、5、15六个系统24个血小板抗原，每个抗原系统是由共显性双等位基因控制，其中约20％的免疫性PTR是由HPA抗体不合引起。
HPA分型检测方法主要包括血小板免疫荧光试验、单克隆抗体特异性免疫固定检测、抗原捕获酶联免疫吸附试验、微柱凝胶间接免疫分析技术、核酸检测方法、前四种分型免疫法灵敏度较差、假阳性较高等缺陷。核酸检测方法存储高灵敏、定性分析的特点。
核酸检测方法用于SNP基因分析的方法包括：PCR-SSP、PCR-RFLP、PCR-ASO、基因芯片、实时定量PCR；但各自有优缺点。存在操作复杂、设备投入大、检测周期长等特点。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，包括以下步骤：
步骤1、多组HPA引物组与检测模板退火；
步骤2、在DNA聚合酶的作用实现模板退火延伸；
步骤3、延伸产物结合荧光基团显色或荧光探针在DNA聚合酶外切酶活性下释放报告基团；
步骤4、通过熔解曲线或不同荧光探针标记实现对不同的HPA基因型进行检测。
本发明改进有，所述步骤4中的检测为：通过引物的筛选性和扩增产物的特异性两种方式耦合实现对不同模板的检测，检测方法包括HPA高效高特异性引物组、报告反应体系及高效反应液。
本发明改进有，所述扩增产物的特异性由两种方式，一种由特异性引物延伸扩增野生型模版，诱导特异性的探针报告基团水解形成成野生型的荧光信号，而突变型由所特异性的扩增，诱导产生突变型的荧光，实现两种不同模板的识别。另一种方式根据引物设计调整不同扩增产物大小，实现不同产物的Tm值不同，通过荧光信号在Tm条件下顺速也模板解离，荧光信号迅速衰减，因而通过不同Tm方式实现对不同模板的区分。
本发明改进有，所述HPA高效高特异性引物组由通用引物与错配碱基组成，所述通用引物为与HPA模板碱基互补配对的碱基组成，所述的错配碱基的错配方式为：强错配，中等错配，弱错配；碱基组合方式为：CC、GG，中等错配为：AC、GT,弱等错配为：AA、TT。
本发明改进有，所述通用引物由15～35个碱基组成；所述的通用引物的TM为55～80℃。
本发明改进有，所述的错配碱基位置为3’端倒数第1～8位；优先地倒数第1～3位；所述的错配碱基包括但不限于正向引物、反向引物、或者正反向引物，所述的引物3‘端根据检测模板分型的不同采用不同的碱基与其对应的分型匹配。
本发明改进有，所述报告反应体系用于指示检测基因的分型；所述的报告反应体系包含但不限于SYBGREEN荧光染料、探针法；所述的报告反应体系通过荧光信号的差异、退火温度的差异中的一种或多种实现。
本发明改进有，所述高效反应液包括但不限于盐反应液、保护剂及核酸聚合酶的一种或多种；盐反应液由KCl、Tris-HCl、NH4Cl中的一种或多种组成；保护剂由土温-20、BSA中的一种或多种组成，所述的核酸聚合酶包含DNA聚合酶、RNA逆转录酶中的一种或多种。
本发明改进有，KCl的浓度为25～1000mMol/L，Tris-HCl的浓度为10～500mMol/L，NH4Cl的浓度为0.5～50mMol/L，土温-20的浓度为：0.05～10％浓度；BSA的浓度为：0.1～20％浓度，DNA聚合酶包含：Ttaq DNA聚合酶、Platinum II Taq热启动DNA聚合酶、Glod360DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Ulltra PF DNA聚合酶、Super Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶；Pfu DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶。
本发明提供一种HPA基因分析高效高特异性的检测试剂盒，包括检测反应液、阴性质控品、阳性质控品及HPA检测引物盘；检测反应液为高效特异性的HPA检测反应试剂，阴性质控品为不含HPA基因而含管家基因的人工合成序列的细胞株，阳性质控品为含HPA所有基因型的人工合成序列的细胞株。
本发明改进有，HPA检测引物集分装在96孔升孔板；HPA检测试剂盒包含1人份/盒。16人份/盒，48人份/盒规格中的一种或多种。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒，具备以下有益效果：
实现了对HPA1～6,15,21多个位点基因的检测；实现了高效特异性检测HPA基因型的多态性；采用双系统的报告系统，极大提高检测灵敏度和特异性；高效高特异性的富集技术，实现了低起始量样本检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种高效高特异性检测HPA基因型的方法和试剂盒，以弥补目前市面上无HPA基因分析检测试剂盒的空白；
本发明提供一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，该检测方法首先由多组HPA引物组与检测模板退火；其次，在DNA聚合酶的作用实现模板退火延伸；再次、延伸产物结合荧光基团显色或荧光探针在DNA聚合酶外切酶活性下释放报告基团，最后，为了区分不同产物，通过熔解曲线或不同荧光探针标记实现对不同的HPA基因型进行检测；
进一步地，所述的检测方法通过引物的筛选性和扩增产物的特异性两种方式耦合实现对不同模板的检测；
进一步地。所述的扩增产物的特异性由两种方式，一种由特异性引物延伸扩增野生型模版，诱导特异性的探针报告基团水解形成成野生型的荧光信号，而突变型由所特异性的扩增，诱导产生突变型的荧光，实现两种不同模板的识别。另一种方式根据引物设计调整不同扩增产物大小，实现不同产物的Tm值不同，通过荧光信号在Tm条件下顺速也模板解离，荧光信号迅速衰减，因而通过不同Tm方式实现对不同模板的区分。
进一步地，上述检测方法主要包括：1、HPA高效高特异性引物组、2、报告反应体系；3高效反应液组成；
本发明提供的一种针对HPA基因分析检测的高特异性引物设计方法；引物由通用引物与错配碱基组成；
进一步地，所述通用引物为与HPA模板碱基互补配对的碱基组成；
进一步地，所述的通用引物由15～35个碱基组成；
进一步地，所述的通用引物的TM为55～80℃；
进一步地，所述的错配碱基的错配方式为：强错配，中等错配，弱错配；碱基组合方式为：CC、GG，中等错配为：AC、GT,弱等错配为：AA、TT；
进一步地，所述的错配碱基位置为3’端倒数第1～8位；优先地倒数第1～3位；
进一步地，所述的错配碱基包括但不限于正向引物、反向引物、或者正反向引物；
进一步地，所述的引物3‘端根据检测模板分型的不同采用不同的碱基与其对应的分型匹配；
本发明还提供利一种报告反应体系
进一步地，所述的报告反应体系主要用于指示检测基因的分型；
进一步地，所述的报告反应体系包含但不限于SYBGREEN荧光染料、探针法；
进一步地，所述的报告反应体系通过荧光信号的差异、退火温度的差异中的一种或多种实现；
本发明还提供了一种高效反应液，包含但不限于以下的一种或多种；盐反应液和保护剂、核酸聚合酶；
进一步地，盐反应液由KCl、Tris-HCl、NH4Cl中的一种或多种组成；
进一步地。KCl的浓度为25～1000mMol/L；
进一步地，Tris-HCl的浓度为10～500mMol/L；
进一步地。NH4Cl的浓度为0.5～50mMol/L；
进一步地，保护剂由土温-20、BSA中的一种或多种组成；
进一步地，土温-20的浓度为：0.05～10％(W/V)浓度；
进一步地，BSA的浓度为：0.1～20％浓度；
进一步地，所述的核酸聚合酶包含DNA聚合酶、RNA逆转录酶中的一种或多种；
进一步地，DNA聚合酶包含：Ttaq DNA聚合酶、Platinum II Taq热启动DNA聚合酶、Glod360 DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Ulltra PF DNA聚合酶、Super Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶；Pfu DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶；
进一步地，RNA逆转录酶包含MMLV、AMV中的一种或多种；
本发明还提供一种高效检测HPA基因型的检测程序；
进一步地，检测程序由预变性程序、检测循环体、熔解曲线中的2组或3组组成；
进一步地，检测循环体采用2步法梯度退火检测方法对模板进行扩增富集；
进一步地，所述2步法梯度退火程序由高Tm和低Tm两步退火形成，一方面保证适合高Tm模板优先扩增，同时也保证适合低Tm正常扩增；一方面提高了检测的特异性，另一方面保证了灵敏度
本发明还提供了一种检测试剂盒，试剂盒包括检测反应液、阴性质控品、阳性质控品、HPA检测引物盘；
进一步地，检测反应液为高效特异性的HPA检测反应试剂；
进一步地，阴性质控品为不含HPA基因而含管家基因的人工合成序列的细胞株；
进一步地，阳性质控品为含HPA所有基因型的人工合成序列的细胞株；
进一步地，HPA检测引物集分装在96孔升孔板；
进一步地，HPA检测试剂盒包含1人份/盒。16人份/盒，48人份/盒规格中的一种或多种；
进一步地，HPA检测试剂盒检测的基因型包括：HPA 1～6,15,21中的一种或多种；
本发明提供的检测试剂盒适用的检测机型包括：ABI7500(ABI)、LC480(Rocher)等；
本发明检测试剂盒用于检测的样本类型包括但不限于：全血样本、石蜡组织切片、新鲜组织、细胞悬浮液。
参照本发明中一种经典的实施方法，包括一下步骤：1)带检测样本进行核酸提取纯化或核酸释放；2)提取或释放后的核酸用于本发明反应体系检测；3)荧光染料_熔解曲线报告体系或荧光探针的检测体系配制；4)反应程序设定；5)检测结果判读与分析。
实施例一，一种HPA 1～6、15，21基因型检测试剂的反应液
引物设计
HPA 1a
ATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTAG
HPA_1a_F1:GTCTTACAGGCCCTGCCTCT
HPA_1a_F2:GTCTTACAGGCCCTGCCTGT
HPA_1a_F3:GTCTTACAGGCCCTGCCTTT
HPA_1a_F4:GTCTTACAGGCCCTGCCACT
HPA_1a_F5:GTCTTACAGGCCCTGCATCT
HPA_1a_R1:ACTCGATGGATTCTGGGGCA
HPA_1a_R2:GAGTGACCTGGGAGCTGTCT
ATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCCGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTAG
HPA_1b_F1:GTCTTACAGGCCCTGCCTCC
HPA_1b_F2:GTCTTACAGGCCCTGCCTGC
HPA_1b_F3:GTCTTACAGGCCCTGCCTTC
HPA_1b_F4:TCTTACAGGCCCTGCCACC
HPA_1b_F5:GTCTTACAGGCCCTGCATCC
HPA_1b_R1:ACTCGATGGATTCTGGGGCA
HPA_1b_R2:GAGTGACCTGGGAGCTGTCT
ATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGACGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCCTCCAAGAGAACTCGCTGTATACAATACCAAAGGGCTTTTTTGGGTCCCACCTCCTGCCTTTTGCTTTTCTCCACGGGAACC
HPA_2a_F1:CCTGGACGTCTCCTTCAACC
HPA_2a_F2:CCCTTGCTAGGGCAGACACT
HPA_2a_F3:CAGACACTGCCTGCTCTCAC
HPA_2a_R1:TCCAGCTTGGGTGTGGGCG
HPA_2a_R2:TCCAGCTTGGGTGTGGGTG
HPA_2a_R3:TCCAGCTTGGGTGTGGCCG
HPA_2a_R4:TCCAGCTTGGGTGTGAGCG
ATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGATGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCCTCCAAGAGAACTCGCTGTATACAATACCAAAGGGCTTTTTTGGGTCCCACCTCCTGCCTTTTGCTTTTCTCCACGGGAACC
HPA_2b_F1::CCTGGACGTCTCCTTCAACC
HPA_2b_F2:CCCTTGCTAGGGCAGACACT
HPA_2b_F3:TCCAGCTTGGGTGTGGGCA
HPA_2b_R1:TCCAGCTTGGGTGTGGGGA
HPA_2b_R2:TCCAGCTTGGGTGTGGGTA
HPA_2b_R3:TCCAGCTTGGGTGTGGTCA
HPA_2b_R4:TCCAGCTTGGGTGTGGCCA
CCTTCAGTGCTTCCCACAGCCTCCTGTCAACCCTCTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGACCTGGGAAGGCGGCCCCAGACCAACCACCGGGGCACCTCTGTGGGCTGGGGTTCGGGGGAGACCTGGGCCTGACCACTCCTTTGCCCCCCCAGGTGGACTGGGGGCTGCCCATCCCCAGCCCCTCCCCCATTCACCCGGCCCATCACAAGCGGGATCGCAGACAGATCTTCCTGCCAGAGCCCGAGCAGCCCTCGAGGCTTCAGGATCCAGTTCTCGTAGTGAGCAGGCTCTCTGGTCTCTGGCCCGGCCTCCCCGGGACCCACGGGGCAGAGG
HPA_3_F1:GACCTGGGCCTGACCACTC
HPA_3_F2:AAGAAAGACCTGGGAAGGCG
HPA_3_R1:AATGGGGGAGGGGCTGGGGA
HPA_3a_F1:TGGACTGGGGGCTGCCCAT
HPA_3a_F2:TGGACTGGGGGCTGCCAAT
HPA_3a_F3:TGGACTGGGGGCTGCCGAT
HPA_3a_F4:TGGACTGGGGGCTGCACAT
HPA_3a_F5:TGGACTGGGGGCTGCCTAT
HPA_3a_F6:TGGACTGGGGGCTGCTCAT
HPA_3a_R1:GCCAGAGACCAGAGAGCCTG
HPA_3a_R2:ATCTGTCTGCGATCCCGCTT
CCTTCAGTGCTTCCCACAGCCTCCTGTCAACCCTCTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGACCTGGGAAGGCGGCCCCAGACCAACCACCGGGGCACCTCTGTGGGCTGGGGTTCGGGGGAGACCTGGGCCTGACCACTCCTTTGCCCCCCCAGGTGGACTGGGGGCTGCCCAGCCCCAGCCCCTCCCCCATTCACCCGGCCCATCACAAGCGGGATCGCAGACAGATCTTCCTGCCAGAGCCCGAGCAGCCCTCGAGGCTTCAGGATCCAGTTCTCGTAGTGAGCAGGCTCTCTGGTCTCTGGCCCGGCCTCCCCGGGACCCACGGGGCAGAGG
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HPA_3b_F3:TGGACTGGGGGCTGCCTAG
HPA_3b_F4:TGGACTGGGGGCTGCCGAG
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HPA_3b_R2:ATCTGTCTGCGATCCCGCTT
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HPA_4a_F1:TGCGGCAGGTGGAGGATTAC
HPA_4a_F2:TCTCCATCCAAGTGCGGCAG
HPA_4a_F3:GCAGGTGGAGGATTACCCTG
HPA_4a_R1:GCAGGTTACTGGTGAGCTTTC
HPA_4a_R2:GCAGGTTACTGGTGAGCTTCC
HPA_4a_R3:GCAGGTTACTGGTGAGCTCTC
HPA_4a_R4:GCAGGTTACTGGTGAGCTGTC
GAAGAAGATAAAAACTAACATCTTTCTGCCTTCCAGATGATTCGAAGAATTTCTCCATCCAAGTGCGGCAGGTGGAGGATTACCCTGTGGACATCTACTACTTGATGGACCTGTCTTACTCCATGAAGGATGATCTGTGGAGCATCCAGAACCTGGGTACCAAGCTGGCCACCCAGATGCAAAAGCTCACCAGTAACCTGCGGATTGGCTTCGGGGCATTTGTGGACAAGCCTGTGTCACCATACATGTATATCTCCCCACCAGAGGCCCTCGAAAACCCCTGCTATGAGTAAGTCCCTCCTCCAGACGCCAGGACAGCATCCTTTGCCCCAGGAAGGTCCAAGTCCTGGTTCCTATTTC
HPA-4b_F1:TGCGGCAGGTGGAGGATTAC
HPA-4b_F2:TCTCCATCCAAGTGCGGCAG
HPA-4b_R1:GCAGGTTACTGGTGAGCTTTT
HPA-4b_R2:GCAGGTTACTGGTGAGCTTCT
HPA-4b_R3:GCAGGTTACTGGTGAGCTCTT
HPA-4b_R4:GCAGGTTACTGGTGAGCTATT
HPA-4b_R5:GCAGGTTACTGGTGAGCTGTT
AACATGTTTTATTACTCCAGATTGGCTCCTATTTTGGTAGTGTGCTGTGTTCAGTTGATGTGGATAAAGACACCATTACAGACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGTGACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAGAGGTAAAAAAAAAAAAATAAACTAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAACTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAATGATAATTTGCACAGATAGTATGGTTTACATTTCATCATTTTTGAGGATGTCCCCATTAAGTTATGATTTTAAAAATCACATTAACAGGAAAAACTAGAGTTGAAT
HPA-5a_F1:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAG
HPA-5a_F2:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAACG
HPA-5a_F3:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCACAG
HPA-5a_R1:ACCTCTCATGGAAAATGGCAGT
HPA-5a_R2:AAAATCATAACTTAATGGGGACATCCTC
HPA-5a_R3:GATGAAATGTAAACCATACTATCTGTGC
AACATGTTTTATTACTCCAGATTGGCTCCTATTTTGGTAGTGTGCTGTGTTCAGTTGATGTGGATAAAGACACCATTACAGACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGTGACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAAAGGTAAAAAAAAAAAAATAAACTAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAACTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAATGATAATTTGCACAGATAGTATGGTTTACATTTCATCATTTTTGAGGATGTCCCCATTAAGTTATGATTTTAAAAATCACATTAACAGGAAAAACTAGAGTTGAAT
HPA-5b_F1:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAA
HPA-5b_F2:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAGA
HPA-5b_F3:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCACAA
HPA-5b_R1:ACCTCTCATGGAAAATGGCAGT
HPA-5b_R2:AAAATCATAACTTAATGGGGACATCCTC
TAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCGGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGTGAGGAGAACTGCAGGGCCCCCTGTCCTGGAACCCACACCCCCTCATATACCTGC
HPA-6a_F1:GCAACAATGGCAATGGGACC
HPA-6a_F2:GAGTGTGGGGTATGCCGTTG
HPA-6a_R1:CAGACGGGCTGACCCTCCC
HPA-6a_R2:CAGACGGGCTGACCCTCAC
HPA-6a_R3:CAGACGGGCTGACCCTCGC
HPA-6a_R4:CAGACGGGCTGACCCTACC
TAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCA/C/TGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGTGAGGAGAACTGCAGGGCCCCCTGTCCTGGAACCCACACCCCCTCATATACCTGC
HPA-6b_F1:GCAACAATGGCAATGGGACC
HPA-6b_R1:CAGACGGGCTGACCCTCCT
HPA-6b_R2:CAGACGGGCTGACCCTCCG
HPA-6b_R3:CAGACGGGCTGACCCTCCD
HPA-6b_R4:CAGACGGGCTGACCCTCAD
HPA-6b_R5:CAGACGGGCTGACCCTCTD
HPA-6b_R6:CAGACGGGCTGACCCTACD
AAAATAATGTTTATTCTGAAGATGTAAATTTTGCAGGAAGATTTTATTAGAATATGGATCAATATGCAGTATTATGACCTTATGATGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGATTTACTGTTTTATACTTAAACCTTTTAAATGGTTTTAAATTCAGATATGTAAACAATAGGAAAAATTGAAATTCTTCCAAAAATAGTTTAGATTATTTTGGCTTATTTCAAAATGTATCAGTTCTTGGTTTTGTGATGTTTATATTTATTATCTTGACTTCAGTTACAGGATTTACCAAGAATTTGAAGTAACTGTACCTGATTCTATCACTTCTTGGGTGGCTACTGGTTTTGTGATCTCTGAGGACCTGGGTCTTGGACTAACAACTACTCCAGTGGAGGTATTGTATTAAAGAGCTGCTTATCAGTATTACGGTGACATTAAGCTAATACAGCGTCAGCTCCTCAATTTTTTTTTTAAATGACTGCTTATAATGTTTATCACAGTTTAGAGATTCCTTGGCTTTGTC
HPA-15_F1:TGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGA
HPA-15b_R1:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTGT
HPA-15b_R2:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTAT
HPA-15b_R3:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCCGT
AAAATAATGTTTATTCTGAAGATGTAAATTTTGCAGGAAGATTTTATTAGAATATGGATCAATATGCAGTATTATGACCTTATGATGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGATTTACTGTTTTATACTTAAACCTTTTAAATGGTTTTAAATTCAGATATGTAAACAATAGGAAAAATTGAAATTCTTCCAAAAATAGTTTAGATTATTTTGGCTTATTTCAAAATGTATCAGTTCTTGGTTTTGTGATGTTTATATTTATTATCTTGACTTCAGTTCCAGGATTTACCAAGAATTTGAAGTAACTGTACCTGATTCTATCACTTCTTGGGTGGCTACTGGTTTTGTGATCTCTGAGGACCTGGGTCTTGGACTAACAACTACTCCAGTGGAGGTATTGTATTAAAGAGCTGCTTATCAGTATTACGGTGACATTAAGCTAATACAGCGTCAGCTCCTCAATTTTTTTTTTAAATGACTGCTTATAATGTTTATCACAGTTTAGAGATTCCTTGGCTTTGTC
HPA-15b_F1:TGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGA
HPA-15b_R1:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTGG
HPA-15b_R2:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCCGG
HPA-15b_R3:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCGTGG
GCGCGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTCTGAATGCATGGAGATCAGAGCTGGACTGGGATACGCTTAGGCTTGCTCCTTCTTTGCCTTAATCACTGTGTCCTCTCTCCTTCAGAGAATGTGTGGAGTGTAAGAAGTTTGACCGGGGAGCCCTACATGACGAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAGTAAGTTCAGCACATCTTAGAGTTGCACACACCCAGGTTCTAAATGTTTCTAATTCAATCCCAGAACCTATCCAACTCCCACCTGTAAAATGGAAGCGTGACTTCTACCTCAGGGAAT
HPA-21a_F1:CGGGGAGCCCTACATGACG
HPA-21a_F2:CGGGGAGCCCTACATGAAG
HPA-21a_F3:GGGGAGCCCTACATGATG
HPA-21a_F4:CGGGGAGCCCTACATGTCG
HPA-21a_R1:ACAGGTGGGAGTTGGATAGG
HPA-21a_R2:CCTGGGTGTGTGCAACTCTA
GCGCGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTCTGAATGCATGGAGATCAGAGCTGGACTGGGATACGCTTAGGCTTGCTCCTTCTTTGCCTTAATCACTGTGTCCTCTCTCCTTCAGAGAATGTGTGGAGTGTAAGAAGTTTGACCGGGGAGCCCTACATGACAAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAGTAAGTTCAGCACATCTTAGAGTTGCACACACCCAGGTTCTAAATGTTTCTAATTCAATCCCAGAACCTATCCAACTCCCACCTGTAAAATGGAAGCGTGACTTCTACCTCAGGGAAT
HPA-21b_F1:CGGGGAGCCCTACATGACA
HPA-21b_F2:CGGGGAGCCCTACATGAGA
HPA-21b_F3:CGGGGAGCCCTACATGATA
HPA-21b_F4:CGGGGAGCCCTACATGTCA
HPA-21b_R1:ACAGGTGGGAGTTGGATAGG
IC945
CCTGTCCCATGAAGGTGTTGTAAAGATTAAAAAAGGCAAATTAGGCTGTGTATTTGTCATAATAATTGGCATATATGGTAAGTGACCAACAACCATAAGGTATTATAAAATTGTTATAAAATGATATGAGCTATCATTGAGCAGCATGAAAGAAGAGCTTCACTGTTTCACCTACTATCACCATGGCCCATTAATCTCTTTCCTGTTCCTGACATTTCAGAGATACGTTTAGGATTTCAATCATGACCTTAAGCCACATTTGAACAATTTTCTGGTGGATAAGTCCTCATTCCCACATTATGTATGTACCTAGATGCAAATCCTGAATATCATGTCGCAATTAGTGCATCTGGACATGCTTGCTAACTGTGTTAAAGCTCTGAATAATGGTAAAGTTTTATTTCTACCAAAACAAATTTGGGCCGTAATGTTTTATGATAAAAATCTGTGGTCTTCCTATGTACATGTGTGTGTACATGCTTAAAATGCAATGTTATAGTTAAATGTAATTCATTAAAAGTATGTAACTCCAGTGGCTACTTAGTTTGGCTACTTGGTTTGTAGATTTCTGCTTTCCTGTTTCATTGTTAAACAGGTCTAGAAGTTATTATTTCATGAAACTAATGTGAGGAAAAAGACTATGTTGATATATAAGTGACATTATATAAATACATGAGGGATGATTTGATTAGAAGCAGTATTACACAGTGATAGGAGTAATGGTTTAGAACTAGACTCAGGTTTGAATCTTAGCTCTATCATTATAGGCATTTACTTAACTTTTCTTGTTTGCTTAACTGAAAACTGAAGATAATAACACCTATTTACATGGTTGTTATAAGGGTTATATGAATAATGTCTGGCAAATAGTAAGAACTCAAGTAACTGTTTCACTCTTTCCAGAAGGAGATTGGCTGAAAAATATTTGGAGTCTCCTCCAGCCA
GP89
TGGTCTACCAGGCATCTTACTGTACAGGCTCTCCTTCTAGCTACAACTCCATGAATAGGCCTTCTTGATATCTCAATTTCTCTTTTCTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTCTAGCTATGTTGCCTAGGCTGGTCTTGAACTCTTGGCCTCAAGCAGTCCTCATGCCTTGGCCTCCCAAAGTATCAATTTCCCCTTTCTGTACAACGGTCCTAAGGGATTATCCCAGGAAAGACCACAACAATTTGTTTATGCTCCAATGTACGGGGTAAACTCTTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCCGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTAGGGCTGGGACTCTTTGCGGGGAGAGACCTGAAGCAGGTGGGCATAGAGCACAAGGTGGAGGTCTGAGGAGGAAGTCTTGGGGAAGTAGCTCAGAATGGAAATGGGTGGGAAGACAAGGATGAGGGGGGAGGTGTGGGCAAGAGAATGAGAACCTCCTGTACACCTTCTCCCTGGCAACCCTGATGCCTTACACTCGCCTCACTCAGCTGAACCTAGATAGGTGCGAGCTCACCAAGCTCCAGGTCGATGGGACGCTGCCAGTGCTGGGGACCCTGGATCTATCCCACAATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGATGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGC
GP10
GATTCGAAGAATTTCTCCATCCAAGTCCCTGTGTTAGGTGGAGGATTACCCTGTGGACATCTACTACTTGATGGACCTGTCTTACTCCATGAAGGATGATCTGTGGAGCATCCAGAACCTGGGTACCAAGCTGGCCACCCAGATGCAAAAGCTCACCAGTAACCTGCGGATTGGCTTCGGGGCATTTGTGGACAAGCCTGTGTCACCATACATGTATATCTCCCCACCAGAGGCCCTCGAAAACCCCTGCTATGAGTAAGTCCCTCCTCCAGACGCCAGGACAGCA
GP11
ACAGCCTGATCGTCCAGGTCACCTTTGATTGTGACTGTGCCTGCCAGGCCCAAGCTGAACCTAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCAGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGTGAGGAGAACTGCAGGGCCCCCTGTCCTGGAACCCACACCCCCTCATATACCTGCAACCACTGGAAACATAGGTGAAGGCCTGAGATGGGTTTTGC
GP12
CGGGGAGCCCTACATGACAAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAGTAAGTTCAGCACATCTTAGAGTTGCACACACCCAGGTTCTAAATGTTTCTAATTCAATCCCAGAACCTATCCAACTCCCACCTGTAAAATGGAAGCGTGACTTCTACCTCAGGGAATGTTGTGCAGGCTTGAGGAACAATGGACACTTGATGTGAGCTGGTGTCTCTGAGAGTTGTCCTCCTCTCTTACTAGTGTGTGCAGCCATCCACCACTTCTGCTTCCCAGAGCCCACAGACTCAGCAAGAGCCTGCAAAGCAAAGGGAGCAAGTGCCTCCCTAAGGAAGGGAAGAGAATGTATCCCATTTTACAGATGAAAAAACTGAGGCACAGAGCTGGGAAGTGGTTGCCTG
1.2实验步骤
1.2.1标准品制备
标准品细胞株基因组DNA(IHW09014I、IHW09035、IHW09045、IHW09048、IHW09053、IHW09266、IHW09367、IHW09407)购置于IHWG(国际组织相容性工作组)，IC945、GP89、GP10、GP11、GP12委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；采用相应的稀释液配制成相应工作液，细胞株基因组DNA、质粒配制成10ng/μl；
Figure BDA0003093008730000201
Figure BDA0003093008730000211
1.2.2不同反应液体系的配制
按照下表，配制相应的高效PCR反应液
Figure BDA0003093008730000212
Figure BDA0003093008730000221
1.2.3配制PCR反应体系
按照下表，配制相应的PCR反应体系
Figure BDA0003093008730000222
1.2.4设置反应程序
按照以下步骤设置反应程序，反应程序如下：
Figure BDA0003093008730000223
Figure BDA0003093008730000231
检测模式：
Figure BDA0003093008730000232
1.2.5结果分析与讨论
通过上述结果分析，NC内参正常出现熔解曲线峰的只有PCR反应液3，并且靶标基因型通过IHWG0935检测的分型的熔解曲线峰也正常，因此优选PCR反应液3.
实施例二，一种HPA 1～6、15，21基因型检测试剂的反应液引物设计
HPA 1a
ATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTAG
HPA_1a_F1:GTCTTACAGGCCCTGCCTCT
HPA_1a_F2:GTCTTACAGGCCCTGCCTGT
HPA_1a_F3:GTCTTACAGGCCCTGCCTTT
HPA_1a_F4:GTCTTACAGGCCCTGCCACT
HPA_1a_F5:GTCTTACAGGCCCTGCATCT
HPA_1a_R1:ACTCGATGGATTCTGGGGCA
HPA_1a_R2:GAGTGACCTGGGAGCTGTCT
HPA 1b
ATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCCGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTAG
HPA_1b_F1:GTCTTACAGGCCCTGCCTCC
HPA_1b_F2:GTCTTACAGGCCCTGCCTGC
HPA_1b_F3:GTCTTACAGGCCCTGCCTTC
HPA_1b_F4:TCTTACAGGCCCTGCCACC
HPA_1b_F5:GTCTTACAGGCCCTGCATCC
HPA_1b_R1:ACTCGATGGATTCTGGGGCA
HPA_1b_R2:GAGTGACCTGGGAGCTGTCT
ATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGACGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCCTCCAAGAGAACTCGCTGTATACAATACCAAAGGGCTTTTTTGGGTCCCACCTCCTGCCTTTTGCTTTTCTCCACGGGAACC
HPA_2a_F1:CCTGGACGTCTCCTTCAACC
HPA_2a_F2:CCCTTGCTAGGGCAGACACT
HPA_2a_F3:CAGACACTGCCTGCTCTCAC
HPA_2a_R1:TCCAGCTTGGGTGTGGGCG
HPA_2a_R2:TCCAGCTTGGGTGTGGGTG
HPA_2a_R3:TCCAGCTTGGGTGTGGCCG
HPA_2a_R4:TCCAGCTTGGGTGTGAGCG
ATCAGCTGCAAAGCCTGCCCTTGCTAGGGCAGACACTGCCTGCTCTCACCGTCCTGGACGTCTCCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGATGCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCCTCCAAGAGAACTCGCTGTATACAATACCAAAGGGCTTTTTTGGGTCCCACCTCCTGCCTTTTGCTTTTCTCCACGGGAACC
HPA_2b_F1::CCTGGACGTCTCCTTCAACC
HPA_2b_F2:CCCTTGCTAGGGCAGACACT
HPA_2b_F3:TCCAGCTTGGGTGTGGGCA
HPA_2b_R1:TCCAGCTTGGGTGTGGGGA
HPA_2b_R2:TCCAGCTTGGGTGTGGGTA
HPA_2b_R3:TCCAGCTTGGGTGTGGTCA
HPA_2b_R4:TCCAGCTTGGGTGTGGCCA
CCTTCAGTGCTTCCCACAGCCTCCTGTCAACCCTCTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGACCTGGGAAGGCGGCCCCAGACCAACCACCGGGGCACCTCTGTGGGCTGGGGTTCGGGGGAGACCTGGGCCTGACCACTCCTTTGCCCCCCCAGGTGGACTGGGGGCTGCCCATCCCCAGCCCCTCCCCCATTCACCCGGCCCATCACAAGCGGGATCGCAGACAGATCTTCCTGCCAGAGCCCGAGCAGCCCTCGAGGCTTCAGGATCCAGTTCTCGTAGTGAGCAGGCTCTCTGGTCTCTGGCCCGGCCTCCCCGGGACCCACGGGGCAGAGG
HPA_3_F1:GACCTGGGCCTGACCACTC
HPA_3_F2:AAGAAAGACCTGGGAAGGCG
HPA_3_R1:AATGGGGGAGGGGCTGGGGA
HPA_3a_F1:TGGACTGGGGGCTGCCCAT
HPA_3a_F2:TGGACTGGGGGCTGCCAAT
HPA_3a_F3:TGGACTGGGGGCTGCCGAT
HPA_3a_F4:TGGACTGGGGGCTGCACAT
HPA_3a_F5:TGGACTGGGGGCTGCCTAT
HPA_3a_F6:TGGACTGGGGGCTGCTCAT
HPA_3a_R1:GCCAGAGACCAGAGAGCCTG
HPA_3a_R2:ATCTGTCTGCGATCCCGCTT
CCTTCAGTGCTTCCCACAGCCTCCTGTCAACCCTCTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGACCTGGGAAGGCGGCCCCAGACCAACCACCGGGGCACCTCTGTGGGCTGGGGTTCGGGGGAGACCTGGGCCTGACCACTCCTTTGCCCCCCCAGGTGGACTGGGGGCTGCCCAGCCCCAGCCCCTCCCCCATTCACCCGGCCCATCACAAGCGGGATCGCAGACAGATCTTCCTGCCAGAGCCCGAGCAGCCCTCGAGGCTTCAGGATCCAGTTCTCGTAGTGAGCAGGCTCTCTGGTCTCTGGCCCGGCCTCCCCGGGACCCACGGGGCAGAGG
HPA_3b_F1:TGGACTGGGGGCTGCCCAG
HPA_3b_F2:TGGACTGGGGGCTGCCCTG
HPA_3b_F3:TGGACTGGGGGCTGCCTAG
HPA_3b_F4:TGGACTGGGGGCTGCCGAG
HPA_3b_R1:GCCAGAGACCAGAGAGCCTG
HPA_3b_R2:ATCTGTCTGCGATCCCGCTT
GAAGAAGATAAAAACTAACATCTTTCTGCCTTCCAGATGATTCGAAGAATTTCTCCATCCAAGTGCGGCAGGTGGAGGATTACCCTGTGGACATCTACTACTTGATGGACCTGTCTTACTCCATGAAGGATGATCTGTGGAGCATCCAGAACCTGGGTACCAAGCTGGCCACCCAGATGCGAAAGCTCACCAGTAACCTGCGGATTGGCTTCGGGGCATTTGTGGACAAGCCTGTGTCACCATACATGTATATCTCCCCACCAGAGGCCCTCGAAAACCCCTGCTATGAGTAAGTCCCTCCTCCAGACGCCAGGACAGCATCCTTTGCCCCAGGAAGGTCCAAGTCCTGGTTCCTATTTC
HPA_4a_F1:TGCGGCAGGTGGAGGATTAC
HPA_4a_F2:TCTCCATCCAAGTGCGGCAG
HPA_4a_F3:GCAGGTGGAGGATTACCCTG
HPA_4a_R1:GCAGGTTACTGGTGAGCTTTC
HPA_4a_R2:GCAGGTTACTGGTGAGCTTCC
HPA_4a_R3:GCAGGTTACTGGTGAGCTCTC
HPA_4a_R4:GCAGGTTACTGGTGAGCTGTC
GAAGAAGATAAAAACTAACATCTTTCTGCCTTCCAGATGATTCGAAGAATTTCTCCATCCAAGTGCGGCAGGTGGAGGATTACCCTGTGGACATCTACTACTTGATGGACCTGTCTTACTCCATGAAGGATGATCTGTGGAGCATCCAGAACCTGGGTACCAAGCTGGCCACCCAGATGCAAAAGCTCACCAGTAACCTGCGGATTGGCTTCGGGGCATTTGTGGACAAGCCTGTGTCACCATACATGTATATCTCCCCACCAGAGGCCCTCGAAAACCCCTGCTATGAGTAAGTCCCTCCTCCAGACGCCAGGACAGCATCCTTTGCCCCAGGAAGGTCCAAGTCCTGGTTCCTATTTC
HPA-4b_F1:TGCGGCAGGTGGAGGATTAC
HPA-4b_F2:TCTCCATCCAAGTGCGGCAG
HPA-4b_R1:GCAGGTTACTGGTGAGCTTTT
HPA-4b_R2:GCAGGTTACTGGTGAGCTTCT
HPA-4b_R3:GCAGGTTACTGGTGAGCTCTT
HPA-4b_R4:GCAGGTTACTGGTGAGCTATT
HPA-4b_R5:GCAGGTTACTGGTGAGCTGTT
AACATGTTTTATTACTCCAGATTGGCTCCTATTTTGGTAGTGTGCTGTGTTCAGTTGATGTGGATAAAGACACCATTACAGACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGTGACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAGAGGTAAAAAAAAAAAAATAAACTAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAACTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAATGATAATTTGCACAGATAGTATGGTTTACATTTCATCATTTTTGAGGATGTCCCCATTAAGTTATGATTTTAAAAATCACATTAACAGGAAAAACTAGAGTTGAAT
HPA-5a_F1:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAG
HPA-5a_F2:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAACG
HPA-5a_F3:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCACAG
HPA-5a_R1:ACCTCTCATGGAAAATGGCAGT
HPA-5a_R2:AAAATCATAACTTAATGGGGACATCCTC
HPA-5a_R3:GATGAAATGTAAACCATACTATCTGTGC
AACATGTTTTATTACTCCAGATTGGCTCCTATTTTGGTAGTGTGCTGTGTTCAGTTGATGTGGATAAGACACCATTACAGACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGTGACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAAAGGTAAAAAAAAAAAAATAAACTAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAACTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAATGATAATTTGCACAGATAGTATGGTTTACATTTCATCATTTTTGAGGATGTCCCCATTAAGTTATGATTTTAAAAATCACATTAACAGGAAAAACTAGAGTTGAAT
HPA-5b_F1:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAAA
HPA-5b_F2:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAGA
HPA-5b_F3:GGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCACAA
HPA-5b_R1:ACCTCTCATGGAAAATGGCAGT
HPA-5b_R2:AAAATCATAACTTAATGGGGACATCCTC
TAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCGGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGTGAGGAGAACTGCAGGGCCCCCTGTCCTGGAACCCACACCCCCTCATATACCTGC
HPA-6a_F1:GCAACAATGGCAATGGGACC
HPA-6a_F2:GAGTGTGGGGTATGCCGTTG
HPA-6a_R1:CAGACGGGCTGACCCTCCC
HPA-6a_R2:CAGACGGGCTGACCCTCAC
HPA-6a_R3:CAGACGGGCTGACCCTCGC
HPA-6a_R4:CAGACGGGCTGACCCTACC
TAATAGCCATCGCTGCAACAATGGCAATGGGACCTTTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCA/C/TGGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGCGAGTGTGACGACTTCTCCTGTGTCCGCTACAAGGGGGAGATGTGCTCAGGTGAGGAGAACTGCAGGGCCCCCTGTCCTGGAACCCACACCCCCTCATATACCTGC
HPA-6b_F1:GCAACAATGGCAATGGGACC
HPA-6b_R1:CAGACGGGCTGACCCTCCT
HPA-6b_R2:CAGACGGGCTGACCCTCCG
HPA-6b_R3:CAGACGGGCTGACCCTCCD
HPA-6b_R4:CAGACGGGCTGACCCTCAD
HPA-6b_R5:CAGACGGGCTGACCCTCTD
HPA-6b_R6:CAGACGGGCTGACCCTACD
AAAATAATGTTTATTCTGAAGATGTAAATTTTGCAGGAAGATTTTATTAGAATATGGATCAATATGCAGTATTATGACCTTATGATGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGATTTACTGTTTTATACTTAAACCTTTTAAATGGTTTTAAATTCAGATATGTAAACAATAGGAAAAATTGAAATTCTTCCAAAAATAGTTTAGATTATTTTGGCTTATTTCAAAATGTATCAGTTCTTGGTTTTGTGATGTTTATATTTATTATCTTGACTTCAGTTACAGGATTTACCAAGAATTTGAAGTAACTGTACCTGATTCTATCACTTCTTGGGTGGCTACTGGTTTTGTGATCTCTGAGGACCTGGGTCTTGGACTAACAACTACTCCAGTGGAGGTATTGTATTAAAGAGCTGCTTATCAGTATTACGGTGACATTAAGCTAATACAGCGTCAGCTCCTCAATTTTTTTTTTAAATGACTGCTTATAATGTTTATCACAGTTTAGAGATTCCTTGGCTTTGTC
HPA-15_F1:TGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGA
HPA-15b_R1:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTGT
HPA-15b_R2:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTAT
HPA-15b_R3:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCCGT
AAAATAATGTTTATTCTGAAGATGTAAATTTTGCAGGAAGATTTTATTAGAATATGGATCAATATGCAGTATTATGACCTTATGATGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGATTTACTGTTTTATACTTAAACCTTTTAAATGGTTTTAAATTCAGATATGTAAACAATAGGAAAAATTGAAATTCTTCCAAAAATAGTTTAGATTATTTTGGCTTATTTCAAAATGTATCAGTTCTTGGTTTTGTGATGTTTATATTTATTATCTTGACTTCAGTTCCAGGATTTACCAAGAATTTGAAGTAACTGTACCTGATTCTATCACTTCTTGGGTGGCTACTGGTTTTGTGATCTCTGAGGACCTGGGTCTTGGACTAACAACTACTCCAGTGGAGGTATTGTATTAAAGAGCTGCTTATCAGTATTACGGTGACATTAAGCTAATACAGCGTCAGCTCCTCAATTTTTTTTTTAAATGACTGCTTATAATGTTTATCACAGTTTAGAGATTCCTTGGCTTTGTC
HPA-15b_F1:TGACCTATTCTTTGAAAAGTTGGGA
HPA-15b_R1:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCTGG
HPA-15b_R2:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCCCGG
HPA-15b_R3:GTTACTTCAAATTCTTGGTAAATCGTGG
GCGCGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTCTGAATGCATGGAGATCAGAGCTGGACTGGGATACGCTTAGGCTTGCTCCTTCTTTGCCTTAATCACTGTGTCCTCTCTCCTTCAGAGAATGTGTGGAGTGTAAGAAGTTTGACCGGGGAGCCCTACATGACGAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAGTAAGTTCAGCACATCTTAGAGTTGCACACACCCAGGTTCTAAATGTTTCTAATTCAATCCCAGAACCTATCCAACTCCCACCTGTAAAATGGAAGCGTGACTTCTACCTCAGGGAAT
HPA-21a_F1:CGGGGAGCCCTACATGACG
HPA-21a_F2:CGGGGAGCCCTACATGAAG
HPA-21a_F3:GGGGAGCCCTACATGATG
HPA-21a_F4:CGGGGAGCCCTACATGTCG
HPA-21a_R1:ACAGGTGGGAGTTGGATAGG
HPA-21a_R2:CCTGGGTGTGTGCAACTCTA
GCGCGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTAATGGAGGTGGAGCAGCTTTCTGAATGCATGGAGATCAGAGCTGGACTGGGATACGCTTAGGCTTGCTCCTTCTTTGCCTTAATCACTGTGTCCTCTCTCCTTCAGAGAATGTGTGGAGTGTAAGAAGTTTGACCGGGGAGCCCTACATGACAAAAATACCTGCAACCGTTACTGCCGTGACGAGATTGAGTCAGTGAAAGAGCTTAGTAAGTTCAGCACATCTTAGAGTTGCACACACCCAGGTTCTAAATGTTTCTAATTCAATCCCAGAACCTATCCAACTCCCACCTGTAAAATGGAAGCGTGACTTCTACCTCAGGGAAT
HPA-21b_F1:CGGGGAGCCCTACATGACA
HPA-21b_F2:CGGGGAGCCCTACATGAGA
HPA-21b_F3:CGGGGAGCCCTACATGATA
HPA-21b_F4:CGGGGAGCCCTACATGTCA
HPA-21b_R1:ACAGGTGGGAGTTGGATAGG
1.2实验步骤
1.2.1标准品制备
标准品细胞株基因组DNA(IHW09035购置于IHWG(国际组织相容性工作组)，采用相应的稀释液配制成相应工作液，细胞株基因组DNA、质粒配制成10ng/μl；
1.2.2PCR反应液配制
按照下列引物配制反应体系
Figure BDA0003093008730000321
Figure BDA0003093008730000331
1.2.3配制PCR反应体系
按照下表，配制相应的PCR反应体系
Figure BDA0003093008730000332
Figure BDA0003093008730000341
1.2.4 PCR反应程序
1.2.5设置反应程序(同上)
1.2.6结果讨论与分析
根据上述结果分析发现，最佳的引物组合方式为：HPA_1a_R1/F4、HPA_2a_F2/R3、HPA_3a_R2/F4、HPA_4a_F2/R3、HPA_6a_F1/R3、HPA_21a_R1/F3、HPA_5a_R2/F2。
实施例三一种HPA 1～6,21检测结果一致性分析
3.1、标准品制备
3.2.1标准品制备
标准品细胞株基因组DNA(IHW09014I、IHW09035、IHW09045、IHW09048、IHW09053、IHW09266、IHW09367、IHW09407)购置于IHWG(国际组织相容性工作组)，IC945、GP89、GP10、GP11、GP12委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；采用相应的稀释液配制成相应工作液，细胞株基因组DNA、质粒配制成10ng/μl；
Figure BDA0003093008730000342
Figure BDA0003093008730000351
3.2.3反应体系的配制
参照实施例1和实施例2中最优方案进行反应体系的配制；
3.2.4反应程序的设置
参照实施例1进行反应程序的设置
3.2.5实验结果
通过将检测结果与标准品进行对比，一致性100％，具体参照如下表：
Figure BDA0003093008730000352
Figure BDA0003093008730000361
3.2.6结果讨论与分析
根据上述结果，表明试剂盒的特异性和准确性较好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、多组HPA引物组与检测模板退火；
步骤2、在DNA聚合酶的作用实现模板退火延伸；
步骤3、延伸产物结合荧光基团显色或荧光探针在DNA聚合酶外切酶活性下释放报告基团；
步骤4、通过熔解曲线或不同荧光探针标记实现对不同的HPA基因型进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述步骤4中的检测为：通过引物的筛选性和扩增产物的特异性两种方式耦合实现对不同模板的检测，检测方法包括HPA高效高特异性引物组、报告反应体系及高效反应液。
3.根据权利要求2所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述扩增产物的特异性由两种方式，一种由特异性引物延伸扩增野生型模版，诱导特异性的探针报告基团水解形成成野生型的荧光信号，而突变型由所特异性的扩增，诱导产生突变型的荧光，实现两种不同模板的识别。另一种方式根据引物设计调整不同扩增产物大小，实现不同产物的Tm值不同，通过荧光信号在Tm条件下顺速也模板解离，荧光信号迅速衰减，因而通过不同Tm方式实现对不同模板的区分。
4.根据权利要求3所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述HPA高效高特异性引物组由通用引物与错配碱基组成，所述通用引物为与HPA模板碱基互补配对的碱基组成，所述的错配碱基的错配方式为：强错配，中等错配，弱错配；碱基组合方式为：CC、GG，中等错配为：AC、GT,弱等错配为：AA、TT。
5.根据权利要求4所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述通用引物由15～35个碱基组成；所述的通用引物的TM为55～80℃。
6.根据权利要求5所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述的错配碱基位置为3’端倒数第1～8位；优先地倒数第1～3位；所述的错配碱基包括但不限于正向引物、反向引物、或者正反向引物，所述的引物3‘端根据检测模板分型的不同采用不同的碱基与其对应的分型匹配。
7.根据权利要求6所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述报告反应体系用于指示检测基因的分型；所述的报告反应体系包含但不限于SYBGREEN荧光染料、探针法；所述的报告反应体系通过荧光信号的差异、退火温度的差异中的一种或多种实现。
8.根据权利要求7所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，所述高效反应液包括但不限于盐反应液、保护剂及核酸聚合酶的一种或多种；盐反应液由KCl、Tris-HCl、NH4Cl中的一种或多种组成；保护剂由土温-20、BSA中的一种或多种组成，所述的核酸聚合酶包含DNA聚合酶、RNA逆转录酶中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的一种HPA基因分析高效高特异性进行检测方法，其特征在于，KCl的浓度为25～1000mMol/L，Tris-HCl的浓度为10～500mMol/L，NH4Cl的浓度为0.5～50mMol/L，土温-20的浓度为：0.05～10％浓度；BSA的浓度为：0.1～20％浓度，DNA聚合酶包含：Ttaq DNA聚合酶、Platinum II Taq热启动DNA聚合酶、Glod360 DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Ulltra PF DNA聚合酶、Super Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶；Pfu DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶。
10.一种HPA基因分析高效高特异性的检测试剂盒，其特征在于，包括检测反应液、阴性质控品、阳性质控品及HPA检测引物盘；检测反应液为高效特异性的HPA检测反应试剂，阴性质控品为不含HPA基因而含管家基因的人工合成序列的细胞株，阳性质控品为含HPA所有基因型的人工合成序列的细胞株。
11.根据权利要求10所述的一种HPA基因分析高效高特异性的检测试剂盒，其特征在于，HPA检测引物集分装在96孔升孔板；HPA检测试剂盒包含1人份/盒。16人份/盒，48人份/盒规格中的一种或多种。
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