CN101545013B - 一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒 - Google Patents
一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测方法及其试剂盒，检测方法包括下列步骤：DNA抽提；所提取DNA进行PCR扩增：所用PCR引物为两对正向引物和反向引物，其PCR产物中含有所有耐药相关位点；对PCR的扩增产物进行LDR扩增：所用探针为相关位点的探针包括荧光标记探针和检测探针；测序仪对LDR产物进行分析，判断各耐药位点的基因型；所述多重耐药位点为拉米夫定，米夫定，阿德福韦和恩替卡韦的耐药位点。本发明结果可靠稳定、操作简单、快速，能够方便检出各种乙型肝炎病毒的耐药情况，对乙型肝炎病毒患者提供临床个体化用药指导，降低药物的无效性，减少患者的用药次数，从而减轻患者的痛苦和经济负担。
Description
技术领域
本发明属生物技术检测领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测方法及其试剂盒。
背景技术
慢性乙型肝炎是目前最严重的健康问题之一，全球约有20亿人曾感染过HBV，我国属HBV感染高流行区，中国目前有1.3亿乙肝病毒携带者，3000多万乙型肝炎病人。乙型肝炎病毒是一种高变异病毒，受免疫压力和各种抗病毒药物治疗诱导而发生变异，乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒多聚酶(Pol)基因P基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。
核苷酸类似物是目前临床上治疗乙肝的重要抗病毒药物，此类药物可直接抑制乙型肝炎病毒DNA复制，进而改善肝脏组织学病变，延缓乙肝病情进展，减少合并症的发生，为慢性乙肝的治疗带来了突破性的进展。但是随着临床应用的进展，在核苷酸类似物治疗中乙型肝炎病毒的变异已成为一个突出的问题。拉米夫定是嘌呤核苷类药物，自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒P基因变异有关，不同的核苷酸类似物耐药株的变异位点是不一致的。如拉米夫定耐药相关突变位点为D区M204V/I、B区L180M，阿德福韦相关突变位点为D区N236T、B区A181V，替比夫定为M204I，L180M(Hiroshi Y.and Kazuhiko K.J.Gastroenterol.(2007)42，329-335)。病毒只需要1个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M+M204I/V)，同时出现A184G或S202I或M250V突变，也就是说对恩替卡韦耐药的产生需要3个位点突变，说明恩替卡韦具有较高耐药基因屏障。在这些核苷酸类似物中，随着用药时间推移，发生耐药的几率是不尽相同的。其中拉米夫定由于上市时间最早，因此产生耐药的几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4年内都维持在1.1％，但是对于已产生拉米夫定耐药的患者，恩替卡韦耐药几率是：治疗1年1.4％，2年9％，3年15％-19％。
但是，临床上乙型肝炎病毒耐药现象日趋严重，而传统的突变位点检测技术如PCR-RFLP、PCR-SSP、SSOP等方法操作繁琐，成本昂贵，不易临床推广和操作，因此，需要开发乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒，可用于体外检测乙型肝炎病毒相关耐药位点的基因型，从而判断患者所携带的乙型肝炎病毒对何种药物耐药，达到个体化用药的效果。
连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)是近年来发展的一种核酸检测技术，是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。主要应用于单核苷酸检测领域，如单核苷酸多态性检测(SNP)(Detection of HLA Polymorphisms by Ligase Detection Reaction and aUniversal Array Format：A Pilot Study for Low Resolution Genotyping.Clarissa Consolandi，Elena Busti，Cinzia Pera，et al；Human Immunology 64，168-178(2003))。近几年，又出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术关联用于基因多态性位点检测(Norman P.Gerryl et al.，J.Mol.Biol.(1999)292，251-262，U.S.Pat.Pub.No.2003/0032016A1)。同时，随着LDR技术的逐步成熟，相关LDR检测产品也在不断问世，如肿瘤化疗疗效及毒副作用检测的LDR方案，心脑血管疾病易感基因LDR检测等产品。在乙型肝炎病毒耐药突变中，所有相关的位点都是单碱基突变，为LDR技术的应用提供了可能。目前，已经有人成功报道了将乙型肝炎病毒中的YMDD和YIDD用LDR技术在测序平台上进行了成功检测(A novel method based on ligase detection reaction for lowabundant YIDD mutants detection in hepatitis B virus.Zhenxian X.and，Junxua X，et alHepatology Research 34(2006)150-155)。但随着各类药物的应用，除了拉米夫定的YMDD/YIDD位点，包括替米夫定，阿德福韦和恩替卡韦的耐药位点进行检测成为必须，本发明提供了多重PCR及多重LDR技术方法，在测序仪上实现了多个位点的同时检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服目前只能单耐药基因位点检测且检测技术操作繁琐的缺点，提供一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测方法。
本发明检测乙肝耐药位点的原理：
1.PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
2、LDR技术原理：
LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。并通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。
表1乙型肝炎病毒多耐药基因相关检测位点
替米夫定是在拉米夫定的基础上开发出来的一种药，所以突变位点也是一致的。本发明提供的一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测方法具体包括下列步骤：
(1)乙型肝炎病毒血清进行DNA抽提；
(2)提取DNA进行PCR扩增：所用PCR引物为两对正向引物和反向引物，其PCR产物中含有所有耐药相关位点，所述多重耐药位点为拉米夫定、替米夫定、阿德福韦和恩替卡韦的耐药位点；
正向引物1 CTACCAGCACGGGACCATGC
反向引物1 CAAGATGTTGTACAGACTTGG
正向引物2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA
反向引物2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG
(3)PCR的扩增产物进行LDR扩增：所用探针为相关位点的探针包括荧光标记探针和检测探针，所述耐药相关突变位点为：rtL180M，YMDD/YIDD，YVDD，rtA181V/T，rtN236T，rtT184G，rtS202I，rtM250V；
(4)用测序仪的Genescan功能对LDR产物进行分析，判断各耐药位点的基因型，提供具体药物相关位点的信息。
步骤1所述的乙肝病毒DNA提取为常规的乙型肝炎病毒浓缩裂解方法。
步骤2所述的PCR扩增的反应体系为：PCR Buffer 10×2μL、2.4μL50mM的MgCl2、2μL10mM的dNTP Mix、0.5μL2U/μL DNA聚合酶、2μL103-107滴度的DNAtemplate、2μL2mM的引物、9.1μL ddH2O；95℃15分钟变性和酶激活，94℃15秒变性，50-60℃30秒-1分30秒退火，72℃30秒-1分30秒延伸，循环35次；最后72℃5分钟延伸。
步骤3所述的LDR扩增的反应体系为：1μL连接酶配套缓冲液、1μL浓度为2mM的探针、0.2μL浓度为2U/μL的Taq连接酶、1μL的PCR产物、7μL ddH2O；反应过程为94℃ 2分钟充分变性，94℃15秒变性，55℃2分钟连接，循环15次。
步骤3所述荧光标记探针的荧光基团为5-FAM、6-FAM、TAMRA、HEX、TET、JOE、VIC、NED、ROX、D1、D2、D3或D4。
LDR所用探针为包括相关位点的探针，这些探针涉及到两种探针，第一种探针是荧光标记探针，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度，同时进行荧光标记；第二种探针为检测探针，包含两部分，其中一部分为和模板配对部分，另一部分则可引入随机系列来调整LDR产物长度。其中第二种探针根据突变位点的需要进行设计，它可以为2-4根探针，探针中的3’端为检测位点。每组相关位点的探针，针对核酸单碱基变化来设定检测探针的长度，以实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度。
LDR所用荧光探针和检测探针见表2：
表2 LDR所用探针
YVDD是YMDD的一种突变，YMDD有YIDD和YVDD两种突变；rtT184G因为是两种碱基突变，将其它放在一个位置上)
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种PCR关联LDR测序检测技术的乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒。本发明的检测试剂盒包括：
(1)DNA抽提试剂：为常规的DNA浓缩裂解试剂盒，包括浓缩液，裂解缓冲液；
(2)PCR试剂：包括两对PCR正向引物和反向引物、双蒸水、聚合酶(Taq酶)，聚合酶配套缓冲液、dNTP与镁离子(MgCl2)；
(3)LDR试剂：包括相关位点的荧光探针、双蒸水、Taq连接酶和连接酶配套缓冲液；
(4)标准品：野生型质粒DNA。
本发明能够方便检出各种乙型肝炎病毒的耐药情况，对乙型肝炎病毒患者提供临床个体化用药指导，降低药物的无效性，减少患者的用药次数，从而减轻患者的痛苦和经济负担。
本发明试剂盒采用PCR关联LDR方法(聚合酶链式反应关联连接酶检测反应)进行检测，具有结果可靠稳定、操作简单、快速的特点，简化了传统的PCR测序检测方法中，产物纯化和沉淀等繁琐步骤，减少检测时间，有较大的临床应用价值。
附图说明
图1为实施例1的实验结果；
图2为实施例2的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测方法步骤如下：
1.乙型肝炎病毒DNA抽提
准备100μL含乙型肝炎病毒血清，加入浓缩液100μL，12000rpm离心10分钟；弃上清；加入25μL裂解缓冲液混匀，100℃10分钟裂解；最后12000rpm离心10分钟，上清即为所用的乙肝样本。
2.PCR反应：所提取DNA进行PCR扩增：所用PCR引物为两对正向引物和反向引物，
正向引物1CTACCAGCACGGGACCATGC
反向引物1CAAGATGTTGTACAGACTTGG
正向引物2GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA
反向引物2TACATGCATATAAAGGCATTGAGG
PCR各组分体系见下表：
| 试剂 | 浓度 | 体系μL |
| ddH2O | 9.1 | |
| 聚合酶缓冲液 | 10× | 2 |
| Mgcl2 | 50mM | 2.4 |
| dNTP | 10mM | 2 |
| 聚合酶 | 2U/μL | 0.5 |
| 病例样本 | 103-107滴度 | 2 |
| 引物 | 2mM | 2 |
PCR反应程序：95℃15分钟变性和酶激活，94℃15秒变性，55℃30秒退火，72℃30秒延伸，循环35次；最后72℃5分钟延伸使反应产物扩增充分。
3.对PCR的扩增产物进行LDR扩增，所用探针见表2。
各样本LDR体系见下表：
| 试剂 | 浓度 | 体系μL |
| ddH2O | 7 | |
| 连接酶配套缓冲液 | 10× | 1 |
| Taq连接酶 | 2U/μL | 0.2 |
| 探针 | 2mM | 1 |
| PCR产物 | 1 |
LDR反应程序：94℃2分钟充分变性，94℃15秒变性，55℃2分钟连接，循环15次。
4.测序上样的体系(以ABI3130测序仪为标准)：
| 试剂 | 体系μL |
| 去离子甲酰胺 | 9 |
| LDR | 1 |
| 内参 | 0.5 |
按照ABI3130测序仪要求，将所有阳性阴性LDR产物加入到上游体系中，上机电泳分析。整个测序仪检测25分钟后，将说得的结果导入到genemapper或相关软件中进行分析。
5.实验结果(图1)
从图1结果分析，此样本检测结果是：
实施例2
乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒试剂的组成和配制
1.乙型肝炎病毒DNA抽提试剂，常规的乙型肝炎病毒浓缩裂解方法。
2.PCR试剂：见下表
| 试剂 | 浓度 | 样本体系μL | 阳性对照μL | 阴性对照μL |
| ddH2O | 9.1 | 9.1 | 11.1 | |
| 聚合酶缓冲液 | 10× | 2 | 2 | 2 |
| Mgcl2 | 50mM | 2.4 | 2.4 | 2.4 |
| dNTP | 10mM | 2 | 2 | 2 |
| 聚合酶 | 2U/μL | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 病例样本 | 103-107滴度 | 2(样本) | 2(质粒) | |
| 引物 | 2mM | 2 | 2 | 2 |
PCR反应程序：95℃15分钟变性和酶激活，94℃15秒变性，50℃1分钟退火，72℃1分钟延伸，循环35次；最后72℃5分钟延伸，使反应产物扩增充分。所用引物
正向引物1 CTACCAGCACGGGACCATGC
反向引物1 CAAGATGTTGTACAGACTTGG
正向引物2 GTCCCTTTTTACCTCTATTACCA
反向引物2 TACATGCATATAAAGGCATTGAGG
3、LDR试剂：见下表
| 试剂 | 样本体系μL | 阳性对照μL | PCR阴性对μL | LDR阴性对照μL | |
| ddH2O | 7 | 7 | 7 | 8 | |
| 连接酶配套缓冲液 | 10× | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 探针 | 2mM | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Taq连接酶 | 2U/μL | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| PCR产物 | 1(质粒PCR产物) | 1(质粒PCR产物) | PCR阴性管产物 |
LDR反应程序：94℃2分钟充分变性，94℃15秒变性，55℃2分钟连接，循环15次。所用探针见表2。
4、测序上样的体系(以ABI3130测序仪为标准)：
整个电泳时间为25分钟，其中收集数据时间10分钟
使用仪器：微量移液器及tip头(枪头)，DNA扩增仪，ABI3130测序系统，高速离心机。
5.实验结果见图2
从图2结果分析，此样本检测结果是：
阴性结果是没有结果。
Claims (1)
1.一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型的检测试剂盒，其特征在于包括下列组成：
(1)DNA抽提试剂：DNA浓缩裂解试剂，包括浓缩液和裂解缓冲液；
(2)PCR试剂：包括两对PCR正向引物和反向引物、Taq聚合酶、聚合酶缓冲液、
dNTP和MgCl2；其中，所用的两对PCR引物序列5’-3’如下：
正向引物1 CGTACCAGGGCACGACCATC
反向引物1 GGTTCAGACATGTTGTAGAAC
正向引物2 ACCATTATCTCCATTTTTCCCTG
反向引物2 GGAGTTACGGAAATATACGTACAT；
(3)LDR试剂：包括相关位点的荧光探针、Taq连接酶和连接酶缓冲液；
其中，荧光标记探针和检测探针序列5’-3’为：
rtL180M
荧光标记探针：TCCATCCATCCATCCATCCAGAGTCAGGCAAAGAG
检测探针1：TACCGAGTCAAATGATCCATCCATCCATCCATCCA
检测探针2：AACCGAGCTAAATGAAATCCATCCATCCATCCATCCA
YMDD/YIDD
荧光标记探针：AATCCATCCATCCATCCATCCACCGAAAGTCAATATA
检测探针1：CCTACTACACCATAAAATCCATCCATCCATCCATCCA
检测探针2：ACTACTACACCATAAATCCATCCATCCATCCATCCATCCA
YVDD
荧光标记探针：ATCCATCCATCCATCCATCCAAACCGAAAGTCAATA
检测探针：CACCCACTACACCATATCCATCCAATCCATCCATCCATCCATCCA
rtA181V
荧光标记探针：ATCCATCCAATCCATCCATCCATCCATCCAGTGATCATTTGACTC
检测探针1：GGTTCTCTTTGCCTGATCCAATCCATCCATCCATCCATCCA
检测探针2：AGTTCTCTTTGCCTGATCATCCATCCATCCATCCATCCA
rtN236T
荧光标记探针：CCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCACCCATATGTAAATT
检测探针1：GAGGGAGTGTTTTGTTCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
检测探针2：TGGGAGTGTTTTGTTATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
rtT184G
荧光标记探针：ATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCAGAACCGAGTCAAAC
检测探针1：CATCACGGTAAACAATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
荧光标记探针CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCAGAACCGAGTCAAAT
检测探针2：GATCACGGTAAACAACATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCrtS202I
荧光标记探针：CCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCTGACAAACCGAAAGT
检测探针1：AAATATACCTACTACCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
检测探针2：CAATATACCTACTACATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
rtM250V
荧光标记探针：ATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATGAGGGAATTGAAA
检测探针1：CACCCAATACATTAACCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
检测探针2：TACCCATATACATTAAATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCC
(4)标准品：野生型HBV DNA。
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