CN106222295A - 人血小板血型的多重pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

人血小板血型的多重pcr检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人血小板血型的多重PCR检测方法及试剂盒，所述试剂盒包含序列如SEQ ID NO:1‑23所示的引物，并记载有适当的PCR反应体系及反应条件，可用于对血小板血型抗原HPA1‑6、HPA15进行基因分型。本发明的人血小板血型的多重PCR检测方法及试剂盒分型结果可靠，灵敏度高，特异性好，可进行多重PCR，通量大，操作简便快速，效率高，成本低，在同种免疫性血小板减少症的诊断、配合性血小板供者库的建立以及人群HPA基因频率的普查中具有广阔的应用前景。

Description

人血小板血型的多重PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种人血小板血型的多重PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
人类血小板表面分布有多种血小板抗原(HPA)，构成了血小板的血型系统。迄今已经用血清学方法鉴定出35个血小板血型抗原，由于这些HPA等位基因之间的SNP变化，导致形成不同的可被同种免疫识别的抗原表位，血小板同种免疫可产生相应的血小板抗体。其中，针对HPA1-6和HPA15抗原产生的相应抗体是造成临床相关血小板同种免疫的主要原因，可引发血小板血型抗原免疫相关的临床病症，例如新生儿同种免疫型血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜(PTP)及血小板输注无效等。因此，对血小板抗原进行基因分型以用于预防血小板血型抗原免疫相关的临床病况是十分必要的。
由于HPA1-6和HPA15抗原系统的等位基因之间都只有单个碱基的差异，因此可以使用SSP(引物特异性)PCR进行分辨。但由于PCR条件设定对PCR结果影响很大，而SSP引物上3’端一个碱基的差异难免出现非特异性错配，故需要探索建立稳定的PCR条件(包括引物配制、温度条件、PCR聚合酶选择等)，以取得可靠、灵敏的HPA基因分型结果，促进临床血小板同型输注，降低输血风险。
另外，HPA基因分型可以高通量的方式进行，用于确定不同人群中的HPA的基因频率，进而推断出这些人群中基因分布和遗传构成，还可预测不同人群中HPA同种免疫风险发生率。鉴于此，有必要提高HPA基因分型的效率，简化操作并降低检测成本。
而目前关于分型结果准确可靠、灵敏度高、特异型好，同时通量大、成本低、效率高的HPA基因分型方法及相关试剂盒还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人类血小板血型抗原基因分型引物组合。
本发明的再一的目的是，提供一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒。
本发明的另一的目的是，提供所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合以及人类血小板血型抗原基因分型试剂盒的用途。
本发明的第四个目的是，提供一种非诊断和治疗目的的人类血小板血型抗原基因分型方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种人类血小板血型抗原基因分型引物组合，包含序列如SEQ ID NO:1-23所示的引物。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，包含如上所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合。
优选地，所述的试剂盒包含引物预混液，所述的引物预混液如下表所示：
优选地，所述的引物预混液中各条引物的浓度比例如下表所示：
优选地，还包含操作说明书，所述的操作说明书记载了以下内容：进行HPA基因分型时采取多重PCR。
优选地，所述的操作说明书还记载了以下内容：PCR反应体系为：每个PCR孔中加入5μL的2×引物预混液、5μL的2×Taq酶反应预混液，及0.5μL浓度为5-200ng/μL的DNA模板，用石蜡油覆盖，所述的Taq酶反应预混液包括0.5U的Taq酶、PCR反应缓冲液及琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
优选地，所述的操作说明书还记载了以下内容：PCR反应程序为：1个循环96℃60sec，5个循环96℃25sec，72℃45sec，72℃30sec，28个循环96℃25sec，68℃45sec，72℃30sec，1个循环72℃7min。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合或如上任一所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒在血小板供者库的建立或人群HPA基因频率普查中的应用。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种非诊断和治疗目的的人类血小板血型抗原基因分型方法，所述的方法使用了如上所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合或如上任一所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明构建了一种人类血小板抗原基因分型试剂盒，使用特异的SSP-PCR引物并建立适当的PCR反应体系及反应条件，对血小板血型抗原HPA1-6、HPA15进行基因分型。本发明试剂盒具备以下优点：
1、分型结果更可靠；
2、灵敏度高，其定型所需的DNA量低至市售同类产品的1/3，这对于血液中DNA含量低的血液病患者的基因定型很有利；
3、能最大程度地减少内参和特异性引物之间对基因组DNA模板的竞争，并最大限度地降低特异性引物产生的错配几率，特异性好，判读更清晰；
4、可进行多重PCR，一管中同时进行2个基因的分型，而目前并无效果好的市售多重PCR试剂盒；
5、通量大，操作简便快速，效率高，成本低。
基于上述优点，本发明的试剂盒可用于对患者及其直系亲属进行HPA基因分型，辅助抗体测试以诊断同种免疫性血小板减少症；可用于献血者HPA分型，建立血小板供者库，提供配合性血小板用于临床输注；亦可以高通量形式进行，用于人群中HPA基因频率的普查。
附图说明
图1.两个血液DNA样品(x、y)的示例性琼脂糖凝胶电泳图片。A和B中的两个方框分别代表DNA样品x、y。A：本发明的多重PCR分型结果，其中样品y在1+2b条带中有非特异性条带；B：G&T试剂盒的SSP-PCR分型结果，其中样品x在2b、y样品在5b处均有非特异性条带。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
使用本发明的试剂盒和方法进行HPA基因分型，并验证本发明试剂盒的分型准确度、特异性和灵敏度。
1.引物
本发明使用的引物均由上海生工公司合成，UltraPage纯化方式纯化。引物序列如表1所示。
表1引物序列
2.血液DNA提取
取1mL全血(EDTA抗凝)，用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司，DP318)根据生产商说明书进行基因组DNA提取，用Nanodrop 2000(Thermo)测定A260处OD值及A260:A280比值。
3.对样品进行SSP-PCR基因分型
按照表2配制2×引物预混液，每个PCR孔中加入5μL的2×引物预混液、5μL的2×Taq酶反应预混液(包括约0.5U的Taq酶、PCR反应缓冲液及琼脂糖电泳缓冲液，也可以直接使用Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)(Takara，RR902A))，及0.5μL的DNA模板(浓度约为5-200ng/μL，本实施例中的浓度为100ng/μL)，用10μL左右石蜡油(上海生工)覆盖。按照以下条件进行PCR反应：1个循环96℃60sec，5个循环96℃25sec，72℃45sec，72℃30sec，28个循环96℃25sec，68℃45sec，72℃30sec，1个循环72℃7min。用TAE溶液配制2％的琼脂糖凝胶，直接进行电泳检测。在紫外成像仪(Gene公司，G:BOX Chemi XR5)中进行成像和拍照。所得PCR产物大小列于表3。
表2引物预混液成分及所检测的HPA基因SNP
*SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23为人生长素基因内参引物对。
表3各HPA基因及内参基因扩增产物大小
基因名称 扩增产物大小
HPA-1a，-1b 90bp
HPA-1a，-2b 258bp
HPA-1a，-3b 267bp
HPA-1a，-4b 200bp
HPA-1a，-5b 120bp
HPA-1a，-6b 250bp
HPA-1a，-7b 181bp
HPA-1a，-8b 225bp
HPA-1a，-9b 90bp
HGH(人生长素) 429bp
4.本试剂盒在96孔板中的分型格局
我们根据排枪和琼脂糖凝胶电泳加样孔的间距设计分型格局，帮助便捷地进行PCR产物点样。每个96孔板可做12人份的血液DNA样品。
表4引物预混液在96孔板中的分布
5.本试剂盒分型准确度分析及与市售试剂盒的比较
用3中的方法对50个献血者的血液DNA样品进行分型，并用测序引物SEQ ID NO:24-37分别对这些血液DNA样品进行HPA1-6和15基因的扩增，用正向PCR引物对所得扩增产物进行测序(上海生工)，将所得的测序结果与本发明SSP-PCR分型结果进行对比。统计各HPA等位基因的分型准确率。对比后进行分型准确度的计算：(1－与测序结果有差异的等位基因数/总等位基因数)×100％＝(1-1/700)×100％＝99.86％。同时将前述血液DNA样品使用市售试剂盒根据生产商说明书进行分型，该市售试剂盒也基于SSP-PCR，为美国G&T公司的HPA分型试剂盒，与测序结果进行比对后得到分型准确度为99.71％，比本发明的分型准确度略低。
6.本试剂盒反应特异性分析及与市售试剂盒的比较
分析4中分型得到的电泳条带，将二者电泳条带进行对比，其中本发明试剂盒在HPA1+2b泳道偶尔出现非特异性条带，而G&T试剂盒在HPA2b、5b、15b三个泳道中经常出现显著非特异性条带，甚至影响结果判读。图1为示例性电泳结果。
7.本试剂盒灵敏度分析
在上述50份DNA样品中，浓度最高为190ng/μl，最低为5.9ng/μl。随机取其中4份DNA样品，浓度分别为12.7ng/μl、25.8ng/μl、51.3ng/μl、127.6ng/μl，将其均稀释至5ng/μl，用稀释过的DNA样品重复3中的分型实验，所得电泳结果均清晰准确，与未稀释的结果无明显差异。因此，DNA浓度≥5ng/μl时，均可以本发明试剂盒进行基因分型。对于每份样品需要的DNA总量为5ng/μl×0.5μl×8管＝20ng。
实施例2
一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，包含以下试剂：SEQ ID NO:1-23的引物。
实施例3
一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，包含以下试剂：SEQ ID NO:1-23的引物。具体地，包含引物预混液，各管引物预混液中各条引物的浓度如下表所示：
实施例4
一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，包含以下试剂：SEQ ID NO:1-23的引物。具体地，包含引物预混液，各管引物预混液中各条引物的浓度如下表所示：
实施例5
一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其是在实施例2-4任一人类血小板血型抗原基因分型试剂盒基础上，进一步包含操作说明书，且操作说明书记载了以下内容：
(1)进行HPA基因分型时采取多重PCR。
(2)PCR反应体系为：配制2×引物预混液，每个PCR孔中加入5μL的2×引物预混液、5μL的2×Taq酶反应预混液，及0.5μL浓度为5-200ng/μL的DNA模板，用10μL左右石蜡油覆盖，所述的Taq酶反应预混液包括0.5U的Taq酶、PCR反应缓冲液及琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
(3)PCR反应程序为：1个循环96℃60sec，5个循环96℃25sec，72℃45sec，72℃30sec，28个循环96℃25sec，68℃45sec，72℃30sec，1个循环72℃7min。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人类血小板血型抗原基因分型引物组合，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO:1-23所示的引物。
2.一种人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合。
3.根据权利要求2所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含引物预混液，所述的引物预混液如下表所示：
4.根据权利要求3所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，所述的引物预混液中各条引物的浓度比例如下表所示：
5.根据权利要求3所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，还包含操作说明书，所述的操作说明书记载了以下内容：进行HPA基因分型时采取多重PCR。
6.根据权利要求4所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，所述的操作说明书还记载了以下内容：PCR反应体系为：每个PCR孔中加入5μL的2×引物预混液、5μL的2×Taq酶反应预混液，及0.5μL浓度为5-200ng/μL的DNA模板，用石蜡油覆盖，所述的Taq酶反应预混液包括0.5U的Taq酶、PCR反应缓冲液及琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
7.根据权利要求4所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒，其特征在于，所述的操作说明书还记载了以下内容：PCR反应程序为：1个循环96℃60sec，5个循环96℃25sec，72℃45sec，72℃30sec，28个循环96℃25sec，68℃45sec，72℃30sec，1个循环72℃7min。
8.权利要求1所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合或权利要求2-7任一所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒在血小板供者库的建立或人群HPA基因频率普查中的应用。
9.一种非诊断和治疗目的的人类血小板血型抗原基因分型方法，其特征在于，所述的方法使用了权利要求1所述的人类血小板血型抗原基因分型引物组合或权利要求2-7任一所述的人类血小板血型抗原基因分型试剂盒。
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