CN102676637A - 一种高专一性的测定小rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高专一性测定小RNA的方法。具体地，本发明方法包括步骤：(a)在小RNA的3’端添加polyA尾；(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，进行退火；(c)对小RNA进行反转录，形成cDNA；(d)在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，以及通过检测扩增产物来确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。和现有的定量检测小RNA的方法相比，本发明方法可显著提高检测小RNA(包括非编码RNA)的专一性。

Description

一种高专一性的测定小RNA的方法
技术领域
本发明涉及生物医学、基因工程和检测领域，更具体地涉及一种高专一性的测定小RNA的方法，该方法可应用于检测非编码RNA，从而对某些疾病的情况或状态进行描述。
背景技术
MicroRNAs(小RNA)是一类新发现的非编码RNA，它通过序列专一性地结合到和它互补反义的mRNA的3’非编码区(3’s UTR)来调控某个或某些目标mRNA转录及稳定性。
大多数小RNA，如let-7RNA，miR-1，miR-34，miR-60及miR-87在无脊椎动物及脊椎动物中均是高度保守的。这说明它们能识别多个位点及(或)多个保守功能的基因的靶序列。
通过对秀丽线虫基因组的分析，发现了另一种小RNA的亚型-小时序RNA(stRNA，如lin-4和let-7)。stRNA在调控发育过程中起到非常重要的作用，例如：神经元再生、Dauer幼虫的形成、外阴形成以及下皮细胞的终极分化。
小RNA通常由60～70个核苷酸的RNA前体折叠、剪切而成。一些小RNA一经表达即可被检测到，而一些则仅在表达峰值时才可被检测到。
可能由于小RNA前体在其结合蛋白的保护下，使其不易被降解，因此通常只有一个发卡结构的链被剪切下，并积累起来。推测这些结合蛋白可以调节小RNA的转录抑制作用。小RNA的前体在Dicer RNAse III及Argonaute家族的酶的参与反应后才能形成成熟的小RNA。
小RNA在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极其重要的作用。迄今为止，在人的细胞里，已发现了1200多种小RNA(http://www.mirbase.org/)，这些小RNA参与调控了至少60％人类基因。
小RNA是肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。血清或血浆中的与肿瘤相关小RNA已作为肿瘤诊断的生物学标记。小RNA的检测及定量是某些靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。因此，能够确定各种小RNA在特定细胞中的数量是相当重要的。
在一些情况下，小RNA的定量测定显得尤为重要。比如，比较不同组织中的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变化。由于序列相似的小RNA家族在同一细胞中均会存在，因此能否有个灵敏度高，又具备专一性好的检测方法显得尤为重要。再者，如果能有应用于高通量筛选样品的的方法如均质法、多重法那就再好不过了。
现今，已有多种的小RNA定量分析方法面世，其中包括小RNA芯片矩阵，基于SYBR-Green I的小RNA定量反转录PCR法(Raymond，C.K.，Roberts，B.S.，Garrett-Engele，P.，Lim，L.P.，and Johnson，J.M.(2005)Simple，quantitative primer-extensionPCR assay for direct monitoring ofmicroRNAsand short-interfering RNAs.RNA 11，)，基于茎状环形的Taqman法(Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，Zhou Z，Lee DH，Nguyen JT，BarbisinM，Xu NL，Mahuvakar VR，Andersen MR，Lao KQ，Livak KJ，Guegler KJ.2005.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.NucleicAcids Res 33(20)：e179)，微珠法及高通量测序等。
然而，以上所及的所有方法都各有缺陷。例如，基于杂交的测定法(微矩阵或微珠)灵敏度及专一性均不理想；基于SYBR-Green I的方法背景高，专一性差；使用茎状环形的Taqman法专一性虽不太差，但价格昂贵，费工费时，且有偏差，难于应用于高通量筛选。
EvaGreen是一种双链DNA绑定染料。它对PCR反应抑制低、溶解曲线佳、光稳定性和热稳定性高，且不诱变，无细胞毒性。EvaGreen被应用于荧光定量PCR和溶解曲线的测定(Mao F，Leung WY，Xin X.2007.Characterization ofEvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCRapplicatiohs.BMC Biotechnol.9；7：76.)。
虽然BioRad，Qiagen，Agilent等公司均有基于EvaGreen的PCR反应液销售，且许多实验室也有使用自配的基于EvaGreen的反应液的报道，但没有报道或暗示过EvaGreen可提高反应专一性。
综上所述，目前本领域尚缺乏高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小RNA的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小RNA的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测小RNA的方法，所述的方法包括步骤：
(a)对于待检测的小RNA样品，在小RNA的3’端添加polyA尾；
(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引物与添加了polyA尾的小RNA进行退火；
(c)反转录所述的添加了polyA尾的小RNA，形成cDNA；
(d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。
在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。
在另一优选例中，所述的检测包括通过对荧光强度的检测来达到定量检测小RNA。
在另一优选例中，所述的待检测的小RNA样品是从待检测样本中抽提出的RNA。
在另一优选例中，所述的抽提出的RNA是从含有或不含小RNA的样品中抽提出的总RNA。
在另一优选例中，在步骤(d)中，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩增产物的有无或数量。
在另一优选例中，所述的正向引物具有以下特征：
(i)正向引物的3’端序列为与待检测的小RNA的5’端序列相同或基本相同，并且3’端序列与cDNA的Tm值为45-65℃；
(ii)正向引物的5’端序列使得整个正向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iii)正向引物的长度为8-50bp。
在另一优选例中，所述的反向引物具有以下特征：
(i)反向引物的3’端具有与待检测的小RNA的3’端序列互补的、长度为0-15个碱基的第一互补区；
(ii)反向引物的中间序列为长度为8-30个碱基的polyT；
(iii)反向引物的5’端序列使得整个反向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iv)反向引物的长度为12-50bp。
在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组：动物样品、食物、饲料、和药物。
在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组：体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品、或水。
在另一优选例中，在步骤(a)，所述的添加PolyA尾是通过在Ploy(A)聚合酶的催化下，在小RNA的3’端聚合加上AMP，从而形成polyA尾。
在另一优选例中，polyA尾具有8-200个A，较佳地10-100个A，最佳地12-50个A。
在另一优选例中，所述的小RNA是长度15～200个核甘酸(更佳地，长度为18-100bp)的RNA分子。较佳地，所述的小RNA是非编码RNA。
在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换：poly(C)尾，或poly(G)尾，或poly(U)尾；并且
在步骤(b)中，加入与所述的小RNA的polyN尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引物与添加了polyN尾的小RNA进行退火；和
在步骤(c)中，反转录所述的添加了polyN尾的小RNA，形成cDNA。
在本发明的第二方面，提供了一种提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的方法，包括步骤：在聚合酶链反应的反应体系中，添加EvaGreen荧光染料。
在另一优选例中，在所述的反应体系中，EvaGreen荧光染料在475纳米的光密度值在0.01到2之间。
在本发明的第三方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用作提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
在本发明的第四方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用于制备提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
在本发明的第五方面，提供了一种获取待检测样本中非编码RNA信息的方法，包括步骤：
(a)从所述的待检测样本抽提含有所述非编码RNA的RNA样品；
(b)对于步骤(a)抽提出的RNA，在非编码RNA的3’端添加polyA尾；
(c)加入与所述的非编码RNA的polyA尾部互补的引物，从而使得所述引物与带polyA的非编码RNA进行退火；
(d)反转录所述的含polyA尾的非编码RNA，形成cDNA；
(e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而获得所述非编码RNA的信息，其中所述信息包括所述非编码RNA是否存在于所述样品中以及存在的数量。
在另一优选例中，所述的检测采用检测EvaGreen实时荧光变化的实时荧光定量PCR法。
在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换：poly(C)尾，或poly(G)尾，或poly(U)尾。
在另一优选例中，利用所获得的非编码RNA的信息，可用于对检测对象(其中包括但并不限于：哺乳动物如人)的某种疾病的情况或状态进行描述。该方法尤其适用于以下情况：
a.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量增加；
b.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量减小。
上述两种情况包含了多数非编码RNA在某种疾病中的表达情况。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了EvaGreen实时荧光定量法检测小RNA的流程。从上至下各步骤依次是：加poly(A)尾；RT引物与RNA退火；反转录反应；和使用正向引物和反向引物进行PCR扩增。
图2显示了本发明一个实例中正向引物的结构。
图3显示了本发明一个实例中反向引物的结构。
图4显示了let-7a模板浓度梯度扩增曲线。
图5显示了小RNA模板的量与Cq值呈线性关系。
图6显示了SYBR Green荧光定量PCR法与EvaGreen荧光定量PCR法的交叉反应专一性与灵敏度比较结果。
图7显示了含有不同的荧光染料：EvaGreen(通道一)及SYBR Green(通道二)对于专一性结合(实线)以及非专一性结合(虚线)的引物与模板结合的影响的融解曲线。图中，Trace 1(曲线1)是EvaGreen和引物与专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace 3(曲线3)是SYBR Green I和引物与专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace 2(曲线2)是EvaGreen和引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace 4(曲线4)是SYBR Green I和引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，EvaGreen作为一种DNA结合染料居然能够显著提高PCR反应中引物与模板结合的专一性。具体地，与不添加另一常用的DNA结合染料SYBR Green I相比，虽然两者灵敏度上无明显区别，但是EvaGreen可以显著提高反应的专一性，因此EvaGreen特别适用于区分和检测结构差异极小的小分子RNA。在此基础上，本发明开发了新的高专一性测定小RNA的方法。
本发明提供了一种具有优势的小RNA检测、分类及定量的实验方法。本发明的检测小RNA的方法适用于检测microRNAs(小RNAs)或其他小分子核苷酸，如s iRNA。
在此发明中，提供了一种基于EvaGreen的定量PCR法(尤其是实时定量PCR法)，它适用于定量检测小RNA。基于EvaGreen的定量PCR法可以进一步扩展应用于mRNA及基因表达的定量检测。
术语
如本文所用，术语“EvaGreen”，“Eva Green”或“EvaGreen染料”可互换使用，指是Biotium公司生产的一种商品名为EvaGreen的DNA结合染料，它是一种同时适用于实时PCR和高分辨率熔解曲线(HRM)分析的染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度以下进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析。由于EvaGreen染料在光谱特性上类似于FAM以及SYBRGreen I，因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。此外，和SYBR Green I以及SYBR GreenER不同的是，EvaGreen染料非常稳定且无致突变性和细胞毒性。
Figure BDA0000049169460000071
染料的结构信息在例如美国专利US7,776,567中有详细描述。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
如本文所用，术语“Poly(A)聚合酶”，是指一类酶，这类酶可以利用ATP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP。Poly(A)聚合酶可以从原核或真核生物中提取。由于这类酶的专一性不强，这类酶可以分别利用CTP，或GTP，或UTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个CMP或GMP，或UMP。如果非编码RNA是添加了的poly(C)尾，或是poly(G)尾，或是poly(U)尾，在此发明中，与尾部互补的引物也相应变化。Poly(U)聚合酶是和Poly(A)聚合酶不同，但类似的酶。它可以利用UTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个UMP。它也可以非特异性地分别利用ATP，或CTP，或GTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP或CMP，或GMP。因此，在本发明中，Poly(A)聚合酶和Poly(U)聚合酶有同样的功效。
如本文所用，术语“polyA尾”，是本发明第一步中在RNA的3’端添加的寡聚到多聚A(AMP，腺苷酸)。这个“polyA尾”可用“polyC尾”，“polyG尾”，“polyU尾”替代。相应地，在下一步引入的和尾部互补，或基本互补的引物的序列也要变化。“polyA尾”也可以通过RNA链接酶(RNA Ligase)加上。
现参见图1，本发明的一种优选的技术方案包括以下步骤：
(1)从含有或不含小RNA的样品中抽提总RNA。在Poly(A)聚合酶的催化下在小RNA的3’端聚合加上AMP，使小RNA形成一个polyA尾。
(2)加入与polyA互补的引物，退火。
(3)在反转录酶的催化下，反转录小RNA使之成为cDNA。
(4)使用正、反向引物及含有EvaGreen的荧光染料的PCR反应混合母液对cDNA进行扩增
(5)在扩增过程中，实时检测EvaGreen染料的荧光值的变化。
本发明中，优选的引物结构如图2和图3所示。
正向引物一般可以分为2部分，3’端部分的引物与模板小RNA的5’端完全互补，退火温度一般在45～65摄氏度之间，而引物的另一部分-5’端的附加序列(尾)将整条引物的退火温度提高到50～75摄氏度之间(图2)。
反向引物则由3部分组成：第一部分，引物的3’端0～15个碱基与小RNA的3’端完全互补；中间部分，约10～30个碱基为10～30个dT，与小RNA加上的Poly(A)的尾互补；第三部分为一个0～40碱基的附加序列(尾)(图3)。应理解，当第三部分为0碱基时，反向引物可以只有2部分构成。
PCR反应的进行需要含有EvaGreen的反应母液。反应程序可以是常规的2个温度条件的(如95摄氏度变性；60摄氏度退火及延伸)或3个反应温度的条件(如95摄氏度变性；50摄氏度退火及72摄氏度延伸)。反应须在含有镁离子、dNTP、及EvaGreen——双链DNA绑定染料的缓冲体系中进行。
可用本发明方法检测的小RNA，其长度没有特别限制，通常为15-200bp，较佳地为18-100bp，更佳地为19-40bp。
可用本发明方法检测的含小RNA的生物学样品没有特别限制。应理解，生物学样品是十分广泛的一个概念，可以是一个或多个细胞，也可以是样本或培养物(包括微生物培养物)，甚至包括合成来源的样本。通常，生物样本可以是动物样品，包括人类样品如体液、固体样品如骨骼或组织。样品也可以是液态或固态食物或饲料及药物，如乳制品、蔬菜、肉类及肉制品、水等。样品可以来源于任何家养或野生动物，如有蹄类、熊类、鱼类、兔类、啮齿类等。
应用
小RNA的检测及定量是其靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。比如，比较不同组织中的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变化。血清或血浆中小RNA也可作为肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。
本发明的主要优点在于：
(a)专一性非常强。
(b)灵敏度高。
(c)同时适合高通量筛选和精细筛选。
(d)重复性高。
(e)价格便宜。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
在实时荧光定量PCR法中EvaGreen具有更高的专一性
本发明人试验了4×106，4×105，4×104，4×103，4×102，40，4，以及0(NTC)(NTC为无底物对照)个分子的模板量(hsa-l et7a，SEQ ID NO：1或表1)，使用正向引物(SEQ ID NO：9或表1)及反向引物(SEQ ID NO：10或表1)连同含有EvaGreen的PCR反应母液进行实时荧光定量PCR反应。
表1小RNA以及引物序列
  名称   SEQ ID No.   序列(5’-3’)
  hsa-let-7a   1   UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
  hsa-let-7b   2   UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
  hsa-let-7c   3   UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
  hsa-let-7d   4   AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU
  hsa-let-7e   5   UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU
  hsa-let-7f   6   UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
  hsa-let-7g   7   UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU
  hsa-let-7i   8   UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU
  let-7a正向引物   9   CCCCGTGAGGTAGTAGGTTGTATA
  let-7b正向引物   10   CCGGAGGTAGTAGGTTGTGT
  let-7c正向引物   11   GCCGGTAGTAGGTTGTATGGT
  let-7d正向引物   12   CCCCAGGTAGTAGGTTGCAT
  let-7e正向引物   13   CGGGAGGTAGGAGGTTGTAT
  let-7f正向引物   14   CCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAG
  let-7g正向引物   15   CCCCGTGAGGTAGTAGTTTGTAC
  let-7i正向引物   16   CGGGAGGTAGTAGTTTGTGC
  let-7a反向引物   17   GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAAC
  let-7b反向引物   18   TCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACC
  let-7c反向引物   19   GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTA
  let-7d反向引物   20   GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT
  let-7e反向引物   21   GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT
  let-7f反向引物   22   GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAA
  let-7g反向引物   23   GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT
  let-7i反向引物   24   ATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACA
  c7a   25   AACTATACTTCCTACTACCTCT
  c7e   26   AACTATACTTCCTCCTACCTCT
结果如图4、图5和图6所示。其中，图5显示了灵敏度、线性及模板浓度动态范围。
在测试含有EvaGreen的PCR的专一性实验中，针对人类let 7家族的8个小RNA成员(序列如SEQ ID No：1-8所示或表1所示)，本发明人分别使用4×106个拷贝数的小RNA作为模板，用特异性PCR引物对(序列如SEQ ID NO：9-24所示或表1所示)进行PCR反应，并检测各小RNA成员对各个不同的PCR引物的PCR反应的专一性及灵敏度。
本实施例同时采用了EvaGreen和SYBR Green两种双链DNA结合染料，对其专一性及灵敏度进行对比。如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低一个Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的50％，即其交叉反应为50％；同理，如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低2个Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的25％，即其交叉反应为25％；以此类推，如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低3个Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的12.5％，即其交叉反应为12.5％；如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低4个Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的6.25％，即其交叉反应为6.25％。在小RNA检测实验中，普遍可以接受低于5％的交叉反应。
本实施例中，同时使用了EvaGreen及SYBR Green两种双链DNA结合染料，对let 7家族的8个小RNA成员实时荧光定量反应的专一性及灵敏度进行对比。
结果如图6所示，在所有的49个交叉反应中，8个基于SYBR Green染料的定量PCR有大于5％的交叉反应，最高的交叉反应高于70％，相比之下，基于EvaGreen染料的交叉反应均小于5％。因此，基于EvaGreen的实时荧光定量PCR法的专一性高于基于SYBR Green的实时荧光定量PCR法。
众所周知，小RNA的序列很短中，且不同小RNA的序列很相似，因此能区分不同小RNA的专一性引物显得尤为重要。
令人非常意外的是，从图6以及表2A和2B可发现，在EvaGreen反应中，表征非特异性交叉反应的相对值总和为15.1(见表2A)。与之相反，在SYBRGREEN反应中，表征非特异性交叉反应的相对值总和高达161(见表2B)。换言之，对于同样的引物对，同样的小RNA，SYBR Green的交叉反应居然比EvaGreen的交叉反应高出10倍之多(161.3，14.8＝10.89)。即，使用EvaGreen把专一性提高了一个数量级。
表2A EvaGreen测试结果
Figure BDA0000049169460000111
表2B  SYBR Green测试结果
Figure BDA0000049169460000121
注：在表2A和2B中，let-7a表示小RNA let-7a；Let-7A表示针对小RNA let-7a的特异性引物对；依此类推。NTC表示无模板。
其中，将使用特异性引物时的配对配对反应的活性值定位为100，交叉反应的活性值为相对于配对反应的活性值的比值。
结果汇总
在本实施例的小分子RNA的测定中，应用两种DNA结合染料EvaGreen和SYBR Green相比，测定的灵敏度比较接近，但EvaGreen的专一性明显高于SYBRGreen。
实施例2
退火实验证明EvaGreen具有更高的专一性
分别使用EvaGreen(组A)或SYBR Green的染料(组B)，500nM的let-7e正向引物(SEQ ID NO：13)与500nM的c7e(SEQ ID NO：26)可形成完全配对的双链结构(曲线1，3)，使用500nM c7a(SEQ ID NO：25)作为对照与l et-7e正向引物形成非专一性的的双链结构(曲线2，4)。该反应在50mM的Tris(pH8.0)，且含有2.5mM的氯化镁的缓冲液中进行。
结果如图7所示。无论使用EvaGreen或SYBR Green染料，专一性结合的的双链退火曲线峰值的温度均高于非专一性结合双链的峰值峰值的温度，这证明专一性结合的退火温度较非专一性结合的高。然而，对于专一性结合与非专一性结合的曲线峰值之间的温度差使用EvaGreen(TSeva)染料时明显大于使用SYBR Green(TSSYBR)。这个实验参数证明了在EvaGreen的染料中，引物的专一性强。
另外，deva是在曲线1与曲线2在曲线1达到峰值的温度时的荧光落差；dSYBR是在曲线3与曲线4在曲线3达到峰值的温度时的荧光落差。落差的高表明两个结合状态差别大，落差的小表明两个结合状态差别小。deva大于dSYBR说明：非专一性结合在EvaGreen中要比在SYBR Green中少。这两个退火实验参数，从两个角度进一步验证了在PCR试验中观察到的现象，证实了我们的发现有其物理学基础。
综上所述，退火实验进一步证明，EvaGreen法在退火时较SYBR Green法有更高的专一性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0000049169510000011
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Claims (10)

1.一种检测小RNA的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)对于待检测的小RNA样品，在小RNA的3’端添加polyA尾；
(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引物与添加了polyA尾的小RNA进行退火；
(c)反转录所述的添加了polyA尾的小RNA，形成cDNA；
(d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩增产物的有无或数量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正向引物具有以下特征：
(i)正向引物的3’端序列为与待检测的小RNA的5’端序列相同或基本相同，并且3’端序列与cDNA的Tm值为45-65℃；
(ii)正向引物的5’端序列使得整个正向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iii)正向引物的长度为8-50bp。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反向引物具有以下特征：
(i)反向引物的3’端具有与待检测的小RNA的3’端序列互补的、长度为0-15个碱基的第一互补区；
(ii)反向引物的中间序列为长度为8-30个碱基的polyT；
(iii)反向引物的5’端序列使得整个反向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iv)反向引物的长度为12-50bp。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待检测样本选自下组：动物样品、食物、饲料、和药物。
6.一种提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的方法，其特征在于，包括步骤：在聚合酶链反应的反应体系中，添加EvaGreen荧光染料。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的反应体系中，EvaGreen荧光染料在475纳米的光密度值在0.01到2之间。
8.一种EvaGreen荧光染料的用途，其特征在于，用作提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
9.一种EvaGreen荧光染料的用途，其特征在于，用于制备提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
10.一种获取待检测样本中非编码RNA信息的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)从所述的待检测样本抽提含有所述非编码RNA的RNA样品；
(b)对于步骤(a)抽提出的RNA，在非编码RNA的3’端添加polyA尾；
(c)加入与所述的非编码RNA的polyA尾部互补的引物，从而使得所述引物与带polyA的非编码RNA进行退火；
(d)反转录所述的含polyA尾的非编码RNA，形成cDNA；
(e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而获得所述非编码RNA的信息，其中所述信息包括所述非编码RNA是否存在于所述样品中以及存在的数量。
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