CN101541972A - 生产重组生物产品的方法 - Google Patents

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Abstract

生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，包含下述步骤：在细胞培养初期制备哺乳动物生产细胞的生物量，一旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子水平的增加。该方法也可以包含下述步骤：在培养初期开始时或在培养初期过程中，增加哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水平。

Description

生产重组生物产品的方法
技术领域
本发明涉及制备中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物的方法，和使用CHO细胞培养物生产重组生物药物产品的方法。本发明也涉及重组CHO细胞系。
背景技术
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是用于生产药用重组蛋白质的最广泛使用的细胞系，而且涉及CHO变体的方法占大量年收入(Andersen和Krummen，2002)。尽管缺少完全测序的基因组，已经使用非-CHO阵列(Baik等人，2006)或专有的CHO cDNA阵列(Wong等人，2006)进行了许多重要的CHO转录特性研究。这些研究已经描述了在CHO培养过程中低温和诱导细胞凋亡的效应。类似地，许多蛋白质组学研究已经研究了CHO的蛋白质组和培养条件例如温度引起的蛋白质表达的变化(Baik等人，2006；Champion等人，1999；VanDyk等人2003；Kaufmann等人，1999；Lee等人，2003)。这些研究已经增加了对CHO功能的调节的总体理解，特别是对于降温效应。
已经证实，重组生产CHO细胞系的低温培养会导致持续的生存力和增加的比生产力(Al-Fageeh等人，2006；Fogolin等人，2004；Furukawa和Ohsuye，1998；Kaufmann等人，1999)，同时维持产物质量标准(Fogolin等人，2005；Yoon等人，2003b)。降低培养温度的最明显的结果是生长速率的立即降低，其它效应包括降低的代谢(葡萄糖消耗，氧摄入，乳酸&铵生成)和增加的对剪切力和细胞凋亡的抗性(Chuppa等人，1997；Furukawa和Ohsuye，1998；Moore等人，1997；Yoon等人，2003a)。生长速率的降低与在细胞周期的G1期的细胞的积累有关(Hendrick等人，2001；Kaufmann等人，1999；Yoon等人，2003a，b)，并且，已经将G1期停滞与增加的生产力相关联(Fussenegger，2001)。
由于上面列出的原因，许多细胞培养方法采用双阶段培养，通过使细胞在37℃生长，以使生物量最大化，然后将细胞转至低温，以促进蛋白质生产，同时维持更长的且更有活力的静止/生产期(Fogolin等人，2004，2005；Butler，2005；Fox等人，2004)。两种在变温后诱导的最熟知的蛋白质是冷诱导的RNA结合蛋白质(CRIP)和RMB3。其中，已知CRIP会在低温条件下造成生长停滞(Danno等人，2000；Nishiyama等人，1997，Sonna等人，2002)。但是，总体而言，关于哺乳动物细胞如何对低温作出响应知之甚少。
miRNAs是在翻译水平调节基因表达的小的(～22个核苷酸)非编码的RNAs(ncRNAs)。每个miRNA表面上调节多个基因，预期在哺乳动物中存在数百个miRNA基因(Lim等人2003)。1993年在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现了第一个miRNA(Lee等人，1993)，近年来已经发现，存在巨大数量的这种分子(高达2％的人基因组编码miRNAs(Miska，2005))。最近，已经发现miRNAs对于发育(Ambros，2003；Chen等人，2004)、细胞增殖和细胞死亡(Brennecke等人2003)、细胞凋亡和脂肪代谢(Xu等人2003)和细胞分化(Chang等人2004)而言是至关重要的。
发明内容
本发明基于下述发现，即某些miRNA分子在哺乳动物生产细胞的生长周期的不同阶段表达不同。因此，本发明涉及哺乳动物生产细胞的修饰，以适当的现有方式增加或降低特定miRNA的水平(即如表1所示)，以调控细胞培养物的生长。在一个实施方案中，促进miRNA的表达，以促进细胞停滞。细胞停滞与细胞周期的G1(生长停滞)期的细胞积累有关，且这与增加的生产率相关联。在一个不同的、但是有关的实施方案中，促进在培养初期的特定miRNA的抑制或阻抑，从而在生长停滞前促进生物量生成。这具有在更短的时间内产生增加的细胞工作原料的优点。在一个实施方案中，在开始时促进在培养初期的特定miRNA的抑制(或阻抑)，然后改变条件，以造成在细胞周期的生长停滞期中miRNA水平的增加(即通过miRNA的瞬时转染，或通过阻抑物的去除，诱导编码miRNA的核酸的表达)。这些方法可以用于哺乳动物生产细胞培养物的生长和应用，尤其用于重组生物产品、特别是重组生物药物产品的生产。
在本说明书中，术语″哺乳动物生产细胞″应当理解为是指，用于生产重组生物产品例如生物药品等的哺乳动物细胞。这样的细胞类型的实例是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。
根据本发明，提供了生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，其包含下述步骤：
(a)在细胞培养初期，制备一定生物量的哺乳动物生产细胞；和
(b)一旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子水平的增加。
本领域技术人员会知道何时达到希望的哺乳动物生产细胞浓度。一般而言，这是在细胞周期的生长停滞期开始时或即将开始之前。
通常，用一种或多种表1中的miRNA分子瞬时转染细胞。合适地，miRNA分子是miRNA前体分子，理想地合成的miRNA前体分子。不管怎样，miRNA分子可以是初始的miRNA或成熟的miRNA分子。表1中的初始的、前体和成熟的miRNA分子的序列可以在http:microrna.sanger.ac.uk从miRNA序列、靶物和基因命名法数据库MIRBase得到。
或者，可以用在转录启动子控制下的包含编码表1中的miRNA分子的核酸序列的表达载体瞬时转染细胞。通常，核酸序列编码表1中的miRNA分子的前体。合适地，转录启动子是组成型或诱导型启动子。理想地，启动子是温度诱导型的，当温度下降时理想地转换到两阶段细胞培养。利用该使用表达载体的瞬时转染方法，核酸序列也可以编码初始miRNA或成熟miRNA，但是通常载体编码表1中的任意miRNA分子的前体。表达载体可以是质粒、或线性核酸构建体例如PCR产物或限制片段。
在本发明的一个实施方案中，使用基于脂质体的方法介导转染，例如，NeoFx(Ambion目录号：4511)。但是，技术人员会明白其它转染方法，例如，使用电穿孔介导的转染或使用磷酸钙介导的转染。
作为瞬时转染的一个替代方案，该方法可以采用这样的细胞，其工程化成具有在诱导型启动子控制下且稳定整合到细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子的序列，且在这种情况下，该方法通常包含在生长周期中的希望的时刻诱导miRNA分子的表达，通常在细胞停滞期开始时或即将开始之前(即当已经达到希望的活生产细胞浓度时)。通常，启动子是温度诱导型启动子。在这种情况下，温度从37℃下降到31℃会诱导miRNA分子的表达。miRNA分子的编码序列可以编码miRNA的初始的、前体或成熟的形式；通常它编码miRNA分子的前体形式，该前体通过细胞体系加工成成熟的miRNA。
在本发明的一个实施方案中，在生长初期使用合适的阻抑物抑制细胞中的miRNA编码序列，然后通过在生长停滞期时或即将开始之前撤去阻抑物，增加细胞中miRNA的水平。合适的启动子/阻抑物对是本领域技术人员熟知的。
在本发明的一个优选实施方案中，miRNA分子选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。
在另一个方面，本发明也提供了生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，该方法包含下述步骤：在培养初期过程中和通常在培养初期开始时，提高细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水平。这样的抑制剂的序列可以在http:microrna.sanger.ac.uk从miRNA序列、靶物和基因命名法数据库MIRBase得到。
合适地，该方法采用这样的细胞，其工程化成具有在诱导型启动子控制下稳定整合到细胞基因组中的miRNA抑制分子的编码序列，且其中该方法包含在培养初期、理想地在培养初期开始时诱导miRNA抑制分子的表达。这具有在生长停滞之前促进生物量产生的作用，具有在更短的时间内产生增加的细胞工作原料的优点。
合适地，通过表达的诱导物的存在来诱导表达。或者，编码抑制剂的序列可以在阻抑型启动子的控制下。在该情况下，抑制剂在培养初期自由表达，在希望的细胞周期阶段、通常在细胞周期的生长停滞期开始时或即将开始之前，加入阻抑物来抑制miRNA抑制剂的表达。
优选地，一旦达到合适的细胞生物量，就停止诱导miRNA抑制分子的表达。
在一个优选的实施方案中，miRNA抑制分子选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的抑制剂的组。
在一个实施方案中，本发明涉及制备哺乳动物生产细胞培养物的方法，其包含下述步骤：根据本发明，在培养初期过程中或在开始时，造成细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水平的提高，随后，根据本发明，在细胞周期的生长停滞期开始时或即将开始之前，提高细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的水平。
通常，本发明的方法适用于CHO细胞例如CHO-K1或CHO-DUKX细胞或BHK细胞的生长和应用。
在本发明方法的一个实施方案中，生长停滞期在比生长初期更低的培养温度进行。通常，生长初期在37℃进行。合适地，生长停滞期在31℃进行。
本发明也涉及哺乳动物生产细胞，其包含在诱导型启动子控制下且稳定掺入细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子的核酸。优选地，该核酸编码选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组的miRNA分子。合适地，启动子是温度诱导型启动子。
或者，或另外，本发明的哺乳动物生产细胞可以包含在诱导型启动子控制下且稳定掺入细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子的抑制剂的核酸。合适地，该核酸编码miRNA分子的抑制剂，该miRNA分子选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。合适地，启动子是温度诱导型启动子。
通常，哺乳动物生产细胞是CHO细胞，例如，CHO-K1细胞或CHO-DUKX细胞。或者，哺乳动物生产细胞可以是BHK细胞。这些细胞可以从英国Middlesex的LGCProtochematcc在下述目录编号下得到：CRL-10154-CHODuKX；CRL-9618-CHOK1；CCL-10-BHK-21。
因而，本发明的哺乳动物生产细胞系可以被遗传工程改造，以在生长停滞期或生长停滞期即将开始时诱导表达特定miRNA分子(表1所示的)，从而在生长停滞期产生增加的miRNA分子水平，或可以将它们工程化成在细胞培养的初期诱导表达表1中的miRNA分子的抑制剂，或可以将它们工程化成实现二者，即在培养的初期表达miRNA分子的抑制剂，然后在细胞停滞期表达miRNA分子。
应当明白，在本发明的方法和细胞系中，可以如下实现表达的控制：使用诱导型启动子，然后根据需要向培养液中加入或去除诱导物。技术人员会明白，本发明的方法和产物也可以如下控制：使用组成型启动子，并通过使用表达的阻抑物来控制表达。因而，在本说明书中，当使用术语″诱导型启动子″时，应当理解可以使用组成型启动子作为替代，且对技术人员来说，为实现本发明目的所需的对方法或哺乳动物生产细胞系的改进是显而易见的。
本发明还提供了用于生产重组生物产品的试剂盒，该试剂盒包含：(a)哺乳动物生产细胞系；(b)用表1中的miRNA分子转染细胞的工具；和/或(c)用表1中的miRNA分子之一的抑制剂转染细胞的工具。转染工具可以是暂时的或稳定的，包含向细胞中导入下述任一种或两种：(a)合成的miRNA分子(或抑制剂)和(b)编码miRNA分子(或编码miRNA抑制剂)的核酸。
附图说明
图1为在1×105细胞/ml接种后包含变温的培养物(A)和在37℃恒温培养的细胞CHO-K1批式培养的活细胞计数。在每种情况下，在接种后72和144小时(箭头所示)从旋转烧瓶取一式三份生物样品；
图2为从TS样品提取的RNA的15％变性丙烯酰胺凝胶分析证实了小RNA物质的产率和完整性；
图3为所有6个CHO-K1样品的无监督聚簇分析产生2个主要的样品簇，其将指数期(37℃)样品与静止期(31℃)样品分开。从在顶部的簇树结构可以清楚地看出，样品1(TSd3A)和样品5(TSd6B)是异常值。每个miRNA的相对表达由从低(蓝色)到高(红色)表达的颜色代表。在簇下面给出了相对表达的范围条；
图4为用于成熟的miRNA的检测和定量的Ambion qRT-PCR过程的概要。该图像的使用已经经过Ambion公司的允许。
具体实施方式
材料和方法
细胞系和细胞培养
在该研究中使用悬浮适应的CHO-K1细胞。培养基由添加了10％胎牛血清(Sigma)的ATCC培养基(DMEM/含有谷氨酰胺和丙酮酸钠的F-12Hams；Sigma)组成。根据需要，将细胞保持在37℃或31℃培养箱中旋转平台上转速为60rpm的250mL旋转罐(Techne)中。对于批式培养实验，以1×105细胞/mL将指数生长的细胞以100mL终体积接种进旋转罐。每天给所有培养物通入压缩空气(Air Products)约1min。每隔24小时进行细胞计数，使用血细胞计数器测定细胞浓度，使用锥虫蓝排阻方法将活细胞与死细胞区分开。对于变温和在37℃的连续批式培养，各取一式三份旋转罐用于在72和144小时取样。
RNA取样和提取
取样后，在PBS中洗涤细胞团2次，使用MiRVana提取试剂盒(Ambion)提供的裂解/结合溶液进行裂解。在提取使用前，将这些裂解物储存在-80℃。生产商的说明书描述了通过有机方法和基于柱的方法的提取。使用Agilent6000纳米芯片和通过15％变性丙烯酰胺凝胶电泳，测定RNA质量。使用Nanodrop(ND-1000；Labtech、International)进行RNA定量。
MiRNA生物阵列分析(Bioarray Analysis)。
根据厂家的标准化操作规程，通过Asuragen处理用于microRNA图谱研究的样品。如下得到microRNA富集的级分：使10μg总RNA穿过flashPAGETM分离装置(Ambion，Inc.，Austin，TX)，清洁，并使用flashPAGE Reaction Clean-Up试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)浓缩。在RNA分子的3′末端添加尾部，并根据生产商的说明书用mirVanaTM miRNA标记试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)进行标记。在聚(A)聚合酶介导的加尾反应中掺入胺修饰的核苷酸，将Cy5琥珀酰亚胺酯(AmershamBiosciences(GEHealthcare)，Piscataway，NJ)缀合至microRNA上的胺部分。使用mirVana miRNABioarray Essentials试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)，进行与mirVana miRNA Bioarrays(Ambion，Inc.，Austin，TX)的杂交。使用GenePix4200AL扫描仪(Molecular Devices，UnionCity，CA)，在635nm的激发波长扫描阵列上的Cy5荧光。使用GenePix Pr o(version6.0，MolecularDevices，Union City，CA)，提取与探针和局部背景有关的荧光信号。
使用Asuragen选择的算法建立阈值和信号标度，作为microRNA S tandardService Premium Analysis(miSSP package)的一部分执行。使用Huber等人，2002所述的变差稳定化转化方法，通过GenePix Pro为每个microRNA建立的背景调节的荧光值是标准化的。采用单向ANOVA或t检验的假设检验取决于试验设计中组的数量。
对于多组对比，我们使用单向ANOVA(方差分析)模型来测试零假设，即规定组间不存在差异的状态。目的是过滤出在所有组之间具有相同表达水平的基因。
在通过ANOVA鉴别出的差别表达的基因上进行逐对对比，以观察它们彼此的不同。对于每对处理，为每个基因进行双样品t检验，随后使用5％的FDR，通过Benjamini和Hochberg(1995)所述的步增(step-up)方案进行多重校正，以控制假发现率(FDR)。该方法称作″保护的最小显著差(LSD)″。报道了详细的miRNA列表和有关的信息例如变化倍数和p-值。
在培养144小时变温的CHO-K1细胞的miRNA图谱与在37℃的指数生长的CHO-K1细胞的对比将26种miRNA鉴别为明显不同(如表1所示)。
  MiRNAID   序列号
  hsa_miR_30d_MM1   1
  hsa_miR_191   2
  hsa_miR_495   3
  hsa_miR_320   4
  hsa_miR_10a   5
  hsa_miR_126_AS   6
  hsa_miR_30c   7
  hsa_miR_181a   8
  hsa_miR_21   9
  hsa_miR_30d   10
  hsa_miR_29a   11
  hsa_miR_125b   12
  hsa_miR_513   13
  hsa_miR_107   14
  hsa_miR_27a   15
  hsa_miR_449   16
  mmu_miR_298   17
  hsa_miR_24   18
  hsa_miR_221   19
  hsa_miR_516_3p   20
  mmu_miR_7b_MM1   21
  hsa_miR_197   22
  hsa_miR_19b   23
  mmu_miR_346   24
  hsa_miR_10b   25
  Has_let_7f   26
表1
在下面的序列表中提供了上述miRNA的成熟转录物的序列。上述miRNA的初始转录物和前体转录物的序列可以在http:microrna.sanger.ac.uk从miRNA序列、靶物和基因命名法数据库MIRBase得到。在Griffiths-Jones等人的文章中解释了该数据库的内容和应用。
在本发明的方法中采用的miRNA抑制剂序列是表1所示的成熟miRNA的精确反义序列，可从http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/得到。将抑制剂修饰成具有2′Ome修饰和含有氨基连接物的3′C3(AngieM、Cheng，MikeW、Byrom，Jeffrey Shel ton和Lance P.Ford*″Antisense inhibition o f human miRNAs andindications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis″NucleicAcids Research 200533(4)：1290-1297)。
miR-21和miR-24miRNA的抑制剂可在AM10206(miR-21)和AM10737(miR-24)目标编号下从Ambion购得。
为了检测和定量特定的miRNA，根据生产商的说明书使用miRVanaqRT-PCR miRNA检测试剂盒和引物组。在所有情况下，均将SuperTaq(Ambion)用于聚合反应。使用SYBR绿和ROX标准化染料(Invitrogen)促进检测和标准化。使用ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行RT和PCR反应。使用0.05的p值截止值，使用t检验检查生物复制结果的统计显著性。
基于对小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvigicus)和人类(Homosapiens)的pre-miR-21序列侧翼的对应基因组区域的比对，为克隆中国仓鼠miR-21设计引物。使用的引物是5′atgtttgctttgctttaaaccctgcctgagca3′和5′ctgcaaaccatgatgctgggtaatgtttga3′。从约5×106CHO-K 1细胞提取基因组DNA(全血提取试剂盒，Nucleon)，在100ul水中洗脱。将1.5ul(约100ng)DNA用作PCR的模板。反应物也含有引物(每种400nM)、1ul DMSO和20.5ul PlatinumSupermix(Invitrogen)。循环条件是：在95℃下3min，30个在94℃下30秒、在53℃下30秒和在72℃下45秒的循环，随后在72℃下7min。在琼脂糖凝胶上检查PCR产物的适当长度(ca.220bp)的特定带，将剩余的混合物清除(QiagenPCR清除试剂盒)，用于测序。使用克隆引物(MWG Bio tech，Germany)，在两条链上进行测序。
结果
细胞培养
以1×105细胞/ml将悬浮适应的CHO-K1细胞接种进旋转烧瓶(供应商)，在37℃下培养6天，或在37℃下培养3天、随后变温至31℃再继续培养3天。从图1可以看出，变温的细胞立即终止对数生长，没有超过1.67×106±0.15细胞/ml的峰活细胞密度，而在37℃下培养的细胞继续对数生长另外24小时，达到2.02×106±0.11细胞/ml的平均峰活密度。在72小时和144小时对细胞取样，用于RNA和蛋白质提取。在PBS中洗涤细胞团2次，立即在miRVana裂解/结合缓冲液中裂解，在使用Ambion的mirVana miRNA分离试剂盒提取之前储存在-80℃。
使用Agilent Bioanalyzer对总RNA进行QC，通过在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上显影，证实小RNA物质的存在和完整性(图2)。
miRNA生物阵列分析。
从在72小时转换到31℃的细胞提取在第3天(TSd3)和第6天(TSd6)分离的总RNA的一式三份生物样品，随后用于miRNA生物阵列分析。
当用标记的中国仓鼠RNA探测miRNA生物阵列时，平均百分比存在调用(percent present call)是在27.3％(±4.8)区域，这与具有26.9％(±5.7)的平均存在调用的人细胞系RNA非常相当。来自用CHO-K1RNA探测的阵列的平均荧光信号是306.4±55.2荧光单位，与人细胞数据(296.6±71.5)相当。表达数据的无监督聚簇分析揭示，作为离散的亚簇聚簇的CHO-K1样品被分成在分析中包含的作为非仓鼠对照的6个人细胞系(数据未显示)。在CHO-K1样品内的无监督的聚簇的结果是37℃下的指数期样品与在31℃静止期生长的那些样品分离(图3)。在亚簇内，显然旋转样品1(TSd3A)和5(TSd6B)是异常值，由于总体更低的中位前景读数和与这些阵列有关的更低的百分比存在调用，这可能是标记和/或杂交的假象。这是后续分析步骤的一个重要的质量控制度量。
使用在材料和方法中所述的统计方法来分析所有样品，发现26种miRNA在72小时(TSd3)和144小时(TSd6)样品之间被视作统计上不同的(p≤0.05)(表I)。
CHO-K1中特异性miRNA表达的定量QRT-PCR分析
在第3天(37d3)和第6天(37d6)对在37℃下培养144小时的CHO-K1细胞的总RNA进行取样(图1b)，将来自第3天接受变温处理的细胞的RNA(TSd3 & TSd6)用于来自生物阵列分析的选定靶物的qRT-PCR分析。初步实验表明，每个反应使用2.5ngRNA会达到最佳结果，并且在5S内源对照的情况下，使用PCR-引物的1/10稀释液。证实了5S R NA在所有样品中以类似水平表达，无论生长阶段或培养温度，这与图2中的质量控制分析相一致。miRNA的qRT-PCR反应的原理采用对特定miRNA的3′末端具有特异性的专有RT-引物，然后在RT-反应步骤中通过ArrayScriptTM酶延伸成micro-cDNA。qPCR步骤原位进行，使用5′miRNA特异性的引物和靶向原始RT-引物的通用3′末端的3′通用引物(图4)。因此，这是扩增单个成熟的miRNA的高度特异性的方式。
为了确保使用生物阵列和q-RT-PCR检测的miRNA实际上是生物阵列上人和小鼠miRNA的真实的仓鼠直系同源物，选择一个代表性的miRNA(miR-21)用于克隆和测序。从下面表2可以看出，成熟的miR-21在可以得到该序列的所有物种间是保守的，但是整个前体序列与大鼠的序列完全相同。
Figure A20078003187400161
表2
A、CHO-K1cgr-miR-21序列与小鼠(mmu-)、大鼠(rno-)、人(hsa-)和牛(bta-)miR-21的序列的比对。CHO序列与在Sanger miRNA储存库(http://microrna.sanger.ac.uk/scquences/)中公开的rno-miR-21序列相同。
B、预测的cgr-miR-21的茎环结构，成熟的miRNA用红色高亮显示。
讨论
如图1所示，降低培养温度对细胞生长具有瞬即效应，也可以看出，在培养144小时后，在31℃下的细胞维持稳定的活细胞数量，而在37℃下培养的细胞进入晚静止/死亡期。在变温后观察到的降低的代谢活性、剪切敏感性和细胞凋亡速率已经促进了它在重组蛋白质生产中的应用(Fogolin等人，2004；Fogolin等人，2005；Fox等人，2004)。
在培养144小时变温的CHO-K1细胞的miRNA图谱与在37℃下指数生长的CHO-K1细胞的对比，将26个miRNA鉴别为显著不同的(表1所示)。CHO-K1RNA的全图谱分析清楚地表明，Ambion生物阵列适用于基于百分比存在调用和中位印迹强度的CHO绘图。当将CHO-K1图谱与6个人细胞系相比较时，清楚地观察到，CHO-K1在它们表达的miRNA图谱方面明显不同。qRT-PCR验证研究表明，发现miR-21和miR-24在批次运行末期在CHO-K1细胞中以非温度依赖性的方式显著上调。qRT-PCR数据反映了在生物阵列中鉴别出的各个miRNA的相对表达水平，这指示生物阵列的定量以及定性方面。
miR-21和miR-24与生长抑制的关联与这里观察到的结果相一致，因为两种miRNA在静止细胞中升高，在该系统miR-21中可能不是调节细胞凋亡的重要因子。在该实验室中的初步分析已经揭示，在31℃下连续培养的细胞中miR-21水平升高，这又与缓慢的生长相关联。
在上面的实施例中，申请人已经鉴别出在停止增殖后中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中许多miRNA的增加的表达，所述停止是由于低温培养或通过营养限制和废物积累导致的正常静止期生长。经鉴定，成熟的miR-21在检查的哺乳动物物种中是完全保守的，这证实了下述理论，即成熟的miRNA在哺乳动物细胞系中非常保守。这允许使用人工哺乳动物(例如鼠或人)miRNA前体分子(可从Ambion目录号：17100购得)修饰CHO细胞来过表达特定miRNA，或使用特定miRNA抑制剂分子(可从Ambion目录号：17000购得)来抑制miRNA作用。由于生物药品的有效生产通常采用双阶段培养，其具有在37℃下的生长初期来产生足够的生物量，随后是在更低的培养温度的生产期，申请人提出，表1中的miRNA分子和/或miRNA分子的抑制剂可以用于建立CHO细胞培养的有效生长和使用必需的条件或增强现有条件，尤其在重组生物药物产品的生产中。
实例1：瞬时转染miRNA来抑制CHO生长
一旦达到足够的生物量(通常达到最大活细胞密度的约80％)，使用导入CHO-K1细胞(LGSProtochem-atcc目录编号：CRL-9618-CHOK1)中的合成的miRNA前体分子miR-21(表1所示)(Ambion目录号：17100)修饰培养的CHO细胞行为。该转染的目的是，在不变温的情况下抑制生长和/或通过同时暂时转染表I中的特定miRNA(单独地或组合地)来增强降低培养温度的有益效应。通过常规的基于脂质体的方法来介导转染，包括NeoFx(Ambion目录号：4511)。根据生产商的说明书使用该方法。
实例2、瞬时表达miRNA编码序列来抑制CHO生长。
一旦达到足够的生物量(通常达到可达到的最大活细胞密度的约80％)，使用导入细胞中的表达载体(Ambion目录号：5775，5777，5779)中的合成的miRNA编码序列(或从PCR反应得到的线性表达分子或作为限制片段)修饰培养的CHO行为。这些表达构建体至少含有下述组分-转录启动子(组成型或诱导型，病毒的、哺乳动物的或其它起源)和编码miRNA前体分子的序列。采用的pSILENCER表达盒含有改进的RNAp ol II型CMV启动子和优化的SV40多腺苷酸化信号，以驱动高水平表达。这会促进广范围的细胞的高表达。该转染的目的是，在不变温的情况下抑制生长和/或通过同时转染表I中的特定miRNA(单独地或组合地)来增强降低培养温度的有益效应。通过常规的基于脂质体的方法来介导转染，包括Lipofectamine2000(Invirogen)。根据生产商的说明书使用该方法。
实例3、稳定表达miRNA编码序列来抑制CHO生长。
建立新的基于CHO的细胞系，其具有在诱导型启动子MT控制下稳定整合到细胞基因组中的表I的miR-21或miR-24miRNA的编码序列。在接受特定信号来激活启动子(即ZnSO4)之前，该启动子是无活性的——一旦接受这些信号，则转录在启动子控制下的任意编码序列。
该方法包含，将来自可商购的表达系统(Ambion目录号：5775，5777，5779)的miRNA编码序列亚克隆进诱导型系统例如pCytTS(Cytos b iotechnology)。其它可行的表达系统是完整的
Figure A20078003187400191
系统(Stratagene)或pSUPERIOR(Oligoengine)(这也可以通过改进Ambion载体以使其包括诱导型启动子来实现)。根据生产商的说明书，使用常规的基于脂质体的转染剂例如Lipofectamine2000(Invitrogen)，将这些新的表达系统转染进CHO细胞。用适当选择剂进行选择，分离均质克隆群体后，在降低培养温度之前，新的细胞系以指数生长方式正常地生长。在该情况下，通过加入100μM水平的ZnSO4，诱导miRNA的表达。或者，在温度诱导型启动子的情况下，单独的变温会导致增强的生长停滞，这是由于增加的生长抑制性miRNA的表达(表1所示)。一般而言，在其它诱导型启动子的情况下，通过在培养液中加入或撤去刺激/阻抑分子(例如四环素)来激活启动子。然后，可将这些新的细胞系理想地用于进一步修饰，以表达用于治疗目的重组糖蛋白质。
实例4、稳定表达miRNA编码序列来促进CHO生长。
建立新的基于CHO的细胞系，其具有在温度诱导型启动子或另一种诱导型启动子控制下的靶向表1列出的miRNA的抑制剂序列。该方法包含，将来自可商购的表达系统(Ambion目录号：5775，5777，5779)的miRNA抑制剂编码序列亚克隆进诱导型系统，例如完整的
Figure A20078003187400192
系统(Stratagene)或pSUPERIOR(Oligoengine)(这也可以通过改进Ambion载体以使其包括诱导型启动子来实现)。使用常规的基于脂质体的转染剂例如Lipofectamine2000(Invitrogen)，将这些新的表达系统转染进CHO细胞。用适当选择剂分离均质克隆群体后，在降低培养温度之前，在诱导物/阻抑物(例如四环素)存在/缺失下，在37℃下培养在指数生长期加速生长的新细胞系，直到撤去诱导物/加入阻抑物为止。在这时，抑制剂的表达会终止。一旦撤去抑制剂，这将允许特定miRNA的表达、生长抑制并因此提高生产。设计该系统来提高生产力，这通过增加在培养早期的生物量生成和然后以正常方式促进静止期生产来实现。然后可将这些新的细胞系理想地用于进一步修饰，以表达用于治疗目的重组糖蛋白质。
实例5研究工具。
通过鉴别靶分子和受特定miRNA表达/抑制影响的途径，工业研究人员对在上面实例3和4下建立的稳定细胞系非常感兴趣。MiRNA通过阻止特定蛋白质的翻译起作用，因此诸如二维凝胶电泳等方法可以用于在特定蛋白质表达或抑制后鉴别差别表达的蛋白质，并从而鉴别靶物。这具有促进细胞系构建的合理设计方案和过程设计的潜力，例如在培养基配方中包含特定抑制剂分子。
本发明不限于前文所述的实施方案，它们的结构和细节可以改变，而不脱离本发明的精神。在这方面，尽管本发明的主要阐述涉及生产重组生物产品的方法，该方法同样可以用于制备哺乳动物生产细胞培养物的方法中。
序列表
<110>都柏林城市大学(DUBLIN CITYUNIVERSITY)
<120>生产重组生物产品的方法
<130>10095wo
<150>IES2006/0587
<151>2006-08-04
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>miRNA
<222>(1)..(22)
<400>1
uguaaacauc cccgacugga ag                               22
<210>2
<211>23
<212>RNA
<213>Homo sapiens
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<221>miRNA
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caacggaauc ccaaaagcag cug                              23
<210>3
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aaacaaacau ggugcacuuc uu                               22
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<212>RNA
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aaaagcuggg uugagagggc ga                               22
<210>5
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<400>5
uacccuguag auccgaauuu gug                              23
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<212>RNA
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cauuauuacu uuugguacgc g                                21
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<212>RNA
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uucacaggga ggugucau                                    18
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<212>RNA
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agggcuuagc ugcuugugag ca                               22
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uggcagugua uuguuagcug gu                               22
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<212>RNA
<213>Mus musculus
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ggcagaggag ggcuguucuu ccc                              23
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ugccuacuga gcugauauca gu                               22
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<210>20
<211>18
<212>RNA
<213>Homo sapiens
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<221>miRNA
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ugcuuccuuu cagagggu                                    18
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uggaagacuu gugauuuugu ugu                              23
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<212>RNA
<213>Homo sapiens
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uucaccaccu ucuccaccca gc                               22
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<213>Homo sapiens
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aguuuugcag guuugcaucc agc                              23
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<212>RNA
<213>Mus musculus
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ugucugcccg agugccugcc ucu                              23
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<212>RNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>miRNA
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<400>25
uacccuguag aaccgaauuu gug                              23
<210>26
<211>22
<212>RNA
<213>Rattus norvegicus
<220>
<221>miRNA
<222>(1)..(22)
<400>26
ugagguagua gauuguauag uu                               22

Claims (33)

1、一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，该方法包含下述步骤：修饰哺乳动物生产细胞培养物，以调控细胞培养物中至少一种miRNA在生长周期中的水平。
2、一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物，该方法包含下述步骤：
(a)在细胞培养初期开始时或过程中，制备哺乳动物生产细胞的生物量；和
(b)一旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子水平的增加。
3、如权利要求1或2所述的方法，其中用一种或多种表1中的miRNA分子瞬时转染所述哺乳动物生产细胞。
4、如权利要求3所述的方法，其中所述miRNA分子是合成的miRNA前体分子。
5、如权利要求3或4所述的方法，其中使用脂质体递送、电穿孔或磷酸钙介导所述转染。
6、如权利要求1或2所述的方法，其中用在转录启动子控制下的包含编码表1中的miRNA分子的核酸序列的表达载体瞬时转染所述细胞。
7、如权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列编码表1中的miRNA分子的前体。
8、如权利要求6或7所述的方法，其中所述转录启动子是组成型或诱导型启动子。
9、如权利要求1或2所述的方法，其采用工程化成具有在诱导型启动子控制下稳定整合到细胞基因组中的表1中的miRNA分子的编码序列或其前体的哺乳动物生产细胞，且其中该方法包含，在细胞周期的生长停滞期开始时或即将开始之前，诱导miRNA分子的表达。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述启动子是温度诱导型启动子。
11、如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述miRNA分子选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。
12、如权利要求1所述的方法，其包含下述步骤：在培养初期开始时或在培养初期过程中，提高哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水平。
13、如权利要求1所示的方法，其中所述至少一种miRNA是初始的、前体、或成熟的表1中的miRNA。
14、如权利要求12所述的方法，其采用工程化成具有在诱导型启动子控制下稳定整合到细胞基因组中的抑制剂编码序列的哺乳动物生产细胞，且其中该方法包含，在培养初期开始时或在培养初期过程中，诱导抑制分子的表达。
15、如权利要求14所示的方法，其中表达由表达诱导物的存在或表达阻抑物的缺失来诱导。
16、如权利要求14或15所述的方法，其中一旦达到合适的细胞生物量，就停止诱导miRNA抑制分子的表达。
17、如权利要求1所述的方法，其包含下述步骤：在培养初期开始时或在培养初期过程中，提高细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水平，随后在细胞周期的生长停滞期之前或过程中，提高细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的水平。
18、如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
19、如权利要求18所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞或CHO-DUKX细胞。
20、如权利要求2至19中任一项所述的方法，其中在比生长初期更低的培养温度进行生长停滞期。
21、如权利要求20所述的方法，其中在37℃进行生长初期。
22、如权利要求20或21所述的方法，其中在31℃进行生长停滞期。
23、一种哺乳动物生产细胞，其包含在诱导型启动子控制下且稳定掺入细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子(以初始的、前体或成熟的形式)的核酸。
24、如权利要求23所述的哺乳动物生产细胞，其中所述核酸编码选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组的miRNA分子。
25、如权利要求23或24所述的哺乳动物生产细胞，其中所述启动子是温度诱导型启动子。
26、一种哺乳动物生产细胞，其包含在诱导型启动子控制下且稳定掺入细胞基因组中的编码表1中的miRNA分子的抑制剂的核酸。
27、如权利要求26的哺乳动物生产细胞，其中所述核酸编码miRNA分子的抑制剂，该miRNA分子选自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。
28、如权利要求25或26所述的哺乳动物生产细胞，其中所述启动子是温度诱导型启动子。
29、如权利要求23-28中任一项所述的哺乳动物生产细胞，该哺乳动物生产细胞是CHO细胞或BHK细胞。
30、如权利要求29所述的哺乳动物生产细胞，该哺乳动物生产细胞是CHO-K1细胞或CHO-DUKX细胞。
31、一种用于生产重组生物产品的试剂盒，其包含：(a)哺乳动物生产细胞系；(b)用表1中的miRNA分子(以初始的、前体或成熟的形式)转染该细胞系的细胞的工具；和/或(c)用表1中的miRNA分子的抑制剂转染该细胞系的细胞的工具。
32、如权利要求30所述的试剂盒，其中所述用于转染细胞的工具包含瞬时或稳定转染细胞的工具。
33、如权利要求32所述的试剂盒，其中所述瞬时转染包含向细胞中导入下述一种或二者：(a)合成的miRNA分子和(b)编码miRNA分子的核酸。
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