CN104152542B - 肿瘤abl1基因位点分型检测试剂盒、使用方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒、使用方法及应用，所述检测试剂盒包括：PCR试剂和LDR试剂，所述的PCR试剂包括一对PCR正向引物和反向引物、双蒸水、聚合酶、聚合酶配套缓冲液、dNTP和MgCl2；所述正向引物:5’‑CACCATGGAGGTGGAAGAGT‑3’；所述反向引物:5’‑TCTGAGTGGCCATGTACAGC‑3’。本专利在测序仪上实现用PCR‑LDR技术检测ABL1了基因位点，实现PCR‑LDR技术在临床的实验。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，特别涉及肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒、使用方法及应用。
背景技术
格列卫（伊马替尼）是一种酪氨酸激酶抑制剂，能抑制慢性粒细胞白血病患者因费城染色体异常而产生的Bcr-Abl酪氨酸激酶的活性。目前格列卫已经成为国际上一线治疗慢性期成人Ph+ 慢性粒细胞性白血病的首选治疗方法。然而随着治疗的不断进行，发生格列卫耐药的比率也越来越高，格列卫耐药是肿瘤细胞在格列卫作用下，药物靶基因 c-abloncogene 1（ABL1）基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对酪氨酸激酶的抑制作用下降或消失。从而丧失抗肿瘤作用。
连接酶检测反应（ligase detection reaction, LDR）是近年来发展的一种核酸检测技术，是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。主要应用于单核苷酸检测领域，如单核苷酸多态性检测（SNP）（Detection of HLA Polymorphisms by Ligase DetectionReaction and a Universal Array Format: A Pilot Study for Low ResolutionGenotyping. Clarissa Consolandi, Elena Busti, Cinzia Pera, et al; HumanImmunology (2003) 64,168–178）。
近几年，又出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术关联用于基因多态性位点检测（Norman P. Gerry1 et al., J. Mol. Biol.(1999) 292, 251-262；U.S. Pat. Pub. No. 2003/0032016A1）。同时，随着LDR技术的逐步成熟，相关LDR检测产品也在不断问世，如肿瘤化疗疗效及毒副作用检测的LDR方案，心脑血管疾病易感基因LDR检测等产品。在乙型肝炎病毒耐药突变中，所有相关的位点都是单碱基突变，为LDR技术的应用提供了可能。目前，已经有人成功报道了将乙型肝炎病毒中的YMDD和YIDD用LDR技术在测序平台上进行了成功检测（A novel method based on ligasedetection reaction for low abundant YIDD mutants detection in hepatitis Bvirus. Zhenxian X. and, Junxua X,et al Hepatology Research 34 (2006) 150–155）。
发明内容
针对上述的需求，本发明的目的在于提供了肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒、使用方法及应用，本专利在测序仪上实现用PCR-LDR技术检测ABL1了基因位点，实现PCR-LDR技术在临床的实验，同时也为实现PCR-LDR多基因位点打下基础，能够也为实现多基因相关位点分型做好准备。
本发明检测ABL1基因位点的原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
LDR技术原理：LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。并通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。
ABL1检测序列如SEQ ID NO.1所示:
CCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGAGGTGTACGAGGGCGTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGGAGGTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTAGTGCAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC/TTGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTGCTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTAGAGAAGAAAAACTTCATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTAGCTGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACC
肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒，该检测试剂盒包括：PCR试剂和LDR试剂，所述的PCR试剂包括一对PCR正向引物和反向引物、双蒸水、聚合酶、聚合酶配套缓冲液、dNTP和MgCl2；
所述正向引物如SEQ ID NO.2所示:5’-CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3’；
所述反向引物如SEQ ID NO.3所示:5’-TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3’。
所述LDR试剂包括相关位点的荧光探针、检测探针、双蒸水、Taq连接酶和连接酶配套缓冲液；所述聚合酶为Taq酶。
所述LDR所用荧光探针序列为如SEQ ID NO.4所示：
5’-P-TGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCtacctacctacctacc-FAM-3’。
所述LDR所用检测探针序列为：如SEQ ID NO.5所示5’-acctacctacctaccCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC-3’和如SEQ ID NO.6所示5’-ctacctacctacctaccCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAT-3’，
所述连接产物长度分别为82和84。
所述荧光标记的一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度，所述荧光探针在3’进行荧光标记和5’端进行磷酸化标记；所述荧光探针的荧光基团为5-FAM、6-FAM、TAMRA、HEX、TET、JOE、VIC、NED、ROX、D1、D2、D3或D4。
所述检测探针的一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度，所述检测探针根据突变位点的需要进行设计，检测探针为2-4根探针，检测探针中的3’端为检测位点。
肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA，以待测样品基因组DNA为模板进行PCR扩增：所用PCR引物为一对正向引物和反向引物，其PCR产物中含有检测相关位点，
正向引物如SEQ ID NO.2所示： 5’-CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3’，
反向引物如SEQ ID NO.3所示： 5’-TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3’；
（2）PCR的扩增产物进行LDR扩增；
（3）用测序仪的Genescan功能对LDR产物进行测试，分析得到的检测数据和扩增曲线图。
所述步骤（1）中待测样品基因组DNA提取为常规的血基因组抽提方法。
肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒在检测ABL1基因中的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明肿瘤ABL1基因位点分型检测试剂盒采用PCR关联LDR方法（聚合酶链式反应关联连接酶检测反应）进行检测，本发明的试剂盒能够方便检出ABL1的各种基因分型，得到的结果具有可靠、稳定、操作简单、快速的特点，简化了传统PCR测序检测方法中，由于产物纯化和沉淀等繁琐步骤造成的检测时间长的问题，本发明的试剂盒具有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为实施例1的检测结果图。
图2为实施例2的检测结果图。
图3为实施例3的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
ABL1基因位点分型的检测方法步骤如下
（1）PCR扩增：
将格列卫耐药病例外周血基因组DNA，进行PCR扩增，所用PCR引物为一对正向引物和反向引物，
正向引物如SEQ ID NO.2所示： 5’-CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3’;
反向引物如SEQ ID NO.3所示： 5’-TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3’;
PCR各组分体系（见表2）：
表2
PCR反应程序：95℃15分钟变性和酶激活，94℃15秒变性，55℃30秒退火，72℃30秒延伸，循环35次；最后72℃5分钟延伸使反应产物扩增充分。
（3）对PCR的扩增产物进行LDR扩增：
各样本LDR体系（见表3）
表3
LDR反应程序：94℃2分钟充分变性，94℃15秒变性，55℃2分钟连接，循环15次。
（3）用测序仪的Genescan功能对步骤2中LDR产物进行测试（以ABI3130测序仪为标准），按照ABI3130测序仪要求，将所有阳性阴性LDR产物加入到上游体系中，上机电泳分析。整个测序仪检测25分钟后，将所得的结果导入到genemapper或相关软件中进行分析。检测结果见图1。测试中的试剂及其用量为去离子甲酰胺9μL；LDR产物1μL；内参0.5μL。
实施例2
将实施例1中的格列卫耐药病例外周血基因组DNA换成杂合子外周血基因组DNA，其他相同。检测结果见图2。
实施例3
将实施例1中的格列卫耐药病例外周血基因组DNA换成格列卫敏感病例外周血基因组DNA，其他相同。检测结果见图3。
从图1-3中可分析得出：
| 样本 | ABL1 |
| 样本1：格列卫耐药病例外周血基因组DNA | T T |
| 样本2：杂合子外周血基因组DNA | C T |
| 样本3：格列卫敏感病例外周血基因组DNA | C C |
从图1-3中可以看出，样本1在84bp处见单一峰，ABL1基因型为TT; 样本2在82bp及84bp处有双峰，ABL1基因型为CT; 样本3在82bp见单峰，ABL1基因型为CC。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (1)
1.肿瘤ABL1 基因位点分型检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括：PCR 试剂和
LDR 试剂，所述的PCR 试剂包括一对PCR 正向引物和反向引物、双蒸水、聚合酶、聚合酶配套缓冲液、dNTP 和MgCl2 ；
所述正向引物如SEQ ID NO.2 所示:5’-CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3’；
所述反向引物如SEQ ID NO.3 所示:5’-TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3’；
所述LDR试剂包括相关位点的荧光探针、检测探针、双蒸水、Taq 连接酶和连接酶配套缓冲液；所述聚合酶为Taq 酶；
所述的相关位点为下述序列中斜体的位点：
C C C C A A C T A C G A C A A G T G G G A G A T G G A A C G C A C G G A CA T C A C C A T G A A G C A C A A G C T G G G C G G G G G C C A G T AC G G GG A G G T G T A C G A G G G C G T G T G G A A G A A A T A C A G C C T G A C GG T G G C C G T G A A G A C C T T G A A G G A G G A C A C C A T G GA G G T GG A A G A G T T C T T G A A A G A A G C T G C A G T C A T G A A A G A G A T CA A A C A C C C T A A C C T A G T G C A G C T C C T T G G G G T CT G C A C CC G G G A G C C C C C G T T C T A T A T C A T C A C/T T G A G T T C A T G A CC T A C G G G A A C C T C C T G G A C T A C C T G A G G G A GT G C A A C C GG C A G G A G G T G A A C G C C G T G G T G C T G C T G T A C A T G G C C A CT C A G A T C T C G T C A G C C A T G G A G T A C C T A G AG A A G A A A A AC T T C A T C C A C A G A G A T C T T G C T G C C C G A A A C T G C C T G G TA G G G G A G A A C C A C T T G G T G A A G G T A G C TGATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACC；
所述LDR所用荧光探针序列为：
5’-P-TGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCTACCTACCTACCTACC-FA M-3’；
所述LDR 所用检测探针序列为：如SEQ ID NO.5 所示5’-ACCTACCTACCTACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC-3’和如SEQ ID NO.6 所示5’-CTACCTACCTACCTACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAT-3’，试剂盒反应后产物长度分别为82bp和84bp。
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