CN101831500A - 一种小rna的定量检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种小rna的定量检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了可用于对小RNA进行表达分析的一种小RNA的定量检测方法和试剂盒，该方法通过bulge loop RT引物将小RNA反转录为cDNA，加入PCR正向引物和PCR通用反向引物进行定量PCR扩增。本发明所述的小RNA的定量检测方法和试剂盒具有灵敏度高，特异性好和试剂盒价廉等优点，且可用于批量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种小RNA的定量检测方法及试剂盒。
背景技术
生物体内的小RNA包括microRNA(微小RNA，miRNA)、small interference RNA(小干扰RNA，siRNA)、piwi protein related RNA(piwi蛋白相关RNA，piRNA)、small nuclearRNA(胞核小RNA，snRNA)、small nucleolar RNA(核仁小RNA，snoRNA)等，这些小RNA在生物体内发挥多种多样的功能，miRNA与siRNA主要负调节编码基因的表达，piRNA主要正调控基因的表达，snRNA参与蛋白的加工成熟，snoRNA参与剪接rRNA，随着研究的深入，各种小RNA的新的功能和机制被正在不断的被研究揭示。
miRNA是目前研究最热门的小RNA之一，它是一类长度约为22bp，由dicer酶从有特定二级结构的前体剪切加工成熟的，通过与mRNA完全或不完全配对来调节基因的表达的RNA分子，它属于非编码小RNA家族的一员，在物种之间是保守的。目前在miRNA数据库中(http://www.sanger.ac.ck/)注册的人的miRNA为695条(Griffiths-Jones et al.，2008)。miRNA参与调节细胞的生长，繁殖，分化，调亡等生命过程。超过一半的人类miRNA基因在基因组的位置被认为与癌症有关，如脆性位点，扩增相关的窄位点区，或者断裂位点区。
siRNA是指在RNAi过程中诱发同源mRNA高效特异降解的双链小RNA。19个核苷酸的siRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了(Brummelkamp.T.R，Bernads.R，Agami.R.A system for stable expression ofshort interering RNAs in Mammalian cells.Science.2002；296：550-553)。siRNA可以在生物体内自主产生，也可以通过体外制造后转染进体内。
piRNA是从哺乳动物生殖细胞分离得到的一类长度约为30个核苷酸的单链小RNA，它与piwi家族蛋白结合发挥基因的表达调控作用(Aravin.A，et al.，A novel class of smallRNAs bind to MILI protein in mouse testes.Nature，2006；442(7099)：203-207；Girard.A，et al.，A germline specific class of small RNAs binds mammalian PIWI proteins.Nature，2006，442(7099)：199-202.)。目前对其生成和功能机制了解较少。
目前检测小RNA的方法主要包括northern印迹、invader assay、定量PCR，microarray等方法。northern印迹法操作繁琐，检测灵敏度低，而且有可能用到放射性探针。Invaderassay需要一个信号探针和一个侵入探针，信号探针的5‘端与靶miRNA部分不配对，这部分在侵入探针存在的情况下被核酸外切酶切除，同时产生荧光信号，这种方法需要使用荧光探针，缺少扩增作用，检测灵敏度受到显著(Allawi.H et al.，Quantitation of microRNAsusing a modified invader assay.RNA 2004，10：1153-1161.)。直接定量PCR方法可以用来检测小RNA的前体，无法用来检测短片段的小RNA，后来对定量PCR进行了改进，采用人为延长小RNA的方法达到定量检测小RNA的目的(chen.KF et al.，2005)，但是该方法需要使用Taqman探针。microarray’是在northern检测RNA基础上建立的一种芯片杂交方法，但是这种方法的检测灵敏度低，假阳性率高，可能要使用放射性探针。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种小RNA的检测方法，该方法可以高灵敏度，高特异性的扩增小RNA，，从而可用于小RNA的表达谱研究。
实现上述目的的技术方案如下：
一种小RNA的检测方法，包括以下步骤：
(1)bulge loop RT引物将小RNA反转录为cDNA，所述bulge loop RT引物具有40-60个核苷酸，优选具有46-52核苷酸，从5’端至3‘端有分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环的部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；
(2)加入PCR正向引物和PCR通用反向引物进行定量PCR扩增，正向PCR引物为具有20-40个核苷酸序列，优选为28-32个核苷酸序列，从5’端至3‘端分为两部分，分别为延伸部分，小RNA相似部分；小RNA相似部分的长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和要大于或等于小RNA的全长；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列的一部分(即与小RNA序列中的一段相同，只是在小RNA中为U的碱基在茎环结构的引物中为T碱基)；PCR反向通用引物长度为具有20-40个核苷酸的序列，优选为28-35个核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种小RNA定量检测试剂盒，该试剂盒通过有效扩增小RNA，可用于小RNA的表达谱研究。
具体技术方案如下：
一种小RNA定量检测试剂盒，主要包括有：
(A)具有40-60个核苷酸的bulge loop RT引物，优选具有46-52核苷酸，从5’端至3‘端有分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；
(B)具有20-40个核苷酸的正向PCR引物，优选为28-34个核苷酸序列，从5’端至3‘端分为两部分，分别为延伸部分，小RNA相似部分，小RNA相似部分的长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和大于或等于小RNA的全长；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列；PCR反向通用引物长度为具有20-40个核苷酸的序列，优选为28-35个核苷酸序列。
优选地，还包括有具有20-40个核苷酸(优选为28-35个核苷酸序列)的PCR反向通用引物。
其中，优选地，所述的茎3的部分长度为6-12碱基对，最好为8-10碱基对。
所述延伸部分的长度为3-12个碱基，最好为6-8碱基。
所述正向引物的长度为20-35碱基，最好为28-32个碱基。
所述反向引物为通用引物，若干个甚至所有小RNA可以共用同一条引物。
所述bulge loop RT引物的延伸部分可以进行化学修饰，如LNA，甲基化等。
所述PCR反向引物可以进行化学修饰如LNA(Locked Nucleic Acid)修饰，甲基化修饰等。
所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：1的序列；正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：3；所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：2的序列；正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：4；所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：6的序列；正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：7。
所述PCR反向通用引物为SEQ.NO：5。
本发明所述的小RNA的定量检测方法和试剂盒通过对小RNA的延长，然后进行定量扩增，可用于对小RNA进行表达分析，该小RNA包括细胞及组织中(包括动、植物)本身存在的非编码RNA或者体外合成的小RNA片段；可为miRNA或siRNA，长度为15-60个核苷酸。所述小RNA为单链也可为双链。本发明所述的小RNA的定量检测方法和试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好和试剂盒价廉等优点，且可用于批量检测。
附图说明
图1、stem loop结构的RT引物图及bulge loop结构的RT引物；
图2、本方法的小RNA检测原理图；
图3、检测miRNA表达时miRNA在芯片上的排布图；
图4、miRNA在A549、Hela细胞中的表达量检测结果示意图；
图5、miRNA在人体分泌物、精液、血液中的表达量检测结果示意图；
图6、miRNA在白血病人白细胞中的表达量检测结果示意图
图7、miRNA在组织中的表达量检测结果示意图；
图8、检测化学合成梯度稀释的hsa-let-7a类似物的结果示意图；
图9、Bulge loop引物特异性检测结果示意图；
图10、stem loop引物特异性检测结果示意图；
图11、两种结构引物检测化学合成梯度稀释的hsa-let-7a类似物的结果示意图；
图12、改变茎环结构后检测小RNA的结果示意图。
图13、LNA化学修饰后的引物检测hsa-let-7家族类似物的结果示意图；
图14、小RNA检测芯片技术检测细胞样本miRNA表达结果示意图；
图15、小RNA检测芯片技术检测血样miRNA表达结果示意图；
图16、小RNA检测芯片技术检测组织样本miRNA表达结果示意图。
具体实施方式
本发明中，提供了小RNA的定量检测方法和试剂盒，其中，所述的bulge loop RT引物具有40-60个核苷酸，优选具有46-52核苷酸，从5’端至3‘端有分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环的部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对，如图1所示。bulge loop RT引物的二维结构与stem loop的二维结构不同，bulge loop RT引物的结构中，外面的大茎环结构中的环部分又形成了一个小的茎环结构，其用于小RNA的定量扩增的效果也具有明显的提高。
本发明的检测原理如图2所示。
本发明所提供的小RNA的定量检测方法和试剂盒，可用于批量检测小RNA的表达，例如，可以制备成小RNA定量检测芯片，该芯片可同时检测多个小RNA，最好是90个或者378个小RNA。该芯片设有2个阳性对照基因和一个阴性对照序列的检测，每个阳性或者阴性对照基因重复两次；这两个阳性基因分别为U6，5S，阴性对照序列为人工合成的随机序列，检测基因在芯片上的分布见图3。
实施例一：检测细胞中miRNA的表达
以检测A549，HeLa，HEK293细胞中hsa-let-7a，hsa-miR-10b的表达为例。
1、相关引物设计
1)、Bulge loop结构的RT引物：
hsa-let7a-RT1：(SEQ.NO：1)GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTATAC
hsa-miR10b-RT1：(SEQ.NO：2)GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCCACAAATT
2)、PCR正向引物
hsa-let7a-F1：CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGGTTGA(SEQ.NO：3)
hsa-miR10b-F1：CAGACGACCATCAGTACCCTGTAGAACCGAA(SEQ.NO：4)
3)、通用反向引物
G-R1：GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT(SEQ.NO：5)
2、cDNA制备
分别用A549，Hela，HEK293细胞为材料，以Invitrogen公司Trizol裂解细胞，加入氯仿异丙醇按常规操作提取细胞总RNA，将浓度为50mM的hsa-let7a-RT，hsa-miR10b-RT，oligo(dT)15引物各0.3uL混合加入1ug总RNA中，以Promega公司的MMLV反转录酶将总RNA反转录为cDNA(操作步骤见说明书)。
3、PCR反应
各取从A549，Hela，HEK293细胞为材料逆转录的cDNA产物2.0μL做模板，利用SYBRGreen I染料实时定量PCR试剂盒检测三种细胞系中miRNA的表达，并以无RNA酶水作为阴性模板对照，以β-Actin作为内参。定量PCR反应条件为：95℃预变性10s；95℃变性5s；60℃退火20s；72℃延伸1s；40个循环。将β-Actin表达量作为100％研究其它miRNA的相对表达量。结果表明此方法对阴性对照(control)无检测，可扩增成熟的miRNA，并且有很好的特异性如图4。
实施例二
检测人体分泌物、血液、精液中表达的miRNA
人体分泌物包括唾液、阴道分泌物，汗液等。唾液、精液等液体样本按照1∶3的比例加入Trizol抽提RNA，阴道分泌物以棉签转移至EP管中加入Trizol进行RNA抽提。血样以EDTA抗凝管收集血样，取部分作为全血样本，抗凝处理后的血液，4度4000rpm离心10min，上层即为血浆。血浆样本按1∶3的比例加入Trizol抽提RNA。引物序列见实施例一，miRNA检测结果如图5，检测结果表明此方法能用于人体分泌物中小RNA的检测。
实施例三
检测血液中表达的miRNA
以人血样检测miR-150为例，以U6作为内参，血液采集后离心收集白细胞，白细胞的RNA提取及miRNA的检测过程同实施例一，miR-150及U6相关引物序列如下：
| 名称 | 序列5’-3’ | SEQ |
| hsa-miR150-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCCACTGGTA | 6 |
| hsa-miR150-F1 | CAGACGACCATCAGTCTCCCAACCCTTGTA | 7 |
| G-R1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT | 5 |
检测结果表明此方法可以从血细胞中检测miRNA的表达(图6)。
实施例四
检测组织中表达的miRNA
以人体手术后的脑组织样本检测hsa-let-7a，hsa-miR-10b，hsa-miR-150为例，以U6作为内参，此三个miRNA的引物序列同实施例一，实施例三。脑组织样本加液氮研磨至粉末状，后续的总RNA的提取同实施例一。检测结果表明，此研究方法可用于组织miRNA的扩增。(图7)。
实施例五
检测化学合成并梯度稀释的miRNA类似物
以广州市锐博生物科技有限公司化学合成的let-7a类似物为例，let-7a类似物化学合成的为双链，其序列如下：
5’UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 3’SEQ.NO：8
3’ACUCCAUCAUCCAACAUAUCAA 5’SEQ.NO：9
let-7a的茎环结构的RT引物，PCR正向引物，PCR通用反向引物同实施例一。
合成后的let-7a类似物进行梯度稀释，至使检测终浓度分别为4nM，40pM，400fM，4fM，4X10E-1fM，4X10E-2fM，4X10E-3fM。梯度稀释后的let-7a类似物的反转录及PCR程序同实施例一。检测结果显示此方法对化学合成后梯度稀释的let-7a类似物能很好的检测，并且成良好的线性关系，R2＝0.9907(如图8所示)。
实施例六
检测化学合成的miRNA家族，其家族成员间的区别为一个或几个核苷酸
以人类let-7家族为例，合成的家族成员类似物如下表，分别以bulge loop和stem loop结构的引物对其进行扩增，所有的let-7家族成员类似物及引物均由广州市锐博生物科技公司合成：
人类let-7家族类似物如下表
设计合成的bulge loop引物序列如下表：
| 引物名称 | 序列5’-3’ | SEQ. |
| hsa-let7e-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTATAC | 1 |
| hsa-let7f-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTATAC | 1 |
| hsa-let7g-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTGTAC | 18 |
| hsa-let7i-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACAGCAC | 19 |
| hsa-let7e-F1 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGGAGGTTGT | 20 |
| hsa-let7f-F1 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGATTGT | 21 |
| hsa-let7g-F1 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGTTTGT | 22 |
| hsa-let7i-F1 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGTTTGT | 22 |
| G-R1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT | 5 |
设计合成的stem loop结构的引物序列结构如下表：
| 引物名称 | 序列5’-3’ | SEQ. |
| hsa-let7e-RT2 | GCTACTCAACTGAGGGTAGGTGCCGTATTCCAGTTGAGTAGCAACTATAC | 23 |
| hsa-let7f-RT2 | GCTACTCAACTGAGGGTAGGTGCCGTATTCCAGTTGAGTAGCAACTATAC | 23 |
| hsa-let7g-RT2 | GCTACTCAACTGAGGGTAGGTGCCGTATTCCAGTTGAGTAGCAACTGTAC | 24 |
| hsa-let7i-RT2 | GCTACTCAACTGAGGGTAGGTGCCGTATTCCAGTTGAGTAGCAACAGCAC | 25 |
| hsa-let7e-F2 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGGAGGTTGU | 26 |
| hsa-let7f-F2 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGATTGT | 21 |
| hsa-let7g-F2 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGTTTGT | 22 |
| hsa-let7i-F2 | CAGACGACCATCAGTGAGGTAGTAGTTTGT | 22 |
| G-R2 | GCTACTCAACTGAGGGTAGGTGCCGTATTCCA | 27 |
合成的四个let-7家族类似物配成一定浓度，使定量PCR检测时的终浓度为4nM，并用let-7e，let-7f，let-7g，let-7i所对应的引物分别检测let-7e，let-7f，let-7g，let-7i。cDNA的合成同实施例一。检测结果表明此两种结构的引物均可以特异性的区分几个甚至一个核苷酸差异的miRNA(图9，图10)。
实施例七
Stem loop与bulge loop结构的引物分别对小RNA检测效果
以化学合成的let-7a类似物为例，对其进行梯度稀释后进行定量扩增，两种结构的引物均能对小RNA进行扩增，结果显示bulge loop结构的引物对小RNA检测的灵敏度要稍好于stem loop结构的引物。引物序列如下表，检测结果如图11。
实施例八
改变bulge loop RT引物的结构检测其对小RNA检测的影响
以检测化学合成的let-7a类似物为例，说明改变茎环结构引物的结构对最终检测效果的影响。引物设计如下表：
| 引物名称 | 序列5’-3’ | SEQ. |
| Hlet7a-RT1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTATAC | 1 |
| Hlet7a-RT11 | GCACTTCAGTGGTCAGTGAATTTGAAGTGCAACTATAC | 29 |
| Hlet7a-RT12 | GCACTTCAGTGTCGTGGTGACGGCAATTTGAAGTGCAACTATAC | 30 |
| G-R1 | GCACTTCAGTGTCGTGGTCAGTGACGGCAATT | 5 |
| G-R11 | GCACTTCAGTGGTCAGTGAATTTGAA | 31 |
| G-R12 | GCACTTCAGTGTCGTGGTGACGGCAATT | 32 |
hsa-let7a-RT1的结构利用结构分析软件RNAstructure 4.0分析，其结构为一个bulgeloop的结构，即外面的大茎环结构中的环部分又形成了一个小的茎环结构，图1B所示。hsa-let7a-RT11是在Hlet7a-RT的结构基础上去掉内部的小茎环，即5对核苷酸(bulge部分)，图1A所示；hsa-let7a-RT12是在hsa-let7a-RT的基础上去掉小环上的4个核苷酸。化学合成的let-7a类似物稀释成一定浓度，并使最终检测浓度为4nM。cDNA的制备及定量PCR反应程序同实施例一。检测结果显示：相对于hsa-let7a-RT(红色曲线标示)的检测结果，去掉小茎环后的hsa-let7a-RT11(绿色曲线标示)的溶解曲线出现杂峰，有非特异性扩增现象；hsa-let7a-RT12(蓝色曲线标示)稍微降低了检测灵敏度。本次实施例说明茎环结构的RT引物的茎和环的大小对检测结果有一定影响，并且小茎环的存在有利于提高本检测方法的特异性，小茎环的大小对检测灵敏度有一定影响。但是该引物仍然可以用来对小RNA进行检测(图12)。
实施例九
化学修饰的bulge loopRT引物对miRNA的检测
以检测化学合成的miRNA hsa-let-7家族5个miRNA为例，引物序列如下，小写字母代表的该碱基进行了LNA修饰：
检测结果表明LNA修饰后提高了其对小RNA检测的特异性(图13)。
实施例十
小RNA芯片技术检测miRNA在细胞内的表达
用A549，Hela，HEK293细胞为材料，以Invitrogen公司Trizol裂解细胞，加入氯仿异丙醇按常规操作提取细胞总RNA，将浓度为5nM的45个miRNA RT引物及浓度为40nM的oligo(dT)15，Random primer(6mer)，混合加入2ug总RNA中，以Promega公司的MMLV反转录酶将总RNA反转录为cDNA(操作步骤见说明书)。检测结果表明该技术可用于细胞，组织和血浆等样品的小RNA表达研究(图14，15，和16)。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州市锐博生物科技有限公司
<120>一种小RNA的定量检测方法及试剂盒
<160>33
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>48
212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc aactatac 48
<210>2
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc cacaaatt 48
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cagacgacca tcagtgaggt agtaggttga 30
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cagacgacca tcagtaccct gtagaaccga a 31
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tt 32
<210>6
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc cactggta 48
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cagacgacca tcagtctccc aacccttgta 30
<210>8
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210>9
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>9
acuccaucau ccaacauauc aa 22
<210>10
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>10
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210>11
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>11
acuccauccu ccaacauauc aa 22
<210>12
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>12
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210>13
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>13
acuccaucau cuaacauauc aa 22
<210>14
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>14
ugagguagua guuuguacag uu 22
<210>15
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>15
acuccaucau caaacauguc aa 22
<210>16
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>16
ugagguagua guuugugcug uu 22
<210>17
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>17
acuccaucau caaacacgac aa 22
<210>18
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc aactgtac 48
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc aacagcac 48
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cagacgacca tcagtgaggt aggaggttgt 30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cagacgacca tcagtgaggt agtagattgt 30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
cagacgacca tcagtgaggt agtagtttgt 30
<210>23
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
gctactcaac tgagggtagg tgccgtattc cagttgagta gcaactatac 50
<210>24
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
gctactcaac tgagggtagg tgccgtattc cagttgagta gcaactgtac 50
<210>25
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
gctactcaac tgagggtagg tgccgtattc cagttgagta gcaacagcac
<210>26
<211>30
<212>RNA
<213>人工序列
<400>26
cagacgacca tcagtgaggt aggaggttgu 30
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
gctactcaac tgagggtagg tgccgtattc ca 32
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
cagacgacca tcagtgaggt agtaggttgt 30
<210>29
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
gcacttcagt ggtcagtgaa tttgaagtgc aactatac 38
<210>30
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
gcacttcagt gtcgtggtga cggcaatttg aagtgcaact atac 44
<210>31
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gcacttcagt ggtcagtgaa tttgaa 26
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gcacttcagt gtcgtggtga cggcaatt 28
<210>33
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
gcacttcagt gtcgtggtca gtgacggcaa tttgaagtgc aactatgc 48
Claims (10)
1.一种小RNA的定量检测方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)bulge loop RT引物将小RNA反转录为cDNA，所述bulge loop RT引物具有40-60个核苷酸，从5’端至3‘端有分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；
(2)加入PCR正向引物和PCR通用反向引物进行定量PCR扩增，正向PCR引物为具有20-40个核苷酸序列，从5’端至3‘端分别为延伸部分和小RNA相似部分；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列的一部分，其长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和要大于或等于小RNA的全长；PCR反向通用引物长度为具有20-40个核苷酸的序列。
2.根据权利要求1所述的小RNA的定量检测方法，其特征是，所述PCR反向引物和/或所述bulge loop RT引物的延伸部分具有LNA或甲基化修饰。
3.根据权利要求1或2所述的小RNA的定量检测方法，其特征是，所述茎3部分与茎1和茎2部分互补配对长度为6-12碱基对；所述延伸部分的长度为3-12个碱基；所述正向PCR引物为28-32个碱基。
4.一种小RNA定量检测试剂盒，其特征是，主要包括有：
(A)具有40-60个核苷酸的bulge loop RT引物，从5’端至3‘端分别为茎1部分，bulge部分，茎2部分，环部分，茎3部分及延伸部分；茎3部分与茎1和茎2部分互补配对，延伸部分能与小RNA互补配对；
(B)具有20-40个核苷酸的正向PCR引物，从5’端至3‘端分别为延伸部分，小RNA相似部分，小RNA相似部分的长度与bulge loop RT引物延伸部分的长度之和大于或等于小RNA的全长；小RNA相似部分为小RNA的cDNA的互补序列的一部分。
5.根据权利要求4所述的小RNA定量检测试剂盒，还包括有具有20-40个核苷酸的PCR反向通用引物。
6.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：1、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：3；或所述bulge loop RT引物是碱基组成为SEQ.NO：2的序列、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：4；或所述bulge loopRT引物是碱基组成为SEQ.NO：6的序列、正向PCR引物的碱基组成为SEQ.NO：7。
7.根据权利要求6所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述PCR反向通用引物为SEQ.NO：5。
8.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述bulge loop RT引物的延伸部分3’端进行LNA或甲基化修饰。
9.根据权利要求4所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述PCR反向引物5’或3’端进行LNA修饰或甲基化修饰。
10.根据权利要求4-9任一项所述的小RNA的定量检测试剂盒，其特征是，所述茎3部分与茎1和茎2部分互补配对长度为6-12碱基对；所述延伸部分的长度为3-12个碱基。
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