CN111876473A - 一种适用于荧光定量pcr中tth dna酶扩增的缓冲液 - Google Patents

一种适用于荧光定量pcr中tth dna酶扩增的缓冲液 Download PDF

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聂泳忠
马福军
余桂荣
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Fuzhou University
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Abstract

本发明提供一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液。所述缓冲液包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液150‑250 mM/L、氯化钾90‑110mM/L、六水氯化镁30‑40 mM/L、硫酸铵80‑90 mM/L、二甲基亚砜2‑3wt.%、甘油2‑3wt.%、吐温‑20 0.05‑0.2%V/V、聚乙二醇辛基苯基醚0.03‑0.05%V/V、牛血清白蛋白0.3‑0.4%V/V、甲酰胺0.4‑0.6wt.%、甜菜碱450‑550mM/L。在特制的buffer中增加了多种TTH DNA酶的保护剂，使得TTH DNA酶可以发挥更强的扩增性和检测灵敏性。

Description

一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液。
背景技术
人乳头瘤病毒（Human Paillomavirus,HPV），属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，含有约7900 对碱基(bp)，共有3 个基因区组成，包括早期区(Early Region，E 区)、晚期区(Late Region，L 区) 区和与非编码区(UncodingRegion，UCR) 或上游调控区(URR)。E 区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4 和E5 共7 个基因，参与病毒DNA 的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6 和E7 是HPV 的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。
实时荧光PCR技术是近年来应用最广泛的一种分子检测技术，由于检测方法简单快捷、灵敏高特异强，进而被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。当PCR扩增时加入特异性的荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，随着PCR反应的进行，被仪器检测到的荧光信号越来越强，结合软件可以对产物进行分析，根据标准曲线得到待测模板的初始浓度，从而达到定量的目的。
荧光定量PCR技术的反应组分体系包括：含荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、TTHDNA 酶液、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP。TTH DNA 酶为通过基因表达方法得到的一种活性蛋白，TTH DNA聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应，形成双链DNA，同时该酶也具有5′→3′外切酶活性。与Taq DNA polymerase 相比，对GC含量高的目的片段及粗样品的扩增效率更为出色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于荧光定量PCR中TTHDNA酶扩增的缓冲液，能够提高TTH DNA 酶扩增效率的buffer。
为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
所述缓冲液包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液150-250 mM/L、氯化钾 90-110mM/L、六水氯化镁30-40 mM/L、硫酸铵80-90 mM/L、二甲基亚砜2-3wt.%、甘油2-3wt.%、吐温-20 0.05-0.2% V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚0.03-0.05% V/V、牛血清白蛋白0.3-0.4%V/V、甲酰胺0.4-0.6wt.%、甜菜碱450-550mM/L。
优选的，所述缓冲液包括如下终浓度的原料：Tris-HCl缓冲液200mM/L、氯化钾102mM/L、氯化钾镁34.3mM/L、硫酸铵84.45mM/L、二甲基亚砜2.5wt.%、甘油2.5wt.%、吐温-20 0.1% V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚 0.04% V/V、0.1%牛血清白蛋白 0.4% V/V、甲酰胺0.5wt.%、甜菜碱500mM/L。
Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L。
上述组分称量混合均匀后的缓冲液的pH值为8.8。
本发明的优点在于：
本发明的适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液使得TTH DNA酶能达到很好的扩增效率。在实际的生产中能很好的解决进口TTH DNA酶与buffer的捆绑销售，在扩大化生产中能降低TTH DNA酶扩增的缓冲液的成本。同时为自动化点样冻干提供基础的buffer，为研制可冻干的TTH DNA酶扩增的缓冲液提供了可能。
附图说明
图1 为HPV16扩增检测结果，1#实验组（自制的buffer）、2#对照组（东洋纺自带buffer）。
图2 HPV16扩增凝胶电泳结果，1#为本发明缓冲液；2#为对照组（东洋纺自带buffer）。
图3 为HPV45扩增检测结果，，1#实验组（自制的buffer）、2#对照组（东洋纺自带buffer）。
图4 HPV45扩增凝胶电泳结果，备注：1#为本发明缓冲液；2#为对照组（东洋纺自带buffer）。
具体实施方式
实施例1
利用本发明的TTH DNA 酶扩增的特制buffer结合相关的Q-PCR组分构成相关的QPCR检测系统，同时选用MGB探针法检测HPV病毒（HPV45和HPV16），提高检测的扩增效率从而提高检测灵敏性。
所述TTH DNA 酶扩增的buffer包括如下终浓度的原料：Tris-HCl缓冲液200mM/L、氯化钾102mM/L、氯化钾镁34.3mM/L、硫酸铵84.45mM/L、二甲基亚砜2.5wt.%、甘油2.5wt.%、吐温-20 0.1% V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚 0.04% V/V、0.1%牛血清白蛋白 0.4% V/V、甲酰胺0.5wt.%、甜菜碱500mM/L。缓冲液溶剂为水，pH值为8.8。
对照组采用购自东洋纺的缓冲液（产品型号：KOD SYBR qPCR Mix；Code No：QKD-201）。
采用所设计的引物和探针是通过生物信息学分析各型HPV序列，利用生物软件（snapGene、DNAman、Vector NTI）在HPV病毒基因E6、E7区域设计各型别的特异引物和探针(见下表)，所设计的引物和探针特异性高。
将中国药品生物制品鉴定所建立的HPV基因分型质控品盘中的2种人乳头瘤病毒DNA质粒（型号为HPV16 、HPV45），按照106 Copies/反应的量，QPCR反应体系为10ul，其中探针选用FAM为HPV病毒荧光扩增信号，MGB为淬灭基团。
引物和探针序列表：
Figure 126409DEST_PATH_IMAGE001
2.Q-PCR体系和组分浓度：
Figure 787197DEST_PATH_IMAGE002
3 .Q-PCR 反应条件：
Figure 294181DEST_PATH_IMAGE003
4 检测结果：
4.1 HPV16扩增检测结果：本发明的缓冲液与购自东洋纺的buffer在扩增效率上基本一致，具体见图1及下表：
Figure 398535DEST_PATH_IMAGE004
HPV16扩增凝胶电泳结果：凝胶电泳得到的条带大小与与预设的目的条带大小结果(169bp)基本一致，具体见图2。
可见，本发明的缓冲液能帮助TTH DNA 酶在QPCR体系中起到很好的扩增效果。
4.2 HPV45扩增检测结果：
本发明的荧光PCR扩增缓冲液与东洋纺自带buffer在扩增效率上基本一致，具体见图3及下表：
Figure 727885DEST_PATH_IMAGE005
HPV45扩增凝胶电泳结果：凝胶电泳得到的条带大小与与预设的目的条带大小结果(145bp)基本一致，见图4。
本发明的荧光PCR扩增缓冲液能帮助TTH DNA 酶在QPCR体系中起到很好的扩增效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
西人马大周（萍乡）医疗科技有限公司
<120> 一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggagcgacc cagaaagtta cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acagcatatg gattcccatc tc 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caacagttac tgcgacg 17
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tacgagcaat taagcgagtc ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgtaagctc aattctgccg tc 22
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agtcatgcac aactac 16

Claims (2)

1.一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液150-250 mM/L、氯化钾 90-110mM/L、六水氯化镁30-40 mM/L、硫酸铵80-90 mM/L、二甲基亚砜2-3wt.%、甘油2-3wt.%、吐温-20 0.05-0.2%V/V、 聚乙二醇辛基苯基醚0.03-0.05% V/V、牛血清白蛋白0.3-0.4% V/V、甲酰胺0.4-0.6wt.%、甜菜碱450-550mM/L。
2.根据权利要求1所述的一种适用于荧光定量PCR中TTH DNA酶扩增的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液包括如下终浓度的原料：Tris-HCl缓冲液200mM/L、氯化钾102mM/L、氯化钾镁34.3mM/L、硫酸铵84.45mM/L、二甲基亚砜2.5wt.%、甘油2.5wt.%、吐温-20 0.1% V/V、聚乙二醇辛基苯基醚 0.04% V/V、0.1%牛血清白蛋白 0.4% V/V、甲酰胺0.5wt.%、甜菜碱500mM/L。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005184A (zh) * 2020-12-20 2021-06-22 杭州百迈生物股份有限公司 一种增强实时荧光pcr信号的试剂和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049614A1 (en) * 1999-10-06 2003-03-13 Holly Hurlbut Hogrefe Compositions for dna amplification, synthesis, and mutagenesis
CN101128604A (zh) * 2005-02-28 2008-02-20 生物探索公司 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法
US20100197517A1 (en) * 2006-12-29 2010-08-05 Honeywell International Inc. Reaction buffer for microarray
US7939645B2 (en) * 2006-01-06 2011-05-10 Agilent Technologies, Inc Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed DNA polymerases

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049614A1 (en) * 1999-10-06 2003-03-13 Holly Hurlbut Hogrefe Compositions for dna amplification, synthesis, and mutagenesis
CN101128604A (zh) * 2005-02-28 2008-02-20 生物探索公司 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法
US7939645B2 (en) * 2006-01-06 2011-05-10 Agilent Technologies, Inc Reaction buffer composition for nucleic acid replication with packed DNA polymerases
US20100197517A1 (en) * 2006-12-29 2010-08-05 Honeywell International Inc. Reaction buffer for microarray

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005184A (zh) * 2020-12-20 2021-06-22 杭州百迈生物股份有限公司 一种增强实时荧光pcr信号的试剂和方法

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