CN105296601A - 一种人血小板同种抗原系统基因分型的pcr-sbt方法及试剂 - Google Patents
一种人血小板同种抗原系统基因分型的pcr-sbt方法及试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，该方法包括以下步骤：制备人基因组DNA；扩增人基因组DNA中抗原系统的基因序列；将扩增产物进行双酶切纯化；将纯化产物进行测序PCR反应；将测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；将获得的序列通过软件分析确定其基因型。本发明还提供上述分型方法所用的试剂。本发明可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HPA28个抗原系统准确定型的问题，发挥PCR-SBT对HPA基因定型操作高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人血小板同种抗原系统（HumanPlateletAlloantigen，缩写为HPA）的抗原基因分型的分子生物学检测方法及该方法所用的试剂。
背景技术
血小板表面存在复杂的血型抗原，它不仅存在与红细胞共有的ABO、H、Lewis等糖链类抗原和与白细胞共有的HLA-I类抗原，还存在血小板自身特异性的同种抗原系统（humanplateletalloantigen,HPA），人群中HPA系统表现出高度的遗传多态性。个体间HPA抗原的不同可通过免疫刺激而产生抗体，抗体能与供者相对应抗原相结合从而破坏血小板，导致血小板输注无效和其他相关性疾病，因此研究血小板同种抗原系统具有重要的意义，有助于疾病诊治和解决血小板输注问题。研究显示HPA基因定位于血小板糖膜蛋白和CD109基因上，目前共发现有28个抗原系统。
血小板同种抗原的差异可导致个体受免疫刺激产生抗体，已发现其抗体与多种疾病有关，包括新生儿同种免疫性血小板减少症、血小板输注无效和输血后紫癜等。其中血小板输注无效在临床输血治疗中常见，也是目前血小板输注中需要研究解决的热点问题。国内外已建立一些方法解决血小板输注无效，近年来国内开始建立献血者血小板同种抗原基因数据库，拟提供与患者血小板抗原系统基因型相合的献血者，以解决血小板输注无效问题。
目前HPA抗原基因分型最主要的方法是多聚酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP），该方法针对同一抗原系统需要设计两对引物进行扩增才能有效区分，因此对检测HPA的多个系统需要扩增的孔位较多，此外PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此对于一些特殊的新突变位点难以明确。而HPA系统的PCR-SBT（PCR-Sequencebasedtyping，基于PCR测序的分型技术）分型方法可以克服上述局限性和不足，为目前最准确的分型的方法。但现阶段的HPA抗原基因PCR-SBT分型方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对HPA抗原进行基因分型，但至今未对HPA1-28w系统进行系统分型。因此，建立HPA1-28w系统的PCR-SBT分型方法具有重要的意义。
发明内容
本发明首先要解决的技术问题是提供一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，以克服现有分型技术中的上述不足之处。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，对HPA抗原系统的基因进行分型，并包括以下步骤：
（1）制备人基因组DNA；
（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中抗原系统的基因序列；
（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；
（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；
（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
进一步地，所述HPA抗原系统为HPA1-28W抗原系统，所述的HPA1-28W抗原系统的基因为：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-12w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-19w、HPA-20w、HPA-21w、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-25bw、HPA-26bw、HPA-27bw、HPA-28bw。
进一步地，所述步骤（2）中的扩增引物为：
(1)HPA-1和HPA-10w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-1,10F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTTggCCTCCCAAAgTATCA3’
HPA-1,10R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCACCTgCTTCAggTCTCTCC3’
(2)HPA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-2F:5’TgTAAAACgACggCCAgTTATCCCACAATCAgCTgCAA3’
HPA-2R:5’CAggAAACAgCTATgACCgAgATTCTCCAgCCCATTCA3’
(3)HPA-3、HPA-9w和HPA-27bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-3,9,27F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTggAAgAAAgACCTgggAAgg3’
HPA-3,9,27R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTCTTTCAgCTCACCCCAgAC3’
(4)HPA-4、HPA-16w和HPA-19w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-4,16,19F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTCAATCTTggTgggAgAAgAA3’
HPA-4,16,19R:5’CgATgCTAgACgATCCAggCCTTAggCTCCATTgACAC3’
(5)HPA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-5F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgAgggAAggAACTgTgCTC3’
HPA-5R:5’CgATgCTAgACgATCCAgACAAgAAAgCATTgCCCTgT3’
(6)HPA-6w和HPA-7w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-6,7F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgCTTgTgTTTTTgCTTTgC3’
HPA-6,7R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggCCTTCACCTATgTTTCCA3’
(7)HPA-8w、HPA-11w、HPA-21w和HPA-23bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-8,11,21,23F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTAATggAg(a/g)TggAgCAgCTT3’
HPA-8,11,21,23R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTAgAACCTgggTgTgTgCAA3’
(8)HPA-12w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA12F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTCCCgCTgCAgAgTAAgC3’
HPA12R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCgTTgTgTCgACAgggAAgg3’
(9)HPA-13w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-13F:5’ACgTgggTATAAgAggCgCAATAgCAACAAAgAACAATCCA3’
HPA-13R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgTCggAAgCCACAAAgTTC3’
(10)HPA-14w，26bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-14,26F-1:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTATCTgTgTggTTgggAgAgC3’
HPA-14,26R-1:5’TCCAAACTCATCAATgTATCggCTCTggTgAgCAAgAAAC3’
(11)HPA-15抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-15F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTCCTATTCTTTgAAAAgTTgggATT3’
HPA-15R:5’CAGGAAACAGCTATGACCAAAC(C/A)AgTAgCCACCCAAgA3’
(12)HPA-17w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-17F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTgCCTTTTCCATgAAggTgTC3’
HPA-17R:5’CAGGAAACAGCTATGACCCCAgAAATCCCCAgAgTTCA3’
(13)HPA-18w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-18F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTCCAAgAAgACACAATAAAgCAA3’
HPA-18R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTTggAAgggTgAgCATTTTC3’
(14)HPA-20w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-20F:5’ACgTgggTATAAgAggCggAgCCCCgATACCATCTACA3’
HPA-20R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgggAgggAgATgAgAgAgC3’
(15)HPA-22bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-22F:5’ACgTgggTATAAgAggCgAgCCCTTgCTTTggATCTg3’
HPA-22R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggTTgCTggAgTCAAAggAg3’
(16)HPA-24bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-24F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTgACCTgATCgTgggAgCTTA3’
HPA-24R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCAgTggCTCCAACACACATC3’
(17)HPA-25bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-25F:5’TgTAAAACgACggCCAgTATgCCAgCTTCTCTgCATTT3’
HPA-25R:5’CAggAAACAgCTATgACCCCTCgCCAAAATCTCAACAT3’
(18)HPA-28bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-28F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCAgTgTggCATgCTCTTTgT3’
HPA-28R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTgTTCTgCTCCCTCTCACCT3’。
所述步骤（4）中的测序引物为6条寡核苷酸测序引物，其序列如下：
M13F:5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
PCMVF-BD:5’-TCTAAAAgCTgCggAATTgT-3’
PCMVR:5’-TCCAAACTCATCAATgTATC-3’
pDC316F:5’-ACgTgggTATAAgAggCg-3’
pDC316R:5’-CgATgCTAgACgATCCAg-3’。
所述步骤（3）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，所述抗原系统为HPA1-28w抗原系统，由28个抗原基因组成：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-12w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-19w、HPA-20w、HPA-21w、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-25bw、HPA-26bw、HPA-27bw、HPA-28bw，所述试剂由用于扩增28个HPA抗原基因的18个扩增引物和用于测序分析的6个寡核苷酸测序引物组成；
所述用于扩增的引物为：
(1)HPA-1和HPA-10w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-1,10F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTTggCCTCCCAAAgTATCA3’
HPA-1,10R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCACCTgCTTCAggTCTCTCC3’
(2)HPA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-2F:5’TgTAAAACgACggCCAgTTATCCCACAATCAgCTgCAA3’
HPA-2R:5’CAggAAACAgCTATgACCgAgATTCTCCAgCCCATTCA3’
(3)HPA-3、HPA-9w和HPA-27bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-3,9,27F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTggAAgAAAgACCTgggAAgg3’
HPA-3,9,27R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTCTTTCAgCTCACCCCAgAC3’
(4)HPA-4、HPA-16w和HPA-19w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-4,16,19F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTCAATCTTggTgggAgAAgAA3’
HPA-4,16,19R:5’CgATgCTAgACgATCCAggCCTTAggCTCCATTgACAC3’
(5)HPA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-5F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgAgggAAggAACTgTgCTC3’
HPA-5R:5’CgATgCTAgACgATCCAgACAAgAAAgCATTgCCCTgT3’
(6)HPA-6w和HPA-7w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-6,7F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgCTTgTgTTTTTgCTTTgC3’
HPA-6,7R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggCCTTCACCTATgTTTCCA3’
(7)HPA-8w、HPA-11w、HPA-21w和HPA-23bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-8,11,21,23F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTAATggAg(a/g)TggAgCAgCTT3’
HPA-8,11,21,23R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTAgAACCTgggTgTgTgCAA3’
(8)HPA-12w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA12F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTCCCgCTgCAgAgTAAgC3’
HPA12R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCgTTgTgTCgACAgggAAgg3’
(9)HPA-13w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-13F:5’ACgTgggTATAAgAggCgCAATAgCAACAAAgAACAATCCA3’
HPA-13R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgTCggAAgCCACAAAgTTC3’
(10)HPA-14w，26bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-14,26F-1:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTATCTgTgTggTTgggAgAgC3’
HPA-14,26R-1:5’TCCAAACTCATCAATgTATCggCTCTggTgAgCAAgAAAC3’
(11)HPA-15抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-15F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTCCTATTCTTTgAAAAgTTgggATT3’
HPA-15R:5’CAGGAAACAGCTATGACCAAAC(C/A)AgTAgCCACCCAAgA3’
(12)HPA-17w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-17F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTgCCTTTTCCATgAAggTgTC3’
HPA-17R:5’CAGGAAACAGCTATGACCCCAgAAATCCCCAgAgTTCA3’
(13)HPA-18w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-18F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTCCAAgAAgACACAATAAAgCAA3’
HPA-18R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTTggAAgggTgAgCATTTTC3’
(14)HPA-20w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-20F:5’ACgTgggTATAAgAggCggAgCCCCgATACCATCTACA3’
HPA-20R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgggAgggAgATgAgAgAgC3’
(15)HPA-22bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-22F:5’ACgTgggTATAAgAggCgAgCCCTTgCTTTggATCTg3’
HPA-22R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggTTgCTggAgTCAAAggAg3’
(16)HPA-24bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-24F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTgACCTgATCgTgggAgCTTA3’
HPA-24R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCAgTggCTCCAACACACATC3’
(17)HPA-25bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-25F:5’TgTAAAACgACggCCAgTATgCCAgCTTCTCTgCATTT3’
HPA-25R:5’CAggAAACAgCTATgACCCCTCgCCAAAATCTCAACAT3’
(18)HPA-28bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-28F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCAgTgTggCATgCTCTTTgT3’
HPA-28R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTgTTCTgCTCCCTCTCACCT3’
所述6条寡核苷酸测序引物序列如下：
M13F:5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
PCMVF-BD:5’-TCTAAAAgCTgCggAATTgT-3’
PCMVR:5’-TCCAAACTCATCAATgTATC-3’
pDC316F:5’-ACgTgggTATAAgAggCg-3’
pDC316R:5’-CgATgCTAgACgATCCAg-3’。
本发明中引物的设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据GenBank中人类HPA抗原基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。HPA-(1、10w)、(4、16w、19w)、(6w、7w)、(8w、11w、21bw、23bw)、(14w、26bw)、17w抗原系统的ITGB3基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000017.10(45331208..45390077)的序列设计；HPA-2抗原系统的GP1BA基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000017.10(4835312-4838325)的序列设计；HPA-(3、9w、27bw)、20w、22bw、24bw、28bw抗原系统的ITGA2B基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000017.10(42449550-42466873)的序列设计；HPA-5、13w、18w、25bw抗原系统的ITGA2基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000005.9(52285156-52390609)的序列设计；HPA-12w抗原系统的GP1BB基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000022.10(19711066-19712297)的序列设计；HPA-15抗原系统的CD109基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000006.11(74405508-74538041)的序列设计。正向扩增引物5’端依据后续组合情况分别连接有M13载体正向序列上的18个碱基序列TGTAAAACGACGGCCAGT、PCMVF-BD正向序列上的20个碱基序列TCTAAAAgCTgCggAATTgT、pDC316正向序列上的18个碱基序列ACgTgggTATAAgAggCg，反向扩增引物5’端连接有M13载体反向序列上的18个碱基序列CAGGAAACAGCTATGACC，PCMV反向序列上的20个碱基序列TCCAAACTCATCAATgTATC，pDC316反向序列上的18个碱基序列CgATgCTAgACgATCCAg。（接头引物可以互换，但同一组内应不同）
本发明以18对寡核苷酸引物分别扩增HPA1-28w系统的18个基因片段。其中HPA-(1、10w)、(4、16w、19w)、(6w、7w)、(8w、11w、21bw、23bw)、(14w、26bw)、17w抗原系统的引物分别扩增GenBank编号为NC_000017.10(45331208-45390077)序列中38146-38581位、39382-39881位、46946-47640位、55361-56610位、54198-54622位、41201-41497位的片段；HPA-2抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000017.10(4835312-4838325)序列中的1340-1611位的片段；HPA-(3、9w、27bw)、20bw、22bw、24bw、28bw抗原系统的引物分别扩增GenBank编号为NC_000017.10(42449550-42466873)序列中的16284-16691位、13235-13816位、6633-7131位、11457-11833位、15593-15977位的片段；HPA-5、13w、18w、25bw抗原系统的引物分别扩增GenBank中编号为NC_000005.9(52285156-52390609)的序列中89121-89571位、99408-99889位、96519-96861位、113383-113693位的片段；HPA-12w抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000022.10(19711066-19712297)序列中209-661位的片段；HPA-15抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000006.11(74405508-74538041)序列中的107619-107872位的片段，可保证28个抗原系统基因的有效扩增。扩增引物的设计参照SNP数据库避开了HPA抗原编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的序列，通过对这些序列进行双向测序，从而将样本进行精确的基因定型。
本发明通过对HPA1-28w抗原系统分别进行序列测序，获得HPA抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测，高通量地获得的所有HPA抗原系统的编码序列信息在基因定型、基因多态性检测、频率调查分析等方面的应用将受到广泛重视。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HPA28个抗原系统准确定型的问题，发挥PCR-SBT对HPA基因定型操作高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明的检测标本的HPA1-28w系统基因PCR扩增电泳图谱。1和2孔为第1组扩增片段（HPA-8w、11bw、21w、23w、24bw、13w系统），3和4孔为第2组扩增片段（HPA-15、28bw、22bw系统），5和6孔为第3组扩增片段（HPA-2、3、9w、27bw、4、16w、19w系统），7和8孔为第4组扩增片段（HPA-17w、14w、26bw、20w系统），9和10孔为第5组扩增片段（HPA-25bw、1、10w、5系统），11和12孔为第6组扩增片段（HPA-18w、12w、6w、7w系统）。M为DNAmarker，分子量分别为5000,3000,2000,1000,750,500,250,100bp。
图2为HPA-1的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-1多态性位点，标本为HPA-1aa。
图3为HPA-2的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-2多态性位点,标本为HPA-2ab。
图4为HPA-3的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-3多态性位点,标本为HPA-3ab。
图5为HPA-4的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-4多态性位点,标本为HPA-4ab。
图6为HPA-5的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-5多态性位点,标本为HPA-5aa。
图7为HPA-6w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-6w多态性位点,标本为HPA-6wab。
图8为HPA-7w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-7w多态性位点,标本为HPA-7waa。
图9为HPA-8w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-8w多态性位点,标本为HPA-8waa。
图10为HPA-9w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-9w多态性位点,标本为HPA-9waa。
图11为HPA-10w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-10w多态性位点,标本为HPA-10waa。
图12为HPA-11w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-11w多态性位点,标本为HPA-11waa。
图13为HPA-12w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-12w多态性位点,标本为HPA-12waa。
图14为HPA-13w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-13w多态性位点,标本为HPA-13waa。
图15为HPA-14w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-14w多态性位点,标本为HPA-14waa。
图16为HPA-15的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-15多态性位点,标本为HPA-15ab。
图17为HPA-16w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-16w多态性位点,标本为HPA-16waa。
图18为HPA-17w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-17w多态性位点,标本为HPA-17waa。
图19为HPA-18w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-18w多态性位点,标本为HPA-18waa。
图20为HPA-19w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-19w多态性位点,标本为HPA-19waa。
图21为HPA-20w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-20w多态性位点,标本为HPA-20waa。
图22为HPA-21w的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-21w多态性位点,标本为HPA-21waa。
图23为HPA-22bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-22bw多态性位点,标本为HPA-22bwaa。
图24为HPA-23bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-23bw多态性位点,标本为HPA-23bwaa。
图25为HPA-24bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-24bw多态性位点,标本为HPA-24bwaa。
图26为HPA-25bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-25bw多态性位点,标本为HPA-25bwaa。
图27为HPA-26bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-26bw多态性位点,标本为HPA-26bwaa。
图28为HPA-27bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-27bw多态性位点,标本为HPA-27bwaa。
图29为HPA-28bw的部分测序电泳图谱，箭头所指为HPA-28bw多态性位点,标本为HPA-28bwaa。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本进行HPA1-28w系统抗原基因的分型为例对本发明内容做详细说明。
本发明的基因分型的PCR-SBT方法包括以下步骤：
1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μl，按照QuickGeneDNAwholebloodkitS试剂盒说明书提取基因组DNA，利用分光光度计测定基因组浓度和纯度。
2、合成18对扩增引物，具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至50μM。
准备Goto-Taq酶（Promega）、5×PCR缓冲液（内含Mg2+，Promega）、dNTP（TaKaRa）、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板，按表1所述体系配制PCR扩增体系。
表1：步骤2中HPA1-28w系统的PCR扩增体系
| HPA系统PCR扩增体系 | 1组（μl） | 2组（μl） | 3组（μl） | 4组（μl） | 5组（μl） | 6组（μl） |
| 5×PCR缓冲液 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| dNTP（2.5 mM） | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 |
| 引物1 | HPA-8,11,21,23F 0.16 | HPA-15F 0.16 | HPA-2F 0.12 | HPA-17F 0.12 | HPA-25F 0.08 | HPA-18F 0.08 |
| 引物2 | HPA-8,11,21,23R 0.16 | HPA-15R 0.16 | HPA-2R 0.12 | HPA-17R 0.12 | HPA-25R 0.08 | HPA-18R 0.08 |
| 引物3 | HPA-24F 0.04 | HPA-28F 0.16 | HPA-3,9,27F 0.04 | HPA-14,26F 0.12 | HPA-1,10F 0.12 | HPA-12F 0.16 |
| 引物4 | HPA-24R 0.04 | HPA-28R 0.16 | HPA-3,9,27R 0.04 | HPA-14,26R 0.12 | HPA-1,10R 0.12 | HPA-12R 0.16 |
| 引物5 | HPA-13F 0.16 | HPA-22F 0.16 | HPA-4,16,19F 0.12 | HPA-20F 0.20 | HPA-5F 0.24 | HPA-6,7F 0.08 |
| 引物6 | HPA-13R 0.16 | HPA-22R 0.16 | HPA-4,16,19R 0.12 | HPA-20R 0.20 | HPA-5R 0.24 | HPA-6,7R 0.08 |
| Goto Taq酶（5U/μl） | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| H2O | 11.48 | 11.24 | 11.64 | 11.32 | 11.32 | 11.56 |
| DNA模板(100 ng/μl) | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 总体系 | 20μl | 20μl | 20μl | 20μl | 20μl | 20μl |
上表中，引物1-6分别代表不同的HPA扩增引物，1组扩增HPA-8w、11bw、21w、23w、24bw、13w系统，2组扩增HPA-15、28bw、22bw系统，3组扩增HPA-2、3、9w、27bw、4、16w、19w系统，4组扩增HPA-17w、14w、26bw、20w系统，5组扩增HPA-25bw、1、10w、5系统，6组扩增HPA-18w、12w、6w、7w系统。
用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：
95℃预变性5min，DNA双链充分解开；95℃变性30s，60℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸1min，延长所需扩增片段，反应30个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
3、扩增产物的双酶切纯化。
将检测样本所扩增片段，各取2μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶（SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega）和核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa），利用虾碱性磷酸酶（SAP）的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ）的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25μl扩增产物体系中加入SAP1μl和Exo-Ⅰ2μl，37℃，进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
4、合成6条测序引物，具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，对PCR产物进行测序PCR。
将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入20μl纯水稀释，混匀，将6条测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDyeterminatorv3.1sequencingkit（美国ABI公司）试剂按照表2配制反应体系：
表2：步骤4中PCR产物的PCR测序体系
| 5×缓冲液 | 1.5 |
| BigDye mix | 1.0 |
| 测序引物1 | 1.0 |
| DNA | 2.0 |
| H2O | 4.5 |
| 总体积 | 10.0 |
| 5×缓冲液 | 1.5 |
其中测序引物1为M13F、M13R、PCMVF-BD、PCMVR、pDC316F、pDC316R中任意一条。
所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行2个反应，用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。
5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μlEDTA（1.25μM）和25μl醋酸钠（3M）/无水乙醇（1：40）混合液，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl75%乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。
6、将制备好的产物在ABI3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScapeV2.5软件进行序列比对，确定HPA抗原系统的基因型，结果显示了检测样本HPA1-28w的部分序列。图2-29分别为本发明的血液检测样本进行HPA1-28w基因分型的部分测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。
<110>浙江省血液中心
<120>一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法及试剂
<130>
<160>42
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tctaaaagctgcggaattgtcttggcctcccaaagtatca40
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tccaaactcatcaatgtatccacctgcttcaggtctctcc40
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgtaaaacgacggccagttatcccacaatcagctgcaa38
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caggaaacagctatgaccgagattctccagcccattca38
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tctaaaagctgcggaattgtggaagaaagacctgggaagg40
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tccaaactcatcaatgtatctctttcagctcaccccagac40
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
acgtgggtataagaggcgtcaatcttggtgggagaagaa39
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cgatgctagacgatccaggccttaggctccattgacac38
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
acgtgggtataagaggcgtgagggaaggaactgtgctc38
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cgatgctagacgatccagacaagaaagcattgccctgt38
<210>11
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
acgtgggtataagaggcgtgcttgtgtttttgctttgc38
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cgatgctagacgatccagggccttcacctatgtttcca38
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tgtaaaacgacggccagttaatggagagtggagcagctt39
<210>14
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
caggaaacagctatgacctagaacctgggtgtgtgcaa38
<210>15
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tctaaaagctgcggaattgtctcccgctgcagagtaagc39
<210>16
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tccaaactcatcaatgtatcgttgtgtcgacagggaagg39
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
acgtgggtataagaggcgcaatagcaacaaagaacaatcca41
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
cgatgctagacgatccagagtcggaagccacaaagttc38
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
tctaaaagctgcggaattgtatctgtgtggttgggagagc40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tccaaactcatcaatgtatcggctctggtgagcaagaaac40
<210>21
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tgtaaaacgacggccagtcctattctttgaaaagttgggatt42
<210>22
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
caggaaacagctatgaccaaaccaagtagccacccaaga39
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tgtaaaacgacggccagtgccttttccatgaaggtgtc38
<210>24
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
caggaaacagctatgaccccagaaatccccagagttca38
<210>25
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
tgtaaaacgacggccagttccaagaagacacaataaagcaa41
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
caggaaacagctatgaccttggaagggtgagcattttc38
<210>27
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
acgtgggtataagaggcggagccccgataccatctaca38
<210>28
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
cgatgctagacgatccagagggagggagatgagagagc38
<210>29
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
acgtgggtataagaggcgagcccttgctttggatctg37
<210>30
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
cgatgctagacgatccagggttgctggagtcaaaggag38
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tctaaaagctgcggaattgtgacctgatcgtgggagctta40
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tccaaactcatcaatgtatccagtggctccaacacacatc40
<210>33
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tgtaaaacgacggccagtatgccagcttctctgcattt38
<210>34
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
caggaaacagctatgacccctcgccaaaatctcaacat38
<210>35
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
tctaaaagctgcggaattgtcagtgtggcatgctctttgt40
<210>36
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
tccaaactcatcaatgtatctgttctgctccctctcacct40
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
tgtaaaacgacggccagt18
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
caggaaacagctatgacc18
<210>39
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
tctaaaagctgcggaattgt20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
tccaaactcatcaatgtatc20
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
acgtgggtataagaggcg18
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
cgatgctagacgatccag18
Claims (6)
1.一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对HPA抗原系统的基因进行分型，所述方法包括以下步骤：
（1）制备人基因组DNA；
（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中抗原系统的基因序列；
（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；
（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；
（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
2.如权利要求1所述的一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述HPA抗原系统为HPA1-28w抗原系统，所述的HPA1-28w抗原系统的基因为：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-12w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-19w、HPA-20w、HPA-21w、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-25bw、HPA-26bw、HPA-27bw、HPA-28bw。
3.如权利要求2所述的一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤（2）中的扩增引物为：
(1)HPA-1和HPA-10w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-1,10F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTTggCCTCCCAAAgTATCA3’
HPA-1,10R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCACCTgCTTCAggTCTCTCC3’
(2)HPA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-2F:5’TgTAAAACgACggCCAgTTATCCCACAATCAgCTgCAA3’
HPA-2R:5’CAggAAACAgCTATgACCgAgATTCTCCAgCCCATTCA3’
(3)HPA-3、HPA-9w和HPA-27bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-3,9,27F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTggAAgAAAgACCTgggAAgg3’
HPA-3,9,27R:
5’TCCAAACTCATCAATgTATCTCTTTCAgCTCACCCCAgAC3’
(4)HPA-4、HPA-16w和HPA-19w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-4,16,19F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTCAATCTTggTgggAgAAgAA3’
HPA-4,16,19R:5’CgATgCTAgACgATCCAggCCTTAggCTCCATTgACAC3’
(5)HPA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-5F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgAgggAAggAACTgTgCTC3’
HPA-5R:5’CgATgCTAgACgATCCAgACAAgAAAgCATTgCCCTgT3’
(6)HPA-6w和HPA-7w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-6,7F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgCTTgTgTTTTTgCTTTgC3’
HPA-6,7R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggCCTTCACCTATgTTTCCA3’
(7)HPA-8w、HPA-11w、HPA-21w和HPA-23bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-8,11,21,23F:
5’TGTAAAACGACGGCCAGTTAATggAg(a/g)TggAgCAgCTT3’
HPA-8,11,21,23R:
5’CAGGAAACAGCTATGACCTAgAACCTgggTgTgTgCAA3’
(8)HPA-12w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA12F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTCCCgCTgCAgAgTAAgC3’
HPA12R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCgTTgTgTCgACAgggAAgg3’
(9)HPA-13w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-13F:5’ACgTgggTATAAgAggCgCAATAgCAACAAAgAACAATCCA3’
HPA-13R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgTCggAAgCCACAAAgTTC3’
(10)HPA-14w，26bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-14,26F-1:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTATCTgTgTggTTgggAgAgC3’
HPA-14,26R-1:
5’TCCAAACTCATCAATgTATCggCTCTggTgAgCAAgAAAC3’
(11)HPA-15抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-15F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTCCTATTCTTTgAAAAgTTgggATT3’
HPA-15R:5’CAGGAAACAGCTATGACCAAAC(C/A)AgTAgCCACCCAAgA3’
(12)HPA-17w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-17F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTgCCTTTTCCATgAAggTgTC3’
HPA-17R:5’CAGGAAACAGCTATGACCCCAgAAATCCCCAgAgTTCA3’
(13)HPA-18w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-18F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTCCAAgAAgACACAATAAAgCAA3’
HPA-18R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTTggAAgggTgAgCATTTTC3’
(14)HPA-20w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-20F:5’ACgTgggTATAAgAggCggAgCCCCgATACCATCTACA3’
HPA-20R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgggAgggAgATgAgAgAgC3’
(15)HPA-22bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-22F:5’ACgTgggTATAAgAggCgAgCCCTTgCTTTggATCTg3’
HPA-22R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggTTgCTggAgTCAAAggAg3’
(16)HPA-24bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-24F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTgACCTgATCgTgggAgCTTA3’
HPA-24R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCAgTggCTCCAACACACATC3’
(17)HPA-25bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-25F:5’TgTAAAACgACggCCAgTATgCCAgCTTCTCTgCATTT3’
HPA-25R:5’CAggAAACAgCTATgACCCCTCgCCAAAATCTCAACAT3’
(18)HPA-28bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-28F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCAgTgTggCATgCTCTTTgT3’
HPA-28R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTgTTCTgCTCCCTCTCACCT3’。
4.如权利要求1所述的一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤（4）中的测序引物为6条寡核苷酸测序引物，其序列如下：
M13F:5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
PCMVF-BD:5’-TCTAAAAgCTgCggAATTgT-3’
PCMVR:5’-TCCAAACTCATCAATgTATC-3’
pDC316F:5’-ACgTgggTATAAgAggCg-3’
pDC316R:5’-CgATgCTAgACgATCCAg-3’。
5.如权利要求1所述的一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤（3）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
6.一种人血小板同种抗原系统基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，其特征在于：所述抗原系统为HPA1-28w抗原系统，由28个抗原基因组成：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6w、HPA-7w、HPA-8w、HPA-9w、HPA-10w、HPA-11w、HPA-12w、HPA-13w、HPA-14w、HPA-15、HPA-16w、HPA-17w、HPA-18w、HPA-19w、HPA-20w、HPA-21w、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-25bw、HPA-26bw、HPA-27bw、HPA-28bw，所述试剂由用于扩增28个HPA抗原基因的18个扩增引物和用于测序分析的6个寡核苷酸测序引物组成；
所述用于扩增的引物为：
(1)HPA-1和HPA-10w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-1,10F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTTggCCTCCCAAAgTATCA3’
HPA-1,10R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCACCTgCTTCAggTCTCTCC3’
(2)HPA-2抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-2F:5’TgTAAAACgACggCCAgTTATCCCACAATCAgCTgCAA3’
HPA-2R:5’CAggAAACAgCTATgACCgAgATTCTCCAgCCCATTCA3’
(3)HPA-3、HPA-9w和HPA-27bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-3,9,27F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTggAAgAAAgACCTgggAAgg3’
HPA-3,9,27R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTCTTTCAgCTCACCCCAgAC3’
(4)HPA-4、HPA-16w和HPA-19w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-4,16,19F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTCAATCTTggTgggAgAAgAA3’
HPA-4,16,19R:5’CgATgCTAgACgATCCAggCCTTAggCTCCATTgACAC3’
(5)HPA-5抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-5F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgAgggAAggAACTgTgCTC3’
HPA-5R:5’CgATgCTAgACgATCCAgACAAgAAAgCATTgCCCTgT3’
(6)HPA-6w和HPA-7w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-6,7F:5’ACgTgggTATAAgAggCgTgCTTgTgTTTTTgCTTTgC3’
HPA-6,7R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggCCTTCACCTATgTTTCCA3’
(7)HPA-8w、HPA-11w、HPA-21w和HPA-23bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-8,11,21,23F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTAATggAg(a/g)TggAgCAgCTT3’
HPA-8,11,21,23R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTAgAACCTgggTgTgTgCAA3’
(8)HPA-12w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA12F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCTCCCgCTgCAgAgTAAgC3’
HPA12R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCgTTgTgTCgACAgggAAgg3’
(9)HPA-13w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-13F:5’ACgTgggTATAAgAggCgCAATAgCAACAAAgAACAATCCA3’
HPA-13R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgTCggAAgCCACAAAgTTC3’
(10)HPA-14w，26bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-14,26F-1:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTATCTgTgTggTTgggAgAgC3’
HPA-14,26R-1:5’TCCAAACTCATCAATgTATCggCTCTggTgAgCAAgAAAC3’
(11)HPA-15抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-15F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTCCTATTCTTTgAAAAgTTgggATT3’
HPA-15R:5’CAGGAAACAGCTATGACCAAAC(C/A)AgTAgCCACCCAAgA3’
(12)HPA-17w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-17F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTgCCTTTTCCATgAAggTgTC3’
HPA-17R:5’CAGGAAACAGCTATGACCCCAgAAATCCCCAgAgTTCA3’
(13)HPA-18w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-18F:5’TGTAAAACGACGGCCAGTTCCAAgAAgACACAATAAAgCAA3’
HPA-18R:5’CAGGAAACAGCTATGACCTTggAAgggTgAgCATTTTC3’
(14)HPA-20w抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-20F:5’ACgTgggTATAAgAggCggAgCCCCgATACCATCTACA3’
HPA-20R:5’CgATgCTAgACgATCCAgAgggAgggAgATgAgAgAgC3’
(15)HPA-22bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-22F:5’ACgTgggTATAAgAggCgAgCCCTTgCTTTggATCTg3’
HPA-22R:5’CgATgCTAgACgATCCAgggTTgCTggAgTCAAAggAg3’
(16)HPA-24bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-24F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTgACCTgATCgTgggAgCTTA3’
HPA-24R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCCAgTggCTCCAACACACATC3’
(17)HPA-25bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-25F:5’TgTAAAACgACggCCAgTATgCCAgCTTCTCTgCATTT3’
HPA-25R:5’CAggAAACAgCTATgACCCCTCgCCAAAATCTCAACAT3’
(18)HPA-28bw抗原系统的基因序列的扩增引物，
HPA-28F:5’TCTAAAAgCTgCggAATTgTCAgTgTggCATgCTCTTTgT3’
HPA-28R:5’TCCAAACTCATCAATgTATCTgTTCTgCTCCCTCTCACCT3’，
所述6条寡核苷酸测序引物序列如下：
M13F:5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
M13R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
PCMVF-BD:5’-TCTAAAAgCTgCggAATTgT-3’
PCMVR:5’-TCCAAACTCATCAATgTATC-3’
pDC316F:5’-ACgTgggTATAAgAggCg-3’
pDC316R:5’-CgATgCTAgACgATCCAg-3’。
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