CN110964785B - 一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法。通过目标物激活HCR放大器中亚稳态发夹的自主和连续打开,产生包含大量DNAzyme的双链DNA纳米线,随后该DNAzyme不断催化剪切底物释放出大量的新引发链以反向激活HCR反应。由于DNAzyme可以持续不断地积累HCR引发链以及HCR又可以持续组装大量的DNAzyme,这种交叉催化放大反应可以将分子识别过程转换为显著放大的信号输出。该R‑HCR放大器很容易与辅助传感模块结合发展成为一个通用的传感体系,成功实现了单分子miRNA的超灵敏体外检测和细胞内成像。在细胞生物学和临床诊断中对痕量生物标志物的体内检测方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体涉及基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法。
背景技术
核酸恒温扩增系统因其在临床诊断、食品安全、环境监测和法医分析等方面的广泛应用而成为研究热点。基于不同的催化反应机制,这些策略主要分为酶扩增和无酶扩增方法。这些酶催化机器包括滚环扩增(RCA)、环介导的恒温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)。这些酶催化机器通常依赖于某些蛋白酶才能发挥其有效性,这些酶很容易受到外部环境的干扰。因此,我们急需开发更强大、更便捷的传感策略用于复杂生物环境的分析。
近年来,人们开发了一系列强大、通用的无酶催化机器用于体外和体内核酸扩增。由于这些无酶传感策略具有设计简单、信号放大能力强等优点,在低表达生物标志物的临床诊断中具有广阔的应用前景。无酶催化机器包括DNAzyme催化机器和级联杂交机器。DNAzyme是有催化活性的核酸,通常作为信号放大单元用于生物传感分析。HCR作为一种典型的杂交级联机器,具有显著的放大能力和超低的信号泄漏。HCR反应是分析物引发发夹反应物的交替杂交产生双链DNA共聚物的过程。HCR作为一种简便快速的扩增方法,可以用于细胞表面和活细胞内各种核酸分析物的检测。然而,由于HCR系统相对较低的反应速度,使其对痕量生物标志物的信号扩增效率不太理想。为了解决这个问题,HCR通过传统的堆叠机制进一步与其他放大反应整合,使其传感性能得到了进一步的改善。然而这些系统由于其低的信号放大能力和效率而受到严重的限制。
互惠催化机器被认为是理论上最有效的多层放大系统,互惠双方可以通过巧妙的交叉催化途径相互增强。该引发链可以自主补充,从而有效地加快相互催化反应过程。通过引发链的不断积累,该交叉催化放大器可以大大促进反应的完成,直到耗尽所有参与的反应物。蛋白酶介导的交叉催化DNA扩增系统已被发展用于体外生物分析,然而却很少有人研究可以用于体内分析的无酶交叉催化放大机器,特别是涉及HCR的交叉催化放大机器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法。由于交叉催化自放大反应具有多重分子识别和连续加速的分子反应性质,使其有利于实现可靠的生物分析应用。本发明希望通过合理、巧妙的整合HCR和DNAzyme模块使其成为一个简易、强大的交叉催化的DNA放大器。该方法具有稳定性好、灵敏度高以及选择性好的优点,有利于实现癌症的早期诊断,并进一步监测其发生发展过程。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明的第一方面提供一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法,其步骤如下:
(1)DNA探针、多功能底物S及封闭链L的设计:目标DNA(T)为含起始序列a*、b*的序列,运用NUPACK软件设计DNA探针H1、H2、H3、H4、S、L;H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段(f-a);H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端分别接有分裂的DNAzyme片段(h-g),其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;目标物的a*、b*先跟H1中a、b杂交从而打开H1,生成中间产物T-H1。H1被打开后释放出c、b*,H1中c、b*可以与H2中的b、c*杂交,生成中间产物T-H1-H2,H2被打开后释放出b*、d序列可以与H3杂交从而打开H3,H3被打开后释放出e、b*,生成中间产物T-H1-H2-H3,同时使分裂的两个DNAzyme片段(f-a)和(h-g)拉近生成一个完整的有催化活性的DNAzyme。H3中e、b*可以与H4中的e*、b杂交,生成中间产物T-H1-H2-H3-H4,拉近两个荧光团FAM和TAMRA之间的距离发生荧光共振能量转移,提供信号输出。H4被打开后释放出b*、a*,该释放出来的序列与T序列一样,因此被打开后的H4又可以跟H1杂交。所述DNAzyme是依赖镁离子的具有剪切活性的脱氧核酸酶(R.R.Breaker,G.F.Joyce,Chem.Biol.1995,2,655-660),DNAzyme的生物催化部分包含一个多功能底物链S,该底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*,a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列。在没有目标物时,将该底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏。在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体(S/L)的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应。在交叉催化过程中,HCR反应中每个H2-H4杂交体均产生一个FRET信号,每个H1-H3杂交体均形成一个有催化活性的DNAzyme单元。每个组装的DNAzyme都可以产生大量的引发链去加速整个交叉催化反应的进行。这导致生成更多的DNAzyme纳米线和显著的FRET信号;在没有目标物T时,发卡H1、H2、H3、H4能保持自身的稳定性,无法发生HCR反应;当有目标物T时,就可以引发HCR和DNAzyme之间的交叉催化反应,由于H2上标记有TAMRA荧光团,H4上标记有FAM荧光团,目标DNA(T)引发HCR反应后导致两个荧光团相互靠近,发生荧光共振能量转移,提供信号输出。
或者,
当检测目标物miRNA时,运用NUPACK软件设计DNA探针H1、H2、H3、H4、S、L、H5;H5的3’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补,a*、b*为H5发卡结构的环部;H1-H4和S/L的序列设计要求同目标为DNA(T)的设计要求;首先利用miRNA识别并打开H5,发卡H5被打开后释放起始序列a*-b*,此处的序列a*-b*与目标DNA(T)的序列a*、b*都是引发HCR的起始序列,因此被打开后的H5可以引发交叉催化核酸酶反应,发生荧光共振能量转移,提供信号输出;
(2)基于恒温交叉催化核酸酶反应实现DNA的检测:在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(HEPES)中,将所有探针H1、H2、H3、H4及多功能底物链S、封闭链L与目标DNA混合,探针及多功能底物S、封闭链L的浓度均为200nM在室温下孵育3h,利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度;
或者,
基于恒温交叉催化核酸酶反应实现miRNA的检测:在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液中,将所有探针H1、H2、H3、H4、H5及多功能底物S、封闭链L与miRNA混合,探针H1、H2、H3、H4、多功能底物链S、封闭链L的浓度均为200nM,探针H5的浓度为100nM,在室温下孵育3h,利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度;
上述方法中,所述的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液浓度为10mM,pH为7.2,含1MNaCl和50mM MgCl2。
进一步地,本发明提供一种miRNA-21的检测方法,其H1-H5和S/L的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-7所示。
本发明的技术原理为:
恒温交叉催化核酸酶反应(R-HCR)策略包括两个信号扩增反应单元:导入HCR反应和DNAzyme的生物催化。如图1(1)所示,引发链激活HCR反应产生了大量有催化活性的DNAzyme,该DNAzyme可循环催化底物的分解,释放出大量的新引发链序列又能反向激活HCR反应,最终导致HCR和DNAzyme催化反应的交替激活,从而逐步加速整个反应并产生显著的信号扩增。如图1(2)所示,导入HCR线路由发夹H1、H2、H3和H4组成。其中,H1的3’端和H3的5’端分别接有分裂的DNAzyme片段(f-a)和(h-g)。另外,H2的5’端和H4的3’端分别修饰荧光团TAMRA和FAM。引发链T基于Toehold介导的链置换反应原理打开发夹H1,生成中间产物T-H1。H1被打开后暴露出c-b*序列与H2杂交生成中间产物T-H1-H2。H2被打开后释放出b*-d序列可以与H3杂交,生成中间产物T-H1-H2-H3,使分裂的两个DNAzyme片段拉近生成一个完整的有催化活性的DNAzyme。H3暴露出e-b*序列可以打开H4,生成中间产物T-H1-H2-H3-H4,拉近两个荧光团(FAM和TAMRA)之间的距离发生荧光共振能量转移,提供信号输出。H4被打开后释放出与引发链T相同的序列b*-a*,从而继续打开下一个H1,即T可以引发H1、H2、H3和H4之间的交替杂交,生成双链DNA纳米线,产生大量有催化活性的DNAzyme以及FRET信号。如图1(3)所示,所述DNAzyme是依赖镁离子的具有剪切活性的脱氧核酸酶,DNAzyme的生物催化部分包含一个多功能底物链S,该底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*,a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列;在没有目标物时,将该底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏;在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体(S/L)的分解,释放出大量的引发链反向激活HCR反应。在交叉催化过程中,HCR反应中每个H2-H4杂交体均产生一个FRET信号,每个H1-H3杂交体均形成一个有催化活性的DNAzyme单元。每个组装的DNAzyme都可以产生大量的引发链去加速整个交叉催化反应的进行。这导致生成更多的DNAzyme纳米线和显著的FRET信号。此时,探针上荧光团的荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关,根据荧光团的荧光强度改变值判断目标DNA的浓度。该方法也是一个通用的检测方法,任何目标分析物只要能和外加DNA链结合如能释放出起始链(T),均可引发交叉催化核酸酶反应。因此该反应还可用于检测miRNA,首先利用miRNA识别并打开一个H5,发卡H5被打开后释放起始链,起始链(T)引发R-HCR反应,发生荧光共振能量转移。此时,探针上荧光团的荧光强度改变值与miRNA的浓度呈正相关,根据荧光团的荧光强度改变值判断miRNA的浓度。其具体原理如图1(4)所示。
本发明的第二方面提供一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的DNA检测试剂盒,包含DNA探针H1、H2、H3、H4、底物链S、封闭链L;当目标DNA(T)为含起始序列a*、b*的序列时,H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段(f-a);H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端接有分裂的DNAzyme片段(h-g),其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;a、b、c、d、e分别与a*、b*、c*、d*、e*互补。底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*-a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列。在没有目标物时,底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏。在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体S/L的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应。
本发明的第三方面提供一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA检测试剂盒,其特征在于,包含DNA探针H1、H2、H3、H4、底物链S、封闭链L、H5,H5的3’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补,a*、b*为H5发卡结构的环部,是HCR的起始序列;HCR包括H1、H2、H3、H4四个发卡,H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段(f-a);H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端接有分裂的DNAzyme片段(h-g),其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;a、b、c、d、e分别与a*、b*、c*、d*、e*互补。底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*-a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列。在没有目标物时,底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏。在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体S/L的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应。
进一步地,本发明还提供上述基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA检测试剂盒在制备细胞成像分析的产品中的应用,其具体为:将H5*(0.05nmol)和H1*+H2*+H3*+H4*+S*+L*(均为0.1nmol)的混合物分散于200μL Opti-MEM培养基中,*表示硫代修饰核酸以提高核酸在细胞中的稳定性,并将6μL Lipo 3000分散于另一份200μL Opti-MEM培养基,再将这两种混合物混匀并在室温下孵育10min。然后将以上混合液滴至种有细胞的共聚焦皿中,并在37℃下孵育4h。随后用PBS将细胞洗三次通过通过共聚焦显微镜对细胞进行成像,通过FRET信号强弱判断细胞内miRNA含量的高低。
本发明的技术效果是:本发明通过设计交叉催化核酸酶反应(R-HCR)提高了目标DNA和miRNA的检测灵敏度,在传统HCR反应基础上达到了信号的进一步扩增。体系的荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关,据此实现对目标DNA和miRNA的检测,该方法具有稳定、灵敏度高以及选择性好的优点。当用该方法检测miRNA时,只需引入与目标miRNA互补的、同时含有一段通用序列的不同的H5,而H1-H4、S、L的序列保持不变,可以达到检测不同的miRNA的目的;该方法也可以检测蛋白质,只需在H5中已入一段蛋白质对应的适配体即可,任何目标分析物只要能和外加DNA链结合如能释放出引发HCR的起始链(T),均可引发交叉催化核酸酶反应,达到检测该目标分析物的目的,因此该反应可用于检测其他核酸、蛋白等生物分子。传统HCR是N倍的信号放大,交叉催化核酸酶反应(R-HCR)是NN倍的信号放大。相比于传统HCR,我们构建的R-HCR产生了更多的DNA纳米线和更显著的FRET信号,可以提高miRNA在细胞内的成像效果。该研究有利于实现癌症的早期诊断,并进一步监测其发生发展过程。
附图说明
图1.(1)R-HCR检测目标DNA的示意图;(2)HCR的示意图;(3)DNAzyme生物催化的示意图;(4)扩展的R-HCR体系检测目标miR-21的示意图。
图2.(A)不同体系反应3h后产生的荧光光谱:缺H1的R-HCR(a)、缺H1的R-HCR+50nMT(b)、缺H3的R-HCR(c)、缺H3的R-HCR+50nM T(d)、SM取代的R-HCR(e)、SM取代的R-HCR+50nMT(f)、R-HCR(g)和R-HCR+50nM T(h)。插图:总结(A)中荧光强度的变化值;(B)R-HCR和传统HCR系统的凝胶电泳表征。“+”和“-”分别表示存在和不存在相应组分;(C)R-HCR产生的纳米线的AFM成像和横截面分析;(D)无引发链的R-HCR体系的AFM表征。
图3.(A)R-HCR线路分析不同浓度引发链T时的荧光动力学变化;(B)R-HCR体系分析不同浓度T后的荧光光谱图。(a)0,(b)1×10-11,(c)5×10-11,(d)1×10-10,(e)5×10-10,(f)1×10-9,(g)5×10-9,(h)1×10-8,(i)2.5×10-8和(j)5×10-8M。内插图:R-HCR体系的线性曲线;(C)R-HCR(a)和HCR(b)线路的检测灵敏度的比较;(D)R-HCR线路检测50nM的不同分析物后的荧光光谱图:a,无分析物;b,TC;c,TB;d,TA;e,T。内插图:总结(D)中荧光强度的变化值。
图4.(A)扩展的R-HCR体系在无(a)和有(b)50nM miR-21时的时间相关荧光强度变化;(B)R-HCR线路分析不同浓度miR-21后的荧光光谱图和线性分析(内插图)。(a)0,(b)1×10-11,(c)5×10-11,(d)1×10-10,(e)5×10-10,(f)1×10-9,(g)5×10-9,(h)1×10-8,(i)3×10-8和(j)5×10-8M;(C)R-HCR系统分析50nM不同分析物后的荧光光谱图和荧光强度变化值(内插图):a,无分析物;b,β-actin mRNA;c,miR-122;d,son DNA;e,miR-21;(D)扩增的R-HCR系统在不同浓度血清样品中的检测性能:(a)缓冲液中的0M miR-21,(a’)缓冲液中的50nM miR-21,(b)10%血清中的0nM miR-21,(b’)10%血清中的50nM miR-21,(c)20%血清中的0nM miR-21和(c’)20%血清中的50nM miR-21。
图5.(A)R-HCR线路分析活细胞内miR-21的CLSM图:a,R-HCR分析MCF-7细胞;b,HCR分析MCF-7细胞;c,R-HCR分析miR-21抑制剂处理后的MCF-7细胞;d,缺H1的R-HCR分析MCF-7细胞;e,R-HCR分析HeLa细胞;f,R-HCR分析MRC-5细胞。比例尺为20μm;(B)从(A)中获得的FRET信号(FA/FD)分布;(C)从(A)中大量活细胞收集的FRET信号(FA/FD)的统计直方图分析。比例尺为20μm。
图6.(A)通过传统的光漂受体技术测定R-HCR成像系统在单个MCF-7细胞中的FRET效率。选择MCF-7细胞的一个区域为例,说明了如何通过对FAM/TAMRA(供体/受体)的TAMRA受体进行光漂来获得R-HCR成像系统的FRET效率。TAMRA受体光漂前(a)和光漂后(b)R-HCR成像系统分析MCF-7活细胞内miR-21的CLSM图。所有标尺为20μm。
(B)通过常规FRET AB技术从大量MCF-7活细胞中收集的R-HCR成像系统的FRET效率。
图7扩展的R-HCR成像系统分析活细胞内miR-21的CLSM三维图:a,FAM的荧光(FD);b,TAM的荧光;c,荧光共振能量转移产生的荧光(FA);d,FA/FD。该三维图是通过Z轴层扫得到的包含34层(每层0.2μm)二维MCF-7细胞图。
比例尺为20μm。
图8.(A)用不同系统检测MCF-7细胞内miR-21的CLSM图:(a)完整的R-HCR成像系统;(b)HCR成像系统;(c)缺发夹H1的R-HCR成像系统;(d)缺发夹H3的R-HCR成像系统。以上系统的孵育时间为4h。比例尺为20μm。(B)从(A)中大量活细胞收集的FRET信号(FA/FD)的统计直方图分析。比例尺为20μm。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1
DNA探针的设计:运用NUPACK软件设计相关DNA探针,并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。在没有目标物时保证每个发卡的茎端有足够的碱基互补配对,能够保持自身的稳定性,荧光保持不变,但在有目标物存在时能够引发恒温交叉催化核酸酶反应,发生荧光共振能量转移,实现目标物的检测。所有DNA探针干粉先用磷酸盐缓冲液溶解,用紫外分光光度计测其吸光度,计算出准确浓度,然后用HEPES缓冲液(浓度为10mM,pH 7.2,含1M NaCl和50mM MgCl2)将所有DNA探针配成4μM,在PCR中95℃5min,25℃2h,让其形成稳定的发卡。反应均在HEPES缓冲液中进行。
图1(1)为恒温交叉催化核酸酶反应用于DNA检测的原理图。在HEPES缓冲液中将DNA反应物(HCR:H1+H2+H3+H4+SM+L,R-HCR:H1+H2+H3+H4+S+L,均为200nM)混合并在25℃下孵育3h,采用荧光光谱仪对HCR和R-HCR体系进行分析,结果如图2所示。由图2(A)可见,在缺失H1或H3发夹的R-HCR体系中加入引发剂时该体系荧光不会发生变化(图2(A)的曲线b、d),用腺嘌呤脱氧核苷酸取代底物中的腺嘌呤核糖核苷酸而产生无法被DNAzyme剪切的底物链(SM)来探讨DNAzyme的生物催化对整个交叉催化放大反应的影响。当SM取代的R-HCR系统(一种典型的传统HCR放大反应)与分析物孵育时,获得了相对较低的荧光响应(图2(A)的曲线f),而完整的R-HCR系统在分析目标物时产生了显著的荧光响应(图2(A)的曲线h),新提出的R-HCR放大反应具有指数扩增效率(1:NN),远远高于传统HCR的扩增效率(1:N)。这些结果证明了HCR与DNAzyme反应实现了一个很好的协同增强效果,以及我们提出的交叉催化放大反应确实具有显著的信号扩增能力。
采用凝胶电泳对R-HCR产物进行表征,配置HCR反应液:在HEPES缓冲液中H1、H2、H3、H4、SM、L浓度均为200nM,T为25nM;配置R-HCR反应液:在HEPES缓冲液中H1、H2、H3、H4、S、L浓度均为200nM,T为25nM;以上反应均在室温下反应3h。将反应液与loading buffer混匀后加入9%丙烯酰胺凝胶中,电泳仪电压设置为120V,3.5h后取出凝胶用GelRed进行染色,最后通过化学发光成像系统在紫外光线下使DNA显现。电泳结果如图2(B)所示。由图2(B)可见,由于在R-HCR系统中用于激活HCR反应的引发链不断积累,目标物激活的R-HCR系统相比于传统HCR系统产生了更多大分子量的产物。这个结果与荧光实验结果是一致的。
采用原子力显微镜对R-HCR产物进行表征,配置HCR反应液:在HEPES缓冲液中H1、H2、H3、H4、SM、L浓度均为200nM,T为10nM;配置R-HCR反应液:在HEPES缓冲液中H1、H2、H3、H4、S、L浓度均为200nM,T为10nM;以上反应均在室温下反应3h。新剥的云母片需用90μL(3-aminopropyl)trimethoxysilane(APTES)和30μL N,N-diisopropylethylamine(DIPEA)的蒸汽进行预处理2h,使其带正电,该过程在干燥器中进行。将DNA样品稀释至20nM后滴在云母片上,15min后用超纯水洗三遍,氮气吹干,用原子力显微镜进行扫描。结果如图3(C)和3(D)所示,分析物引发的R-HCR系统获得了大量微米长的线性DNA纳米结构(高度约为1.5nm)(图3(C)),而在没有引发链的R-HCR系统仅出现发卡单体的微小斑点(图3(D)。总之,这些结果证明了交叉催化R-HCR系统的成功构建,以及R-HCR系统具有显著的信号扩增能力。
实施例2
基于恒温交叉催化核酸酶反应的DNA检测
在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(浓度为10mM,pH 7.2,含1M NaCl和50mM MgCl2)中,将所有DNA反应物(H1、H2、H3、H4、S和L均为200nM)与不同浓度的引发链T(0,1×10-11,5×10-11,1×10-10,5×10-10,1×10-9,5×10-9,1×10-8,2.5×10-8,5×10-8M)混合,在室温下孵育3h,利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压600V,激发狭缝为5nm,发射狭缝为10nm,激发波长490nm,波长扫描范围505-650nm)。
由图3(A)可见,在R-HCR体系中没有加入目标DNA时,每个DNA探针都能保持自身的稳定性,该体系荧光只发生微小的变化(图3(A)中的曲线a),当加入不同浓度的目标DNA时,荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关,据此可对目标DNA进行检测。由图3(B)可见,随着目标DNA浓度的增加,体系的荧光强度(λ=520nm)逐渐下降,该荧光强度的改变值与目标DNA浓度在0.01-1nM范围内呈良好的线性关系,检出限为5.9pM,实现了对目标DNA的快速和高灵敏性检测。
为了论证R-HCR相对于SM取代的R-HCR放大器(相当于传统HCR放大器)有进一步的扩增,将R-HCR体系和传统HCR体系同时用于检测不同浓度的靶标DNA分子(图3(C)),对比发现,R-HCR体系的灵敏度更高,检测效果更好。
为了论证本方法对目标DNA检测的选择性,在目标DNA中引入一个碱基错配TA、两个碱基错配TB和三个碱基错配TC进行考察。由图3(D)可见,只有与目标DNA(T)作用时,体系的荧光才会发生显著的变化(图3(D)中的曲线e),两个碱基错配TB和三个碱基错配TC引起的荧光变化非常小(图3(D)中的曲线c,曲线b),单碱基错配TA引起的荧光变化(图3(D)中的曲线d)与目标DNA引起的荧光变化有显著的差别,以上结果表明,本发明方法对目标DNA检测有良好的选择性。
实施例3
基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA-21体外检测
在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(浓度为10mM,pH 7.2,含1M NaCl和50mM MgCl2)中,将所有DNA反应物(H1、H2、H3、H4、S、L均为200nM,H5为100nM)与不同浓度的miRNA-21(0,1×10-11,5×10-11,1×10-10,5×10-10,1×10-9,5×10-9,1×10-8,3×10-8,5×10-8M)混合,在室温下孵育3h,利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压600V,激发狭缝为5nm,发射狭缝为10nm,激发波长490nm,波长扫描范围505-650nm)。
图1(4)为恒温交叉催化核酸酶反应用于miRNA-21检测的原理图。由图4(A)可见,在R-HCR体系中没有加入miRNA-21时,每个DNA探针都能保持自身的稳定性,该体系荧光只发生微小的变化(图4(A)中的曲线a),当加入不同浓度的miRNA-21时,荧光强度改变值与miRNA-21的浓度呈正相关,据此可对miRNA-21进行检测。由图4(B)可见,随着miRNA-21浓度的增加,体系的荧光强度(λ=520nm)逐渐下降,该荧光强度的改变值与miRNA-21浓度在0.01-1nM范围内呈良好的线性关系,检出限为6.8pM,实现了对miRNA-21的快速和高灵敏性检测。
为了论证本方法对miRNA-21检测的选择性,选取β-actin mRNA,son DNA和miR-122为干扰组分进行考察。由图4(C)可见,只有与miRNA-21作用时,体系的荧光才会发生显著的变化(图4(C)中的曲线e),β-actin mRNA,son DNA和miR-122引起的荧光变化非常小(图4(B)中的曲线b,c,d),以上结果表明,本发明方法对miRNA-21检测有良好的选择性。
考察R-HCR体系在血清溶液中的稳定性,结果如图4(D)所示,R-HCR体系在10%血清和20%血清中检测目标物时基本不受干扰,表明该体系在复杂的生物环境中也可以实现目标物的检测。
表1.用于miRNA-21体外检测的DNA探针
实施例4
基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA-21的细胞成像分析
在37℃、5%CO2的环境下,人乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)均在含有10%胎牛血清的DMEM中培养,人胚肺成纤维细胞(MRC-5)在含有10%胎牛血清的MEM(alpha)中培养。将细胞种到20mm的玻璃底共聚焦皿中生长12h,然后进行DNA探针的转染。详细步骤如下,将H5*(0.05nmol)和H1*+H2*+H3*+H4*+S*+L*(均为0.1nmol)的混合物分散于200μL Opti-MEM培养基中,并将6μL Lipo 3000分散于另一份200μL Opti-MEM培养基,再将这两种混合物混匀并在室温下孵育10min。然后将以上混合液滴至种有细胞的共聚焦皿中,并在37℃下孵育4h。随后用PBS将细胞洗三次并用激光共聚焦扫描显微镜对其进行拍摄。对于anti-miRNA抑制剂的实验,先将anti-miRNA抑制剂(终浓度为100nM)转染至MCF-7细胞并孵育2h,然后再转染上述R-HCR系统并孵育4h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。
表2.用于活细胞成像的DNA探针:
*代表碱基进行了硫代修饰(Phosphorothioate Bonds),在进行细胞实验时,可以提高核酸的稳定性;m代表RNA碱基进行了甲氧基修饰(2’-O-Me RNA base),在进行细胞实验时,可以提高RNA的稳定性。
由图5(A)可见,我们在MCF-7细胞中观察到极其强烈的FRET信号(样品a,图5(A)),而在HeLa细胞中只观察到较弱的FRET信号(样品e,图5(A)),在MRC-5细胞中没有检测到FRET信号(样品f,图5(A)),表明miR-21在肿瘤细胞中的表达水平高于正常细胞,这与以前的报道一致。这些结果表明R-HCR成像系统可以根据miR-21的表达差异区分不同种类的细胞,并且可以实现活细胞中miRNA的精确定位。此外,R-HCR成像系统在anti-miRNA反义寡核苷酸预处理的MCF-7细胞中出现了明显降低的FRET信号(样品c,图5(A)),这表明miR-21分子确实存在于MCF-7细胞中并激活了R-HCR系统。它还揭示了我们提出的交叉催化成像系统的准确性和灵敏性。我们利用ImageJ收集图5(A)中细胞图像的每个像素的FRET信号(FA/FD),相应的FRET信号分布的散点图进一步证明了R-HCR放大器具有强大的细胞内生物成像效果(图5(B))。如图5(C)所示是R-HCR成像系统的FRET信号(FA/FD)的统计直方图分析。我们进一步通过常规受体光漂方法获得了R-HCR成像系统在细胞内的FRET效率为0.63(图6)。以上结果表明,R-HCR成像系统成功实现了不同活细胞内miR-21的原位检测。此外,我们利用共聚焦成像系统Z轴层扫整个MCF-7细胞获得了一系列z截面图像,然后利用ImageJ软件整合这些z截面图像得到细胞的三维立体图。显然,内源性miR-21分子主要分布在MCF-7细胞的细胞质中(图7)。表明R-HCR成像系统实现了单细胞水平的miRNA的精确定位。为了进一步证明R-HCR成像系统强大的扩增能力,我们从反应物中去除非荧光团标记的发夹或用突变底物(SM)取代底物(S)进行一系列对照实验。与完整的R-HCR成像系统(样品a,图8)相比,缺H1或H3的R-HCR成像系统在MCF-7细胞中几乎没有产生FRET信号(样品c、d,图8);同时,SM取代的R-HCR系统(传统HCR)在MCF-7细胞中出现较弱的FRET信号(样品b,图8)。与传统HCR系统相比,交叉催化体系积累的引发链能产生更多的双链DNA纳米线和更强的FRET信号(样品a,图8)。此外,以上结果还表明HCR和DNAzyme这两个扩增模块对协同扩增体系的构建是缺一不可的,与之前的体外研究一致。R-HCR成像系统作为一个通用的、可靠的传感策略,在临床诊断和预后方面具有广阔的应用前景。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacactgaga gatgaagatg aagccatacc gcttcatctt catctctcta ggcacccatg 60
ttacact 67
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctc 64
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<211> 48
<212> DNA
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gcttcatctt catctctcag tgtagagaga tgaagatgaa gcctggtt 48
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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ta 62
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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uggaguguga caaugguguu ug 22
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<212> RNA
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acucccagau guuagcaac 19
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<212> RNA
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
Claims (5)
1.一种非诊断目的的基于恒温交叉催化核酸酶反应的核酸分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)DNA探针、多功能底物链S及封闭链L的设计:目标DNA T为含起始序列a*、b*的序列,运用NUPACK软件设计DNA探针H1、H2、H3、H4、S、L;H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段f-a;H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端分别接有分裂的DNAzyme片段h-g,其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团, 为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;目标物的a*、b*先跟H1中a、b杂交从而打开H1,生成中间产物T-H1;H1被打开后释放出c、b*,H1中c、b*可以与H2中的b、c*杂交,生成中间产物T-H1-H2,H2被打开后释放出b*、d序列可以与H3杂交从而打开H3,H3被打开后释放出e、b*,生成中间产物T-H1-H2-H3,同时使分裂的两个DNAzyme片段f-a和h-g拉近生成一个完整的有催化活性的DNAzyme;H3中e、b*可以与H4中的e*、b杂交,生成中间产物T-H1-H2-H3-H4,拉近两个荧光团FAM和TAMRA之间的距离发生荧光共振能量转移,提供信号输出;H4被打开后释放出b*、a*,该释放出来的序列与T序列一样,因此被打开后的H4又可以跟H1杂交;所述DNAzyme是依赖镁离子的具有剪切活性的脱氧核酸酶,DNAzyme的生物催化部分包含一个多功能底物链S,该底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*,a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG 代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列;在没有目标物时,将该底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏;在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体S/L的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应;在交叉催化过程中,HCR反应中每个H2-H4杂交体均产生一个FRET信号,每个H1-H3杂交体均形成一个有催化活性的DNAzyme单元;每个组装的DNAzyme都可以产生大量的引发链去加速整个交叉催化反应的进行;这导致生成更多的DNAzyme纳米线和显著的FRET信号;在没有目标物T时,发卡H1、H2、H3、H4能保持自身的稳定性,无法发生HCR反应;当有目标物T时,就可以引发HCR和DNAzyme之间的交叉催化反应,由于H2上标记有TAMRA荧光团,H4上标记有FAM荧光团,目标DNA T引发HCR反应后导致两个荧光团相互靠近,发生荧光共振能量转移,提供信号输出;
(2)基于恒温交叉催化核酸酶反应实现DNA的检测:在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(HEPES)中,将所有探针H1、H2、H3、H4及多功能底物链S、封闭链L与目标DNA混合,探针及多功能底物链S、封闭链L的浓度均为200 nM在室温下孵育3 h,利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度;
所述的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液浓度为10 mM,pH为7.2,含1 M NaCl和50 mMMgCl2。
2.一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的DNA检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含DNA探针H1、H2、H3、H4、底物链S、封闭链L;当目标DNA T为含起始序列a*、b*的序列时,H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段f-a;H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端接有分裂的DNAzyme片段h-g,其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团, 为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;a、b、c、d、e分别与a*、b*、c*、d*、e*互补;底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*-a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG 代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列;在没有目标物时,底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏;在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体S/L的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应。
3.一种基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA检测试剂盒,其特征在于,包含DNA探针H1、H2、H3、H4、底物链S、封闭链L、H5,H5的3’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补,a*、b*为H5发卡结构的环部,是HCR的起始序列;HCR包括H1、H2、H3、H4四个发卡,H1包括a、b、c、b*、f-a五个部分,其中b与b*互补成双链作为H1茎部,c为发卡结构的环部,a为H1的5’端单链黏性末端,H1的3’端接有分裂的DNAzyme片段f-a;H2包括b*、d、b、c*,其5’端标记有TAMRA荧光团,d为H2的发卡结构的环部,c*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H2茎部;H3包括b*、e、b、d*、g-h五部分,e为H3的发卡结构的环部,d*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端,H3的5’端接有分裂的DNAzyme片段h-g,其中b与b*互补成双链作为H3茎部;H4包括b*、a*、b、e*,其3’端标记有FAM荧光团, 为报告荧光基团,a*为H4的发卡结构的环部,e*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端,其中b与b*互补成双链作为H4茎部;a、b、c、d、e分别与a*、b*、c*、d*、e*互补;底物链S由b*,a*,TrAG,h*和j组成,其中b*-a*是T序列,a*,h*是与DNAzyme杂交的序列,TrAG 代表剪切位点,rA代表腺嘌呤核糖核苷酸,DNAzyme可以与a*、h*杂交并将rA和G之间切开,从而释放出更多的引发链T序列;在没有目标物时,底物链S与封闭链L杂交以防止引发链的释放造成信号泄漏;在有目标物时,目标物激活HCR产生大量具有催化活性的DNAzyme,每一个DNAzyme在镁离子存在下都能循环催化大量底物杂交体S/L的分解,释放出大量的引发链T反向激活HCR反应。
4.权利要求3所述的基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA检测试剂盒在制备细胞成像分析的产品中的应用,其特征在于,将0.05 nmol H5*和0.1 nmol H1*、0.1 nmol H2*、0.1nmol H3*、0.1 nmol H4*、0.1 nmol S*、0.1 nmol L*形成的混合物分散于200 μL Opti-MEM培养基中,*表示硫代修饰核酸以提高核酸在细胞中的稳定性,并将6 μL Lipo 3000分散于另一份200 μL Opti-MEM培养基,再将这两种混合物混匀并在室温下孵育10 min,然后将以上混合液滴至种有细胞的共聚焦皿中,并在37 °C下孵育4 h,随后用PBS将细胞洗三次通过共聚焦显微镜对细胞进行成像,通过FRET信号强弱判断细胞内miRNA含量的高低。
5.权利要求3所述的基于恒温交叉催化核酸酶反应的miRNA检测试剂盒在制备检测miRNA-21的产品中的应用,其特征在于,所述H1-H5、S、L的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-5、8、10所示。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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