CN108004312B - 检测心血管疾病相关基因多态性的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，包括分别针对下述SNP位点的引物：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A4 1334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C。本发明还公开了包括该引物组的试剂盒以及利用该引物组的基因多态性检测方法。本发明的引物组具有特异性强、检测灵敏度好、准确性高的优点。本发明的检测方法特异性好、灵敏度高、费用低廉、可实现多个位点同时检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种检测心血管疾病相关基因多态性的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
心血管疾病不但是全球也是我国在众多疾病中导致死亡的头号病因。目前我国有约2.9亿心血管病患者，每年造成350多万人的死亡。随着我国经济的不断发展，人民生活水平的提高，饮食中油脂的比例不断增高，加上吸烟，酗酒等不良嗜好，心血管疾病的流行趋势逐渐趋于年轻化，形式并不容乐观。
随着人类进入精准医疗的时代，基因检测变得越来越普及，也更便宜。人类对越来越多的基因进行了更深入的解读，基因与疾病，基因与药物的关系也正变得越来越清晰。因此越来越多的医疗领域也都引入基因检测进行辅助治疗，同病不同治的格局正逐步实现。除目前流行的肿瘤基因检测外，心脑血管病等也引入了基因检测进行辅助治疗。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。我们都知道，有时一种治疗药物对一些人非常有效，对另一些人则完全无效。这其实就是由于他们基因组中的SNP存在的差异造成的。如华法林是临床常用治疗血栓性疾病的药物，与它的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中细胞色素P4502C9基因(CytochromeP4502C9，CYP2C9)的基因多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素之一。因此，使用华法林前进行CYP2C9的基因多态性分析就是一个必要的选择。
现在对于单个SNP位点的检测主要有sanger测序，荧光定量PCR，ARMs-PCR等，而对于多个SNP位点的同时检测使用上述方法则会增加很大的工作量和花费；因此目前对于多个SNP位点的检测主要采用基因芯片或者二代测序的技术，但是这两种技术的设计成本高和检测费用昂贵。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、费用低廉、可实现多个位点同时检测相关基因多态性的方法，这已成为了急需解决的问题。
发明内容
本发明的发明目的是针对现有技术的缺陷，提供一种检测心血管疾病相关基因多态性的引物组、试剂盒及方法。
一方面，本发明提供了一种检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，包括分别针对下述SNP位点的引物：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2421A、CYP3A4 1334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1800C；
其中，
针对SLCO1B1 521C位点的引物是：包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLCO1B1 521T位点的引物是：包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLCO1B1 463A位点的引物是：包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLCO1B1 463C位点的引物是：包括SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLCO1B1 388A位点的引物是：包括SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLCO1B1 388G位点的引物是：包括SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCA1 656A位点的引物是：包括SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCA1 656G位点的引物是：包括SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的反向引物；
针对CYP2C9 1075C位点的引物是：包括SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的反向引物；
针对CYP2C9 1075A位点的引物是：包括SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCB1 1236T位点的引物是：包括SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的正向引物；
针对ABCB1 1236C位点的引物是：包括SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCB1 2677A位点的引物是：包括SEQ ID NO:24所示核苷酸序列的正向引物；
针对ABCB1 2677G位点的引物是：包括SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCB1 2677T位点的引物是：包括SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:28所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCG2 421C位点的引物是：包括SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的反向引物；
针对ABCG2 421A位点的引物是：包括SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:32所示核苷酸序列的反向引物；
针对CYP3A4 1334C位点的引物是：包括SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的反向引物；
针对CYP3A4 1334T位点的引物是：包括SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:36所示核苷酸序列的反向引物；
针对CYP3A4 653G位点的引物是：包括SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的正向引物；
针对CYP3A4 653C位点的引物是：包括SEQ ID NO:38所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的反向引物；
针对SLC10A1 800T位点的引物是：包括SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的正向引物；
针对SLC10A1 800C位点的引物是：包括SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的正向引物和包括SEQ ID NO:42所示核苷酸序列的反向引物。
另一方面，本发明提供了一种检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其包括前述的引物组。
另一方面，本发明提供了一种检测心血管疾病相关基因多态性的方法，包括：
步骤S1：将前述的引物组随机分为1至23组，在每组中，以待检测DNA样本作为模板进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；
步骤S2：将PCR扩增产物混合，随后变性获得变性产物；
步骤S3：采用毛细管电泳法对变性产物进行检测，确定SNP位点及其基因型。
另一方面，本发明提供了前述的引物组在制备用于检测心血管疾病的药物中的用途。
相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：本发明的引物组具有特异性强、检测灵敏度好、准确性高的优点，实现了心血管疾病相关基因多态性的检测。本发明的检测方法特异性好、灵敏度高、费用低廉、可实现多个位点同时检测。
附图说明
图1是示出了实施例2中引物序列筛选检测的结果图。
图2是示出了实施例3中引物序列筛选检测的结果图。
图3示出了实施例4中引物的特异性检测的结果图。
图4示出了实施例5中心血管疾病相关基因多态性检测的结果图。
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。除非另有说明，否则本发明中涉及的技术术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
心血管疾病相关基因
本发明涉及了人类基因组中7个心血管疾病相关基因的11个SNP位点，具体是：SLCO1B1(521T/C，388A/G，463C/A)，ABCA1(c.656G/A)，CYP2C9(1075A/C)，ABCB1(c.1236T/C，c.2677T/G/A))，ABCG2(421C/A)，CYP3A4(1334T>C，c.653C>G)，和SLC10A1(800C/T)。本发明中SNP位点是依据NCBI中的SNP数据库的信息来命名的。
SLCO1B1是有机阴离子转运多肽1B1编码基因。本发明涉及了SLCO1B1的3个SNP位点。其中，SLCO1B1 521T/C在SNP数据库中的rs号为rs4149056，表示SLCO1B1基因编码区的第521位的碱基存在T与C的变化；SLCO1B1 388A/G在SNP数据库中的rs号为rs2306283，表示SLCO1B1基因编码区的第388位的碱基存在A与G的变化；SLCO1B1 463C/A在SNP数据库中的rs号为rs11045819，表示SLCO1B1基因编码区的第463位的碱基存在C与A的变化。也即，SLCO1B1 521T表示SLCO1B1基因编码区的第521位的碱基是T，SLCO1B1 521C表示SLCO1B1基因编码区的第521位的碱基是C，其余命名可以此类推。
ABCA1是ATP结合盒转运蛋白A1编码基因。本发明涉及了ABCA1的1个SNP位点，其中，ABCA1c.656G/A在SNP数据库中的rs号为rs2230806，表示ABCA1cDNA序列第656位的碱基存在G与A的变化。
CYP2C9是细胞色素P4502C9编码基因。本发明涉及了CYP2C9的1个SNP位点，其中，CYP2C9 1075A/C在SNP数据库中的rs号为rs1057910，表示CYP2C9基因编码区的第1075位的碱基存在A与C的变化。
ABCB1是ATP结合盒转运蛋白B1编码基因。本发明涉及了ABCB1的2个SNP位点。其中，ABCB1c.1236T/C在SNP数据库中的rs号为rs1128503，表示ABCB1cDNA序列第1236位的碱基存在T与C的变化；ABCB1c.2677T/G/A在SNP数据库中的rs号为rs2032582，表示ABCB1cDNA序列第1236位的碱基存在T或C的变化。
ABCG2是ATP结合盒转运蛋白G2编码基因。本发明涉及了ABCG2的1个SNP位点，其中，ABCG2 421C/A在SNP数据库中的rs号为rs2231142，表示ABCG2基因编码区的第421位的碱基存在C与A的变化。
CYP3A4是细胞色素P450 3A4编码基因。本发明涉及了CYP3A4的2个SNP位点。其中，CYP3A4 1334T>C在SNP数据库中的rs号为rs4986910，表示CYP3A4基因编码区的第1334位的碱基由T变为C；CYP3A4c.653C>G在SNP数据库中的rs号为rs55901263，表示CYP3A4cDNA序列第653位的碱基由C变为G。
SLC10A1是慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体编码基因。本发明涉及了SLC10A1的1个SNP位点。其中，SLC10A1 800C/T在SNP数据库中的rs号为rs2296651，表示SLC10A1基因编码区的第800位的碱基存在C与T的变化。
心血管疾病是我国第一大病症，尤其是冠心病和中风的发病率一直处于明显上升的趋势，因此他汀类药物的使用越来越广泛，但是近年来的临床研究表明，具有不同基因型的患者在使用他汀类药物进行临床治疗时会出现不同的临床效果。本发明选取的7个基因均为他汀类药物代谢相关的基因，针对这7个基因的SNP位点来设计引物，并将这些引物用于基因多态性检测，检测灵敏度好、准确性高，能够获得极其有价值的中间信息，具有重要的临床指导意义。
引物组
本发明针对上述人类基因组中7个心血管疾病相关基因的11个SNP位点的所有可能基因型来设计引物，从而提供了一组能够同时检测上述基因多态性的引物组。具体地，本发明针对的SNP位点的所有可能形式是：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A4 1334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C。
在一种具体实施方式中，本发明提供的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组包括含有下述核苷酸序列的引物：
在一些具体实施方式中，上述任一种或多种正向引物(F)和/或反向引物(R)的3’端和/或5’端可进一步增加3至9个碱基，同样能够实现对上述心血管疾病相关基因多态性的检测。例如，5’-ACGAAGCATATTACCCATGACCG-3’或5’-TATTCCACGAAGCATATTACCCATGACCG-3’也能够实现与5’-AAGCATATTACCCATGACCG-3’(SEQ ID NO:1)相似的功能。
在一种优选的具体实施方式中，本发明提供的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组包括下述引物：
在一些具体实施方式中，针对上述SNP位点的引物中的任意一者或多者的正向引物和/或反向引物的5’端由下述任意一种荧光修饰基团所修饰：FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)、TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明)、HEX(Hexachlorofluorescein，六氯-6-甲基荧光素)、ROX(Carboxy-X-Rhodamine，羧基-X-若丹明)。在一些优选的具体实施方式中，SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:84所示核苷酸序列的5’端分别由下述任意一种荧光修饰基团所修饰：FAM、TAMRA、HEX、ROX。
在一种特别优选的具体实施方式中，本发明提供的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组由表1中的引物组成。
表1
试剂盒
本发明还提供了一种用于检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括了本发明提供的引物组。进一步，本发明的试剂盒还包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
在本发明的试剂盒中，本发明的引物组可分为若干管分装，例如，1管、2管、3管、……、23管，针对各SNP位点的引物任意组合均可使用。在一种优选的具体实施方式中，本发明的引物组可分为3管(Pool)分装。在一种更优选的具体实施方式中，本发明的试剂盒包括表1中的引物。在另一种更优选的具体实施方式中，在本发明的试剂盒包括的引物组的组合方式如表2所示。
表2
在本发明中，本发明的引物组以引物预混液的形式包括在本发明的试剂盒中。
在本发明的试剂盒中，PCR反应液包括扩增缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+。
在本发明的试剂盒中，阳性质控品包括分别含有下述位点的质粒：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A4 1334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C。前述的含有相应SNP位点的质粒可以是以市售质粒为骨架结构，采用常规生物学方法将靶标基因引入到相应位置而得到的重组质粒。
在本发明的试剂盒中，阴性质控品是ddH2O。
本发明的试剂盒中各组分配置的量可以由本领域技术人员根据预定目的来确定，包括任意配置量的上述各组分的试剂盒均在本发明的范围内。
本发明的试剂盒还可包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，所需结果例如是检测心血管疾病相关基因多态性。任选地，试剂盒还可含有其它适用组分，如测量工具、稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件。
心血管疾病相关基因多态性的检测方法
本发明还提供了一种心血管疾病相关基因多态性的检测方法，该方法包括如下步骤：
步骤S1：将本发明的引物组随机分为1至23组，在每组中，以待检测DNA样本作为模板进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；
步骤S2：将PCR扩增产物混合，随后变性获得变性产物；
步骤S3：采用毛细管电泳法对变性产物进行检测，确定SNP位点及其基因型。
在步骤S1中，本发明的引物组中各引物可任意组合，均可实施本发明的检测方法。优选地，本发明的引物组可分为3组，更优选地，本发明的引物组可以按在表2中列出的组合方式进行组合。
在步骤S1中，待检测DNA样本是人类基因组DNA样本。优选地，人类基因组DNA样本是口腔上皮脱落细胞DNA样本(例如，口腔拭子保存的口腔上皮脱落细胞DNA样本，或者漱口水保存的口腔上皮脱落细胞DNA样本)，或者EDTA抗凝外周血的DNA样本。
在步骤S1中，PCR扩增反应是多重PCR扩增反应。优选地，多重PCR扩增反应的条件是：阶段1，95℃预变性3分钟；阶段2，95℃变性15秒，55℃至62℃退火40秒(例如，55℃退火40秒，56℃退火40秒，57℃退火40秒，…，60℃退火40秒，61℃退火40秒，或62℃退火40秒)，72℃延伸40秒，共30至50个循环(例如，共30个循环，共31个循环，…，共40个循环，…，共49个循环，或共50个循环)；阶段3，72℃维持10至20分钟(例如，72℃维持10分钟，72℃维持11分钟，...72℃维持15分钟，…，72℃维持19分钟，或72℃维持20分钟)。更优选地，多重PCR扩增反应的条件是：阶段1，95℃预变性3分钟；阶段2，95℃变性15秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；阶段3，72℃维持20分钟。PCR扩增反应结束之后，在4-25℃(优选25℃)进行保温。
在步骤S2中，采用甲酰胺对混合后的PCR扩增产物进行变性，例如，按照1μL混合物加入到9μL甲酰胺中的比例将混合后的PCR扩增产物加入到甲酰胺中，进行变性(例如，在95℃条件下变性5分钟)，随后冰浴(例如2分钟)。
在步骤S3中，毛细管电泳法中涉及的各种参数、条件可以由本领域技术人员根据实际情况来确定。针对获得的检测结果，可以使用GENEMAPPERIDV3.2软件进行分析。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中采用的PCR反应液购买自Kapa biosystems公司。
实施例1：引物的设计
引物设计的原则及考虑因素：
1、长度：15bp至30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度，从而降低产物的特异性。
2、G+C含量：应在40％至60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5至10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G+C)+2×(A+T)。
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。
4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。
引物设计软件：Primer 5。
实施例2：引物序列筛选检测
(1)分3个反应管Pool 1、Pool 2、Pool 3，每个反应管中加入10ng人的基因组DNA(口腔上皮脱落细胞DNA样本)。
(2)以步骤(1)中加入的DNA样本为模板，采用实施例1中获得的PCR扩增引物(由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:42组成)进行多重PCR扩增。
其中，PCR扩增引物按照表2中的方式按等比例(即1:1(v))组合，震荡混匀；短暂离心后供使用。
其中，Pool 1、Pool 2、Pool 3中每个的PCR扩增反应体系是：引物预混液10μL，2XPCR MIX 12.5μL，模板(阳性质控品)1μL，ddH2O补足25μL，震荡混匀，短暂离心后，进行多重PCR扩增，PCR反应条件包括：阶段1：95℃3min；阶段2：(95℃15s；58℃40s；72℃40s)，30个循环；阶段3：72℃10min；阶段4：4℃保温。
(3)以步骤(2)纯化后的PCR扩增产物为模板，将Pool 1、Pool 2、Pool 3各取5μL混合成15μL的混合液，取1μL混合液加入到9μL的甲酰胺中，在95℃条件下变性5min后，冰浴2min；
(4)采用毛细管电泳技术进行检测，采用GENEMAPPERIDV3.2软件对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
本实施例中采用的阳性质控品由苏州泓迅生物科技有限公司合成，具体如表3所示，
表3
本实施例的检测结果如图1所示。
实施例3：引物序列筛选检测
本实施例与实施例2的区别仅在于步骤(2)中采用的PCR扩增引物由SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:84组成。本实施例的检测结果如图2所示。
从图1和图2得出的结果如表4所示。
表4
由图1和图2以及表4可以看出，实施例2和3所检测的引物组均得出了所有位点的分型信息。将图1和图2进行比较可以看出，实施例3中检测的引物组的位点间峰高一致性优于实施例2中检测的引物组，因此推荐由SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:84组成的引物组(表1所示引物组)为优选的序列信息。
实施例4：引物特异性检测
(1)分3个反应管Pool 1、Pool 2、Pool 3，每个反应管中加入配制好的质粒DNA组合，其中各质粒DNA按等比例配置。质粒DNA组合的加入量以最终的质粒DNA混合物中各种质粒的浓度为3×103个拷贝为准。检测引物特异性的质粒组合如表5所示。
表5
| 质粒名称 | 对应位点 | 质粒名称 | 对应位点 |
| TT01T | SLCO1B1 521T | TT08A | ABCB1 2677A |
| TT02C | SLCO1B1 388G | TT09G | ABCB1 2677G |
| TT03C | SLCO1B1 463C | TT10A | ABCG2 421A |
| TT05G | ABCA1 656G | TT11T | CYP3A4 1334T |
| TT06A | CYP2C9 1075A | TT12G | CYP3A4 653C |
| TT07C | ABCB1 1236C | TT13G | SLC10A1 800C |
(2)以步骤(1)中加入的质粒DNA为模板，采用表1所示的PCR扩增引物(按表2方式组合)进行多重PCR扩增。
其中，多重PCR扩增反应体系：引物预混液10μL，2X PCR MIX 12.5μL，模板1μL，ddH2O补足25μL，震荡混匀，短暂离心后，进行多重PCR扩增，多重PCR扩增反应的条件是：阶段1，95℃预变性3分钟；阶段2，95℃变性15秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；阶段3，72℃维持20分钟。阶段4，25℃保温。
(3)以步骤(2)纯化后的PCR扩增产物为模板，将Pool 1、Pool 2、Pool 3各取5μL混合成15μL的混合液，取1μL混合液加入到9μL的甲酰胺中，在95℃条件下变性5分钟后，冰浴2分钟。
(4)采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
结果如图3所示。由图3结果可以看出，电泳结果与加入的质粒类型一致，引物特异性很好。
实施例5：基因多态性的检测
(1)分3个反应管Pool 1、Pool 2、Pool 3，每个反应管中加入10ng待检测的人基因组DNA。
其中，待检测的人基因组DNA采用德诺杰亿(北京)生物科技有限公司的血液基因组提取试剂盒提取。具体方法如下：
1)裂解：取一个新的1.5mL离心管，加入200μL的抗凝血液样品(不足200μL时可用PBS或洗脱液EB补足)，再分别加入10μL的Proteinase K Solution和230μL的缓冲液GHH，以涡旋振荡器最大转速漩涡震荡10s后，置于55℃条件下反应5min。
2)结合：加入320μL的缓冲液GHB(其中已加入异丙醇)和20μL的磁珠液2，以涡旋振荡器最大转速漩涡震荡10min(或漩涡震荡10s后置于垂直混合仪上反应10min)。然后将离心管置于磁性分离器上放置2min，用移液器移去上清液并取下离心管。注：此步骤的磁性分离时间应不少于2min。
3)洗涤：(1)加入600μL漂洗液GDW(其中已加入无水乙醇)，漩涡震荡1min或用移液器缓慢吹打磁珠20次，使磁珠充分重悬，再将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。重复该步骤一次。(2)加入600μL漂洗液GDF(其中已加入无水乙醇)，漩涡震荡1min或用移液器缓慢吹打磁珠20次，使磁珠充分重悬，再于室温下静置1min后，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，用移液器移去上清液。注：步骤(2)应尽量除尽洗涤液。
4)干燥：保持离心管于磁性分离器上，于室温下静置10min后，取下离心管。
5)洗脱：加入100～200μL洗脱液EB，用移液器缓慢吹打磁珠50次，使磁珠充分重悬。然后于55℃条件下加热5min，将离心管置于磁性分离器上直至溶液澄清，转移上清液至新的离心管中，此即为纯化得到的基因组DNA。
(2)以步骤(1)中加入的待检测的人基因组DNA为模板，采用表1所述的PCR扩增引物按照表2所示的方法组合，进行多重PCR扩增。
其中，Pool 1、Pool 2、Pool 3中每个的PCR扩增反应体系是：引物预混液10μL；2XPCR MIX 12.5μL；模板(人基因组DNA)1μL；ddH2O补足25μL震荡混匀，短暂离心后，进行多重PCR扩增，多重PCR扩增条件包括：阶段1：95℃3min；阶段2：(95℃15s；60℃40s；72℃40s)，30个循环；阶段3：72℃20min；阶段4：25℃保温。
(3)以步骤(2)纯化后的PCR扩增产物为模板，将Pool 1、Pool 2、Pool 3各取5μL混合成15μL的混合液，取1μL混合液加入到9μL的甲酰胺中，在95℃条件下变性5min后，冰浴2min。
(4)反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERIDV3.2软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图4所示。结合图3，得出的检测结果如表6所示。
表6
从图3、4和表6可以看出，采用本发明的引物组能够有效实现多个位点同时检测，且检测灵敏度好、准确性高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 德诺杰亿(北京)生物科技有限公司
<120> 检测心血管疾病相关基因多态性的引物组、试剂盒及方法
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcatatta cccatgaccg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcaaagttt gcaaagtg 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcatacat gtggatatag gt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagacaaag ggaaagtgat ca 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatcactcaa tagagcatta a 21
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaatgtttt tcctatt 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttttccca ctatctcggg 20
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttacagtta caggt 15
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgttgaatt ttctgatgac tt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaaagtact ctggtaattt g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tattctaaag aaactaatag cg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aatgaatatc acaacaattt 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctgctgcag ccagtttcta ct 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtatttttg caaggctacc 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgagctttg tggcctaccc ag 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccagccgta cttttctaca aa 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgcacgagg tccagagatg cc 22
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcgaaaaca tggagttgc 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtggggaga aggtcgat 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtgattggca gaaaccgg 18
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcccactctg caccttcagg ttccga 26
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctctgcacct tcaggttccg g 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aagagtgggc acaaaccag 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agaaagaact agaagcta 18
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gataagaaag aactagaaga tg 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taagcatgaa aaagattgct 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tttagtttga ctcaccttcc cgga 24
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
taattaccca gaatatagca a 21
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctgacggtg agagaaaact cac 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccacattacc ttggagtctg cca 23
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagccgaaga gctgctgaga attt 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tttgcagaac tgcaggttca tc 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggacccagaa actgcattgg aac 23
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aattgattct ttggccc 17
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gttcatgaga gcaaaccgca 20
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cccctaagta agaaaccc 18
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atttgatttt ttggaacg 18
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttttaagatt tgattttttg gaacc 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgaggtctct agattgacaa aa 22
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccaaaatgtc caactctggt t 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gccaaaatgt ccaactctgg tc 22
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgttggcagg ctcaggtct 19
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tattccacga agcatattac ccatgaccg 29
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accatattgt caaagtttgc aaagtg 26
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggaatctggg tcatacatgt ggatataggt 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tttcaaaagt agacaaaggg aaagtgatca 30
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatcaaattt tatcactcaa tagagcatta a 31
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tctgtaagag tcaaatgttt ttcctatt 28
<210> 49
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atttaattct taccttttcc cactatctcg gg 32
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
attcagtgat gttcttacag ttacaggt 28
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
taaggtcgat gttgaatttt ctgatgactt 30
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aattgacaga aagtactctg gtaatttg 28
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gttacaggta ttctaaagaa actaatagcg 30
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
attttgctaa tgaatatcac aacaattt 28
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gtactcgctc tgctgcagcc agtttctact 30
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tgcttccagg tatttttgca aggctacc 28
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agaagtttct gagctttgtg gcctacccag 30
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctcccagcca gccgtacttt tctacaaa 28
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
atgctgtggt gcacgaggtc cagagatgcc 30
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttggggactt cgaaaacatg gagttgc 27
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggggcaggct ggtggggaga aggtcgat 28
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tgaacgtgtg attggcagaa accgg 25
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atttgtctgc ccactctgca ccttcaggtt ccga 34
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gtctgcccac tctgcacctt caggttccgg 30
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
attcgaagag tgggcacaaa ccag 24
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gcactgaaag ataagaaaga actagaagct a 31
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cactgaaaga taagaaagaa ctagaagatg 30
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttactgaata agcatgaaaa agattgct 28
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atcatattta gtttgactca ccttcccgga 30
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cttgctgtaa ttacccagaa tatagcaa 28
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tgggcactct gacggtgaga gaaaactcac 30
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gtttttccac attaccttgg agtctgcca 29
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tgttgcaagc cgaagagctg ctgagaattt 30
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
actgtcattt gcagaactgc aggttcatc 29
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tggaagtgga cccagaaact gcattggaac 30
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tgggcctaat tgattctttg gccc 24
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
caagtttcat gttcatgaga gcaaaccgca 30
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggggtggccc ctaagtaaga aaccc 25
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cttttaagat ttgatttttt ggaacg 26
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
caagctttta agatttgatt ttttggaacc 30
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
aatgtatgag gtctctagat tgacaaaa 28
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
actggatgcc aaaatgtcca actctggtt 29
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tggatgccaa aatgtccaac tctggtc 27
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
acttgcttgt tggcaggctc aggtct 26
Claims (19)
1.一种检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，包括分别针对下述SNP位点的引物：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A41334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C；
其中，
针对SLCO1B1 521C位点的引物是：由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:2所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLCO1B1 521T位点的引物是：由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:4所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463A位点的引物是：由SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:6所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463C位点的引物是：由SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:8所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388A位点的引物是：由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:10所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388G位点的引物是：由SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:12所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCA1 656A位点的引物是：由SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的正向引物和SEQ IDNO:14所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCA1 656G位点的引物是：由SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的正向引物和SEQ IDNO:16所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075C位点的引物是：由SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:18所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075A位点的引物是：由SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:20所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCB1 1236T位点的引物是：SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的正向引物；
针对ABCB1 1236C位点的引物是：由SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:23所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCB1 2677A位点的引物是：SEQ ID NO:24所示核苷酸序列的正向引物；
针对ABCB1 2677G位点的引物是：由SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:26所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCB1 2677T位点的引物是：由SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:28所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCG2 421C位点的引物是：由SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的正向引物和SEQ IDNO:30所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对ABCG2 421A位点的引物是：由SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的正向引物和SEQ IDNO:32所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334C位点的引物是：由SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:34所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334T位点的引物是：由SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:36所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对CYP3A4 653G位点的引物是：SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的正向引物；
针对CYP3A4 653C位点的引物是：由SEQ ID NO:38所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:39所示核苷酸序列的反向引物组成；
针对SLC10A1 800T位点的引物是：SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的正向引物；
针对SLC10A1 800C位点的引物是：由SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的正向引物和SEQID NO:42所示核苷酸序列的反向引物组成。
2.根据权利要求1所述的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，针对所述SNP位点的引物中的任意一者或多者的正向引物和/或反向引物的5’端由下述任意一种荧光修饰基团所修饰：FAM、TAMRA、HEX、ROX。
3.一种检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，包括分别针对下述SNP位点的引物：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A41334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C；
其中，
针对SLCO1B1 521C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 521T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:52所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示的反向引物组成；
针对ABCA1 656A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的反向引物组成；
针对ABCA1 656G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:57所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:58所示的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示的反向引物组成；
针对ABCB1 1236T位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的正向引物；
针对ABCB1 1236C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:64所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示的反向引物组成；
针对ABCB1 2677A位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示的正向引物；
针对ABCB1 2677G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的反向引物组成；
针对ABCB1 2677T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示的反向引物组成；
针对ABCG2 421C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:72所示的反向引物组成；
针对ABCG2 421A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的反向引物组成；
针对CYP3A4 653G位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的正向引物；
针对CYP3A4 653C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示的反向引物组成；
针对SLC10A1 800T位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的正向引物；
针对SLC10A1 800C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示的反向引物组成。
4.根据权利要求3所述的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，针对所述SNP位点的引物中的任意一者或多者的正向引物和/或反向引物的5’端由下述任意一种荧光修饰基团所修饰：FAM、TAMRA、HEX、ROX。
5.根据权利要求4所述的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQID NO:81和SEQ ID NO:84所示核苷酸序列的5’端分别由下述任意一种荧光修饰基团所修饰：FAM、TAMRA、HEX、ROX。
6.根据权利要求5所述的检测心血管疾病相关基因多态性的引物组，其特征在于，
针对SLCO1B1 521C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示且5’端由FAM修饰的反向引物组成；
针对SLCO1B1 521T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示且5’端由FAM修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示且5’端由FAM修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 463C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示且5’端由FAM修饰的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示且5’端由TAMRA修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:52所示的反向引物组成；
针对SLCO1B1 388G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示且5’端由TAMRA修饰的反向引物组成；
针对ABCA1 656A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示且5’端由HEX修饰的反向引物组成；
针对ABCA1 656G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:57所示且5’端由HEX修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:58所示的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示且5’端由ROX修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的反向引物组成；
针对CYP2C9 1075A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:61所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示且5’端由ROX修饰的反向引物组成；
针对ABCB1 1236T位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的正向引物；
针对ABCB1 1236C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:64所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:65所示且5’端由ROX修饰的反向引物组成；
针对ABCB1 2677A位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:66所示且5’端由FAM修饰的正向引物；
针对ABCB1 2677G位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示且5’端由ROX修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:68所示的反向引物组成；
针对ABCB1 2677T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:69所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:70所示且5’端由ROX修饰的反向引物组成；
针对ABCG2 421C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:71所示且5’端由TAMRA修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:72所示的反向引物组成；
针对ABCG2 421A位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:73所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:74所示且5’端由TAMRA修饰的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:76所示且5’端由TAMRA修饰的反向引物组成；
针对CYP3A4 1334T位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:77所示且5’端由ROX修饰的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的反向引物组成；
针对CYP3A4 653G位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:79所示的正向引物；
针对CYP3A4 653C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:80所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:81所示且5’端由TAMRA修饰的反向引物组成；
针对SLC10A1 800T位点的引物是核苷酸序列如SEQ ID NO:82所示的正向引物；
针对SLC10A1 800C位点的引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:83所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示且5’端由HEX修饰的反向引物组成。
7.一种检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组或者权利要求3-6任一项所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，进一步包括PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品。
9.根据权利要求8所述的检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，PCR反应液包括扩增缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+。
10.根据权利要求8所述的检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，阳性质控品包括分别含有下述位点的质粒：SLCO1B1 521C、SLCO1B1 521T、SLCO1B1 463A、SLCO1B1 463C、SLCO1B1 388A、SLCO1B1 388G、ABCA1 656A、ABCA1 656G、CYP2C9 1075C、CYP2C9 1075A、ABCB1 1236T、ABCB1 1236C、ABCB1 2677A、ABCB1 2677G、ABCB1 2677T、ABCG2 421C、ABCG2 421A、CYP3A4 1334C、CYP3A4 1334T、CYP3A4 653G、CYP3A4 653C、SLC10A1 800T和SLC10A1 800C。
11.根据权利要求8所述的检测心血管疾病相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，阴性质控品是ddH2O。
12.一种检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，包括：
步骤S1：将权利要求1或2所述的引物组或者权利要求3-6任一项所述的引物组随机分为1至23组，在每组中，以待检测DNA样本作为模板进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；
步骤S2：将PCR扩增产物混合，随后变性获得变性产物；
步骤S3：采用毛细管电泳法对变性产物进行检测，确定SNP位点及其基因型。
13.根据权利要求12所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，在步骤S1中，将权利要求1或2所述的引物组或者权利要求3-6任一项所述的引物组随机分为3组。
14.根据权利要求13所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，在3组引物组中，
第1组包括：针对SLCO1B1 521C位点的引物、针对SLCO1B1 463A位点的引物、针对SLCO1B1 463C位点的引物、针对SLCO1B1 388G位点的引物、针对ABCA1 656A位点的引物、针对ABCA1 656G位点的引物、针对CYP2C9 1075C位点的引物、针对ABCB1 1236T位点的引物、针对ABCB1 1236C位点的引物、针对CYP3A4 1334C位点的引物、针对CYP3A4 653G位点的引物和针对SLC10A1 800T位点的引物，
第2组包括：针对SLCO1B1 521T位点的引物、针对SLCO1B1 388A位点的引物、针对CYP2C9 1075A位点的引物、针对ABCB1 2677A位点的引物、针对ABCB1 2677G位点的引物、针对ABCG2 421C位点的引物、针对CYP3A4 1334T位点的引物和针对SLC10A1 800C位点的引物，
第3组包括：针对ABCB1 2677T位点的引物、针对ABCG2 421A位点的引物和针对CYP3A4653C位点的引物。
15.根据权利要求12-14任一项所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，待检测DNA样本是人类基因组DNA样本。
16.根据权利要求15所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，人类基因组DNA样本是口腔上皮脱落细胞DNA样本，或者EDTA抗凝外周血的DNA样本。
17.根据权利要求12-14任一项所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，PCR扩增反应是多重PCR扩增反应。
18.根据权利要求17所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，多重PCR扩增反应的条件是：阶段1，95℃预变性3分钟；阶段2，95℃变性15秒，55℃至62℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30至50个循环；阶段3，72℃维持10至20分钟。
19.根据权利要求18所述的检测心血管疾病相关基因多态性的非诊断目的的方法，其特征在于，多重PCR扩增反应的条件是：阶段1，95℃预变性3分钟；阶段2，95℃变性15秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；阶段3，72℃维持20分钟。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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