CN114085893A - 一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒 - Google Patents

一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于miRNA检测领域，更具体地，涉及miRNA的一步法检测。本发明提供了一种miRNA检测的引物和探针设计方法，包括该引物和探针设计方法设计的引物和探针的检测组合物，包括该检测组合物的检测试剂盒。使用本发明方法设计的引物和探针，能够使得miRNA的检测可以采用一步法进行，不会出现非特异性扩增，并且其灵敏度高，达到1000拷贝/mL，特异性好。操作更加简单、安全，结果更为可信。

Description

一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于miRNA检测领域，更具体地，涉及miRNA的一步法检测。
背景技术
microRNA(miRNA)是内源性单链非编码小RNA，由20-25个碱基组成。调节多种生物学过程，包括生长发育，信号传导，免疫调节，细胞凋亡，增殖及肿瘤发生等。由于miRNA具有强大的调节功能，其异常表达水平被认为是多种疾病的生物标志物，包括神经退行性疾病(和中枢神经系统损伤)、糖尿病、心血管疾病、肾脏疾病、肝脏疾病，甚至免疫功能障碍。miRNA在癌细胞和组织有特异性表达谱，而且可以进入体液循环。血清、血浆和其他体液中，都可以检测到循环游离的miRNA。成熟的miRNA在体液中非常稳定。这使得miRNA可以作为人类癌症的潜在非侵入性肿瘤标志物。目前有多种方法来检测miRNA，包括RNA高通量测序、微芯片和RT-qPCR等。测序法和芯片法的优势在于高通量的miRNA分析，发现新颖的miRNA，或寻找与疾病相关的差异表达miRNA，但不适合常规使用。对诊断领域而言，最具潜力的方法仍是金标准的RT-qPCR。目前常用的RT-qPCR方法是茎环逆转录方法和ployA加尾方法。
但现在miRNA检测的相关科研试剂盒还是临床检测产品，逆转录和qPCR扩增均是分步进行。虽然RNA一步法扩增在临床检测上面被广泛应用，但是miRNA一步法扩增却并不普及，主要原因是其片段太小(20nt-25nt),在使用常规的RNA一步法扩增时，非特异性扩增会被放大；再有循环miRNA含量本身很低，而一步法扩增会损失灵敏度。所以两步法目前还是miRNA检测的首选。但是两步法扩增操作时长，开盖移液增加污染的可能性，并不能满足临床上的需求。
所以，存在对miRNA一步法检测的需求，其无需中途开盖，以减少污染和操作时长，同时保证检测的灵敏度。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明的主要目的在于提供一种miRNA检测的引物和探针设计方法，其包括以下步骤：
S1、设计正向引物，其序列与靶标miRNA除去3’端最后N个碱基的序列完全相同，并将序列中的U替换为T，并使得正向引物的Tm值为56～60℃；
S2、设计茎环引物，将正向引物与通用茎环引物进行比对，找出其中互补配对的连续碱基数大于5的区域，通过对通用茎环引物的序列进行替换或者删除，使得互补配对的连续碱基数小于或等于5，或者使得所述茎环引物和所述正向引物之间的dG>-8kc/m；
S3、设计反向引物；以及
S4、设计探针；
其中，N为5～8。
使用本发明方法设计的引物和探针，能够使得miRNA的检测可以采用一步法进行，不会出现非特异性扩增，并且其灵敏度高，达到1000拷贝/mL，特异性好。操作更加简单、安全，结果更为可信。
在一些具体的实施方案中，S2步骤为设计茎环引物，将正向引物与通用茎环引物进行比对，找出其中互补配对的连续碱基数大于5的区域，通过对通用茎环引物的序列进行替换或者删除，使得互补配对的连续碱基数小于或等于5。
在一些具体的实施方案中，S2步骤为设计茎环引物，将正向引物与通用茎环引物进行比对，找出其中互补配对的连续碱基数大于5的区域，通过对通用茎环引物的序列进行替换或者删除，使得所述茎环引物和所述正向引物之间的dG>-8kc/m。
进一步地，如本领域技术人员所知晓的，本发明修改后的茎环引物，可以通过相关软件，确定茎环结构的完整性。
进一步地，设计反向引物，其包括使得反向引物序列与茎环引物的一部分完全相同，且与茎环引物互补配对的连续碱基数小于或等于5，并使得反向引物的Tm值为56～60℃。
进一步地，反向引物的起点位于茎环引物的环状序列的起始点、向5’端偏移1～8bp，或者向3’端偏移1-3bp。
在本发明中，所述“反向引物的起点”是指设计反向引物的模板，即茎环引物，上的起始点。
通过将反向引物的起点位于茎环序列的环状序列或其附近，使得检测miRNA的灵敏度更高。
进一步地，设计探针，其包括使得探针序列从5’端起包括两段序列F和G，第一段序列F与茎环引物3’端序列完全相同，第二段序列G与靶标miRNA3’端最后N个碱基的互补序列完全相同，并使得探针的Tm值为68～72℃。
进一步地，探针的5’端接荧光基团，3’端接淬灭基团。优选地，探针的第一个碱基不能为G。
在本发明中，荧光基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。猝灭基团，可以选自MGB、BHQ1或BHQ2，但不限于此。
在一些具体的实施方案中，正向引物的大小为18～28bp。
在一些具体的实施方案中，茎环引物的大小为50～60bp。
在一些具体的实施方案中，反向引物的大小为18～28bp。
在一些具体的实施方案中，探针的大小为13～20bp。
在一个具体的实施方案中，为了使正向引物的Tm值为56～60℃，在正向引物前面会设计一个随机序列，使得正向引物的Tm值为56～60℃。
在一些具体的实施方案中，通用茎环序列的序列如SEQ ID NO:1～4所示。
在一个优选的实施方案中，N为6。
当N为6时，由此设计得到的引物探针，检测miRNA的灵敏度更高，Ct值进一步靠前。
在一些具体的实施方案中，所有引物和探针不能相互重叠。
第二方面，本发明提供了一种miRNA检测组合物，其包括如上方法设计的引物和探针。
在一个具体的实施方案中，本发明的miRNA检测组合物的各成分存在于同一个包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的miRNA检测组合物以混合的形式存在于同一个包装中。
第三方面，本发明提供上述miRNA检测组合物在制备用于检测miRNA的试剂盒中的用途
第四方面，本发明提供了一种miRNA检测试剂盒，其包括如上所述的miRNA检测组合物。
在一些具体的实施方案中，如上所述的检测试剂盒还包括PCR扩增体系。
其进一步包括100～200mM Tris-HCl、30～100mM(NH4)2SO4、200～300mM KCl、0.2～0.8％Tween-20、0.02～0.08％明胶、0.05～0.2％BSA、5～20mM EDTA、2～10M甜菜碱、5～15％山梨醇、5～20％甘露醇、15～30μg/μl gp32、0.2～0.3M TMAC、1～5％甘油和5～15％PEG 6000。
在一个具体的实施方案中，其进一步包括150mM Tris-HCl、50mM(NH4)2SO4、250mMKCl、0.5％Tween-20、0.05％明胶、0.1％BSA、10mM EDTA、5M甜菜碱、10％山梨醇、15％甘露醇、25μg/μl gp32、0.25M TMAC、3％甘油、和10％PEG 6000。
在一些具体的实施方案中，如上所述的检测试剂盒还包括核酸保存剂和核酸释放剂中的至少一种。
通过该PCR体系与本发明方法设计的引物和探针进行组合，其能够使得Ct值进一步靠前，即灵敏度更高。
进一步地，其包括dNTP、Mg2+、逆转录酶、聚合酶、Rnasin。
第五方面，本发明提供了一种miRNA一步法检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述的组合物，或者如上所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行检测；
3)获得并分析结果。
进一步地，进行检测包括进行逆转录再进行荧光定量PCR。
更进一步地，逆转录和荧光定量PCR在一管中进行。
更进一步地，待测样本为血清、血浆，以及其他体液。优选地，待测样本为血清、血浆。
本发明提供了一种非诊断目的的miRNA一步法检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸
2)使用如上所述的组合物，或者如上所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行检测；
3)获得并分析结果。
进一步地，进行检测包括进行逆转录再进行荧光定量PCR。
更进一步地，逆转录和荧光定量PCR在一管中进行。
附图说明
图1为miRNA茎环逆转录一步法扩增图；
图2～5为不同靶标miRNA的特异性茎环引物和常规茎环引物一步法对比结果；
图6为本发明检测方法的灵敏度；
图7为本发明检测方法的特异性；
图8～11为本发明检测方法不同的反向引物设计结果；
图12～15为本发明检测方法不同的正向引物设计结果。
具体实施方式
茎环逆转录检测miRNA的具体步骤如图1所示。具体来讲，分为两个阶段：第一阶段，逆转录阶段，先由茎环引物与靶标miRNA结合以进行逆转录，得到cDNA；第二阶段，扩增检测阶段，再通过正向引物和反向引物以及探针进行荧光PCR，以对miRNA进行检测。
在本发明中，术语“通用茎环序列”是指由能够用来进行miRNA检测的由茎部序列和环状序列构成茎环结构的部分，和特异性靶标miRNA部分组成的所有序列。
在本发明中，术语“靶标miRNA”是指待检测的microRNA。
在本发明中，术语“正向引物”是指用于扩增靶标miRNA逆转录得到的cDNA的5’端的引物。
在本发明中，术语“反向引物”是指用于扩增靶标miRNA逆转录得到的cDNA的3’端的引物。
在本发明中，术语“两步法”是指在miRNA的检测过程中，逆转录阶段和扩增检测阶段分为两个步骤进行，先加入茎环引物进行逆转录，得到cDNA之后再加入正向引物、反向引物以及探针，对cDNA进行扩增并检测。
在本发明中，术语“一步法”是指在miRNA的检测过程中，逆转录阶段和扩增检测阶段在一管内一步同时进行，将茎环引物、正向引物、反向引物和探针同时加入，直接先进行逆转录再进行扩增检测。
实施例1、miRNA一步法检测的引物和探针设计
根据micro RNA数据库(http://www.mirbase.org/)中报道的核苷酸序列hsa-miR-106a、hsa-miR-let7a、hsa-miR-26b和hsa-miR-92a-3p(如表1)为模板，并按照本发明所提供的方法设计特异性引物(正向F、反向R、茎环RT)和探针(P)序列，所述的引物和探针序列具体如表2所示。同时，设计了四种miRNA的常规引物(正向F、反向R、茎环RT)和探针(P)序列用于对比，具体如表3所示。
表1、四种miRNA序列
miRNA 序列 SEQ ID NO
hsa-miR-106a AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 5
hsa-miR-let7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 6
hsa-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 7
hsa-miR-92a-3p UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 8
表2、特异性茎环引物和探针序列
Figure BDA0003358004000000071
Figure BDA0003358004000000081
表3、常规通用茎环引物和探针序列
Figure BDA0003358004000000082
Figure BDA0003358004000000091
Figure BDA0003358004000000101
所述探针5’端有荧光标记，3’端用均用MGB标记。
实施例2、miRNA一步法检测
分别使用表2和表3所示的引物和探针，对表1的四种miRNA进行检测。其扩增体系如表4所示，并将上述反应体系按照表5所示的扩增反应程序至于SLAN96P荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应。实验结果如图2-图5以及表6所示。从结果中可以看到，本发明方法设计的特异性引物和探针，通过改进后的特异性茎环引物和探针，一步法扩增的Ct值均远远小于常规普通茎环引物和探针，并且NTC(无模板)也没有非特异性扩增，荧光值也高于常规设计。而常规茎环引物和探针，除了Ct拖后以外，NTC会有非特异性扩增，并不适用与一步法荧光定量PCR体系。
表4、microRNA一步法扩增体系
Figure BDA0003358004000000102
Figure BDA0003358004000000111
表5、microRNA一步法扩增程序
Figure BDA0003358004000000112
表6、特异性茎环引物和常规茎环引物一步法扩增对比
Figure BDA0003358004000000113
Figure BDA0003358004000000121
实施例3、miRNA一步法灵敏度测试
按照实施例1的引物探针设计和实施例2的一步法反应体系和程序对106a进行灵敏度的分析，具体如下：
由生工生物工程合成Has-mir-106a干粉，加无RNA水溶解成1015拷贝/mL，标记为e15，然后用无RNA水按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e4到e2为模板进行miRNA探针一步法灵敏度分析。
实验结果如图6，表7所示，可以看出，扩增产物有典型的S型曲线，且成浓度梯度，其中e4的平均Ct值为34.84，e3的平均Ct值为37.41，e2为NoCt，NTC为NoCt，灵敏度达e3。
表7、灵敏度分析
模浓度 Ct值
E4 34.62
E4 35.05
E3 37.49
E3 37.32
E2 NoCt
E2 NoCt
NTC NoCt
NTC NoCt
实施例4、miRNA一步法特异性测试
对Hsa-mir-92a引物探针进行特异性分析，具体如下：
在生工生物工程合成Hsa-mir-92a-3p(目标序列)和三种干扰序列Hsa-mir-106a，Hsa-mir-let7a，和Hsa-mir-26a序列。使用实施例1设计的Hsa-mir-92a引物探针，按照实施例2所述方法，对目标序列和干扰序列进行检测，检测结果如表8和图7所示。从表8和图7中可以看出，引物探针仅对Hsa-mir-92a有扩增，对其余三个干扰序列均无扩增，表明本发明涉及的引物探针特异性好。
表8、特异性分析
Figure BDA0003358004000000131
实施例5、miRNA一步法体系的改进
为了进一步增加miRNA一步法检测的灵敏度，发明人对扩增检测体系进行了改良，设计了一种新的用于miRNA一步法检测的5*PCR buffer，其成分包括150mM Tris-HCl、50mM(NH4)2SO4、250mM KCl、0.5％Tween-20、0.05％明胶、0.1％BSA、10mM EDTA、5M甜菜碱、10％山梨醇、15％甘露醇、25μg/μl gp32、0.25M TMAC、3％甘油和10％PEG 6000。进一步地，为了更好的说明改良效果，发明人使用了市售翌圣公司的RT-PCR一步法扩增buffer(
Figure BDA0003358004000000132
ⅢOne Step RT-qPCR Probe Kit，产品货号：11145ES50)用于比对。
实验结果如下表9所示，本发明的miRNA一步法体系相比市售体系的Ct值更靠前，灵敏度更高。hsa-miR-106a检测平均提前4.3个Ct；hsa-miR-26b检测平均提前1.3个Ct。另外，翌圣结果中的NTC荧光值不稳定，线型有抖动，说明该体系与特异性茎环引物探针并不能完全适配。综上，本发明的miRNA一步法体系更适合搭配特异性茎环引物和探针，miRNA检测中表现出更高的灵敏度和特异性。
表9、PCR一步法buffer和已有一步法buffer对比测试
Figure BDA0003358004000000141
实施例6、反向引物设计对一步法检测的影响
进一步地，发明人探究了反向引物的设计，对miRNA一步法检测灵敏度的影响。发明人发现反向引物的范围对灵敏度具有明显的影响，以hsa-miR-106a为例，发明人设计了如表10所示的一系列反向引物(下划线加粗序列为环部起始序列)，并探究其Ct值。
表10、反向设计引物
Figure BDA0003358004000000142
Figure BDA0003358004000000151
实验结果如下表11和图8～11所示，使用环部序列为起始点的R引物以及向5’端移动5bp的引物序列，扩增成功，其中e4的最低Ct值为32.61，e3的最低Ct值为35.51。使用R引物环部序列起始点向5’端移动9bp，向3’端移动4bp，扩增效率下降，Ct值拖后。综上，反向引物的起点位于茎环引物的环状序列的起始点或者向5’端移动1-8bp，或者向3’端移动1-3bp，该设计区域的效果最佳。
表11反向引物设计的区域测试
Figure BDA0003358004000000152
实施例7、正向引物设计对一步法检测的影响
进一步地，发明人探究了反向引物的设计，对miRNA一步法检测灵敏度的影响。以hsa-miR-106a为例，发明人设计了N为5～7和N为9时的引物和探针(下划线加粗序列为N的互补序列)，其序列如下表12所示。
表12、正向设计引物
Figure BDA0003358004000000153
Figure BDA0003358004000000161
Figure BDA0003358004000000171
实验结果如表13和图12～15所示，从结果中可以看到，本发明方法设计的特异性引物和探针，N碱基数为6时最佳，靶基因能够一步法正常扩增，Ct值成浓度梯度，其中e5的平均Ct值为29.38，e4的平均Ct值为33.43，e3的平均Ct值为37.87。N碱基数为5和7时，能够进行一步法扩增。而碱基数为9时，不仅扩增失败且有非特异性扩增。
表13、N碱基范围对比测试
Figure BDA0003358004000000172
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgac 44
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgac 48
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatc 36
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagc 37
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 5
aaaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 6
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 7
uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 8
uauugcacuu gucccggccu gu 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgtcaaaag tgcttacagt gc 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtagcgtgga gtcggcaatt 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atcggatacg acctacct 18
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtcgtatccg atcgtagcgt ggagtcggca attgatcgga tacgacctac ct 52
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcggctgagg tagtaggttg t 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaaggctgga gagcgagat 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tacgactacg ataactat 18
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atcgtagtcg tacgaaggct ggagagcgag atgtacgact acgataacta t 51
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcgccattca agtaattcag g 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctcacgctcg agacggatc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cgagcaatag ctcacctat 19
<210> 20
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gagctattgc tcgcctcacg ctcgagacgg atctggcgag caatagctca cctat 55
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgctattgca cttgtcccg 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgagagctgc tcacggagat 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
catcctcatg ctacaggc 18
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agcatgagga tgcgagagct gctcacggag atgcatcctc atgctacagg c 51
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gccgagaaaa gtgcttacag tgc 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gtgtcgtgga gtcggcaatt 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cactggatac gacctacct 19
<210> 28
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacct acct 54
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cggcaggtga ggtagtaggt tgt 23
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
agtgcagggt ccgaggtatt c 21
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
actggatacg acaactat 18
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaactat 50
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ccgccattca agtaattcag g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
agtgcagggt ccgaggtatt c 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cactggatac gacacctat 19
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacctat 50
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ccgtattgca cttgtcccg 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gtgtcgtgga gtcggcaatt 20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
actggatacg acacaggc 18
<210> 40
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac aggc 54
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tatccgatcg tagcgtggag t 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgatcgtagc gtggagtcg 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cgtggagtcg gcaattgatc 20
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gcgtcaaaag tgcttacagt gc 22
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gtagcgtgga gtcggcaatt 20
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
atcggatacg acctacct 18
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gtcgtatccg atcgtagcgt ggagtcggca attgatcgga tacgacctac ct 52
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
cgtcaaaagt gcttacagtg ca 22
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atcggatacg acctacc 17
<210> 50
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gtcgtatccg atcgtagcgt ggagtcggca attgatcgga tacgacctac c 51
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ggcgtcaaaa gtgcttacag tg 22
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
atcggatacg acctacctg 19
<210> 53
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gtcgtatccg atcgtagcgt ggagtcggca attgatcgga tacgacctac ctg 53
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
cggcgtcaaa agtgcttaca gt 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
atcggatacg acctacctgc a 21
<210> 56
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gtcgtatccg atcgtagcgt ggagtcggca attgatcgga tacgacctac ctgca 55

Claims (12)

1.一种miRNA检测的引物和探针设计方法，其包括以下步骤：
S1、设计正向引物，其序列与靶标miRNA除去3’端最后N个碱基的序列完全相同，并将序列中的U替换为T，并使得正向引物的Tm值为56～60℃；
S2、设计茎环引物，将正向引物与通用茎环引物进行比对，找出其中互补配对的连续碱基数大于5的区域，通过对通用茎环引物的序列进行替换或者删除，使得互补配对的连续碱基数小于或等于5，或者使得所述茎环引物和所述正向引物之间的dG>-8kc/m；
S3、设计反向引物；以及
S4、设计探针；
其中，N为5～8。
2.如权利要求1所述的miRNA检测的引物和探针设计方法，其中，所述S3步骤包括使得所述反向引物序列与所述茎环引物的一部分完全相同，且与所述茎环引物互补配对的连续碱基数小于或等于5，并使得所述反向引物的Tm值为56～60℃；优选地，所述反向引物的起点位于所述茎环引物的环状序列的起始点、向5’端偏移1～8bp，或者向3’端偏移1～3bp。
3.如权利要求1所述的miRNA检测的引物和探针设计方法，其中，所述S4步骤包括使得所述探针序列从5’端起包括两段序列F和G，第一段序列F与所述茎环引物3’端序列完全相同，第二段序列G与靶标miRNA 3’端最后N个碱基的互补序列完全相同，并使得探针的Tm值为68～72℃。
4.如权利要求1～3中任一项所述的miRNA检测的引物和探针设计方法，其中，N为6。
5.一种miRNA检测组合物，其包括如权利要求1～4中任一项所述方法设计的引物和探针。
6.如权利要求5所述的miRNA检测组合物，其中，所述组合物的各成分存在于同一个包装中。
7.权利要求5或6所述的miRNA检测组合物在制备用于检测miRNA的试剂盒中的用途。
8.一种miRNA检测试剂盒，其包括如权利要求1～4中任一项所述方法设计的引物和探针或者如权利要求5或6所述的miRNA检测组合物。
9.如权利要求8所述的miRNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括PCR扩增体系。
10.如权利要求8或9所述的miRNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括100～200mM Tris-HCl、30～100mM(NH4)2SO4、200～300mM KCl、0.2～0.8％Tween-20、0.02～0.08％明胶、0.05～0.2％BSA、5～20mM EDTA、2～10M甜菜碱、5～15％山梨醇、5～20％甘露醇、15～30μg/μl gp32、0.2～0.3M TMAC、1～5％甘油和5～15％PEG 6000。
11.如权利要求8或9所述的miRNA检测试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括核酸保存剂或者核酸释放剂中的至少一种。
12.一种miRNA一步法检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求5或6所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行检测；
3)获得并分析结果。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023087706A1 (zh) * 2021-11-16 2023-05-25 圣湘生物科技股份有限公司 一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048757A1 (en) * 2005-05-31 2007-03-01 Applera Corporation Methods for characterizing cells using amplified micro rnas
US20070111226A1 (en) * 2005-08-24 2007-05-17 Applera Corporation Method to Quantify siRNAs, miRNAs and Polymorphic miRNAs
CN101831500A (zh) * 2010-05-19 2010-09-15 广州市锐博生物科技有限公司 一种小rna的定量检测方法及试剂盒
CN103205489A (zh) * 2013-01-30 2013-07-17 上海黄离生物科技有限公司 一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒
CN103509789A (zh) * 2012-06-26 2014-01-15 刘晓光 一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法
CN103866009A (zh) * 2014-02-26 2014-06-18 东华大学 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法
CN104372083A (zh) * 2014-10-31 2015-02-25 东华大学 一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法
CN108048574A (zh) * 2017-10-13 2018-05-18 江苏为真生物医药技术股份有限公司 胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒
CN108165622A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 广东省农业科学院动物科学研究所 一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法
CN113005181A (zh) * 2020-12-22 2021-06-22 广州血康陆道培生物技术有限公司 一种基于茎环法的多重荧光定量pcr检测非编码小rna的引物组
WO2023025259A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 卓越精准医疗有限公司 检测微小rna的方法和试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012241B (zh) * 2017-05-09 2020-11-20 东莞微量精准检测研究院有限公司 一种U6、miR 92a及miR 21的三重RT-qPCR检测方法及试剂盒
CN109706224A (zh) * 2018-12-14 2019-05-03 山东师范大学 一种核酸外切酶iii辅助的多重循环扩增用于灵敏地检测dna的方法
CN110964785B (zh) * 2019-12-16 2022-04-01 武汉大学 一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法
CN113046453B (zh) * 2021-03-24 2023-02-03 复旦大学 一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测dna点突变的方法及试剂盒
CN114085893B (zh) * 2021-11-16 2023-07-25 圣湘生物科技股份有限公司 一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048757A1 (en) * 2005-05-31 2007-03-01 Applera Corporation Methods for characterizing cells using amplified micro rnas
US20070111226A1 (en) * 2005-08-24 2007-05-17 Applera Corporation Method to Quantify siRNAs, miRNAs and Polymorphic miRNAs
CN101831500A (zh) * 2010-05-19 2010-09-15 广州市锐博生物科技有限公司 一种小rna的定量检测方法及试剂盒
CN103509789A (zh) * 2012-06-26 2014-01-15 刘晓光 一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法
CN103205489A (zh) * 2013-01-30 2013-07-17 上海黄离生物科技有限公司 一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒
CN103866009A (zh) * 2014-02-26 2014-06-18 东华大学 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法
CN104372083A (zh) * 2014-10-31 2015-02-25 东华大学 一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法
CN108048574A (zh) * 2017-10-13 2018-05-18 江苏为真生物医药技术股份有限公司 胃癌外泌体miRNA分子标记的应用及其试剂盒
CN108165622A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 广东省农业科学院动物科学研究所 一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法
CN113005181A (zh) * 2020-12-22 2021-06-22 广州血康陆道培生物技术有限公司 一种基于茎环法的多重荧光定量pcr检测非编码小rna的引物组
WO2023025259A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 卓越精准医疗有限公司 检测微小rna的方法和试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN C等: "Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR", 《NUCLEIC ACIDS RES》, vol. 33, no. 20, pages 1 - 9, XP002420559, DOI: 10.1093/nar/gki140 *
JUNG U等: "A universal TaqMan-based RT-PCR protocol for cost-efficient detection of small noncoding RNA", 《RNA》, vol. 19, no. 12, pages 1864 - 1873, XP093039807, DOI: 10.1261/rna.040501.113 *
MOHAMMADI-YEGANEH S等: "Development of a robust, low cost stem-loop real-time quantification PCR technique for miRNA expression analysis", 《MOL BIOL REP》, vol. 40, no. 5, pages 3665 - 3674, XP055083405, DOI: 10.1007/s11033-012-2442-x *
宋伟等: "基于茎环引物定量检测miRNA的研究进展", 《食品工业科技》, vol. 35, no. 19, pages 378 - 383 *
薛慧慧等: "改进茎环引物RT-PCR法实时定量检测microRNA", 《现代生物医学进展》, vol. 14, no. 28, pages 5431 - 5435 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023087706A1 (zh) * 2021-11-16 2023-05-25 圣湘生物科技股份有限公司 一种miRNA检测的引物探针设计方法、检测组合物及试剂盒

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