WO2016129941A1 - 마이크로알앤에이 검출용 키트 및 방법 - Google Patents

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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to kits and methods for detecting nucleic acids, and more particularly, to kits and methods for detecting microRNAs.
  • MicroRNA is an untranslated RNA consisting of about 22 ribonucleotides, which regulate RNA silencing in the transcriptional stage and expression of genes in the post-transcriptional phase. It is known that this miRNA function is performed through the formation of base pairs with complementary sequences in mRNA (Bartel, DP, Cell , 136 (2): 215-233, 2009).
  • miRNAs are being reported one after another, which is known to be used as a regulator of gene expression in animals, plants and viruses.
  • certain diseases such as cancer may occur due to mismatches in function due to mutations in miRNA genes (Mraz, M. and Pospisilova, S., Expert Rev. Hematol ., 5 (6): 579 -581, 2012; Hughes et al ., Am. J. Hum. Genet ., 89: 628-633, 2011; Pontual et al ., Nat. Genet ., 43 (10): 1026-1030, 2011; Lu et al ., Nature 435 (9): 834-838, 2005).
  • miRNAs are known to be very small in size ( ⁇ 22 nt) and are more easily degraded than mRNAs, there is a great difficulty in separating or detecting them.
  • Conventional methods for detecting this include Northern blot analysis and hybridization based detection using microarrays, RT-PCR using stem loop primers specifically complementary to specific miRNAs, and subsequent quantitative PCR.
  • the present invention is to solve various problems including the above problems, and to provide an easier and more economical miRNA detection kit and method.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a hybridization is performed with a first hybridization oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which specifically hybridizes with the 3'-terminus of a poly A linked poly A linked miRNA by a miRNA or a poly A polymerase and a target miRNA.
  • Reverse transcription primers consisting of a first adapter oligonucleotide that is any nucleic acid sequence that is not present; A second hybridized oligonucleotide that is capable of specifically hybridizing with cDNA reverse-transcribed from the miRNA or poly A tailed miRNA except for the portion corresponding to the 3′-end of the miRNA or poly A tailed miRNA that hybridizes with the first hybridized oligonucleotide And a second primer oligonucleotide composed of any nucleic acid sequence which is not hybridized with the cDNA. And it provides a kit for detecting miRNA comprising a forward primer selected from the second adapter oligonucleotide.
  • the first adapter oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that specifically hybridizes the amplification target miRNA with the 3'-end of the miRNA and any nucleic acid sequence that does not hybridize with the target miRNA
  • a reverse transcription step of reverse transcription with a reverse transcription primer composed of oligonucleotides With a second hybridizing oligonucleotide that is specifically hybridizable with cDNA reversely transcribed from the miRNA, except for the portion corresponding to the 3'-end of the miRNA hybridized with the first hybridized oligonucleotide, and with any nucleic acid sequence that does not hybridize with the cDNA.
  • a reverse primer composed of the same nucleic acid sequence as the reverse transcription primer or the first adapter oligonucleotide and a forward primer selected from the second adapter oligonucleotide as a template.
  • Reverse transcription with a reverse hybridization primer consisting of a first hybridizing oligonucleotide consisting of a poly dT specifically hybridizing with a poly A tail of the poly A tailing miRNA and a first adapter oligonucleotide that is any nucleic acid sequence that does not hybridize with a target miRNA.
  • Reverse transcription reaction step A second hybridized oligonucleotide and a cDNA capable of specifically hybridizing with a cDNA reverse-transcribed from the poly A tailed miRNA except for a portion corresponding to the 3′-end of the poly A tailed miRNA hybridized with the first hybridized oligonucleotide;
  • miRNA detection kit and method according to an embodiment of the present invention can be very useful for the diagnosis and prognosis of various diseases including cancer.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a miRNA detection method using a poly A polymerase according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a miRNA detection method using a miRNA specific reverse transcription primer according to an embodiment of the present invention.
  • 3 to 10 are miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b by miRNA detection kit and method using poly A polymerase and oligo dT primer according to one embodiment of the present invention, respectively.
  • amplification results of miR-200c, miR-127 and miR-145 are shown.
  • the upper part shows the change in fluorescence value according to the number of amplification cycles
  • the interruption is a graph showing the change in fluorescence emission rate according to temperature
  • the left table in the lower part shows the sample type, the fluorescence detection reference value and the melting point
  • the bottom right is a photograph showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • 11 to 18 are miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR by miRNA detection kit and method using miRNA specific forward primer, respectively, according to an embodiment of the present invention.
  • the result of amplifying -200c, miR-127, and miR-145 is shown.
  • the upper left shows the change in fluorescence value according to the number of amplification cycles
  • the left middle shows a change in the fluorescence emission rate with temperature
  • the left lower table shows the sample type and the fluorescence detection reference value.
  • Melting point, on the right is a photograph showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • 19 to 26 are miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 and miR-145 as comparative examples using miRNA detection kits of Qiagen, respectively.
  • the result of amplification is shown.
  • the upper part shows the change in fluorescence value according to the number of amplification cycles
  • the interruption is a graph showing the change in fluorescence emission rate according to temperature
  • the left table in the lower part shows the sample type, the fluorescence detection reference value and the melting point
  • the bottom right is a photograph showing the results of 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • nucleotide refers to a monomer molecule constituting a nucleic acid, and is composed of a base, an pentose sugar, and a phosphoric acid.
  • the base is adenine, guanine, and cytosine in the case of DNA.
  • thymine Four kinds of thymine exist, and in the case of RNA, uracil is used instead of the thymine.
  • the pentose sugar is 2'-deoxyribose in the case of DNA, ribose is used in the case of RNA.
  • oligonucleotide refers to a short single-stranded nucleic acid chain consisting of 13 to 25 nucleotides as a polymer of the nucleotide monomer molecule, in some cases 6-mer, 7 It may refer to a nucleic acid chain consisting of less than 13 nucleotides or more than 25 nucleotides, such as -mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, and 12-mer.
  • polynucleotide generally refers to a polymer chain of nucleotide units longer than the oligonucleotide, but is also used interchangeably with the oligonucleotide. Polynucleotides include both single-stranded or double-stranded nucleic acid chains.
  • sense strand refers to a single-stranded nucleic acid molecule in the same direction as the direction of the code of the gene of the double-stranded DNA molecule
  • antisense strand is another single strand complementary to the sense strand.
  • it refers to a nucleic acid molecule, it is also possible to define a strand in which the nucleic acid sequence is first identified as a “sense strand” and its complementary strand as an "antisense strand” irrespective of the direction of the gene's code progression.
  • polymerase chain reaction or “nucleic acid amplification reaction” refers to a reaction that amplifies a particular target nucleic acid molecule using a thermostable DNA polymerase.
  • PCR the DNA in addition to the polymerase target nucleic acid oligonucleotide that can specifically hybridize to a nucleotide of the primer (forward primer, reverse primer), deoxy-nucleotide mixture (dNTP mixture), Mg 2 +, such as divalent reaction buffer containing ions such as This is used.
  • the DNA molecules produced by the PCR reactions are referred to herein as "amplification products”.
  • primer extension refers to a non-chain reaction in which a DNA polymerase terminates at the 5'-terminus of the template nucleic acid by extending a primer complementarily hybridized to a template nucleic acid of limited length. Means.
  • extension products The DNA molecules produced by the primer extension reactions are referred to herein as "extension products”.
  • primer refers to an oligonucleotide or polynucleotide that complementarily hybridizes to template DNA, which is used for initiation of a PCR reaction or a primer extension reaction.
  • the primer for the PCR reaction is a pair of forward primers (or sense primers) selected from the same sense strand as the gene code direction of the nucleic acid molecule to be amplified and reverse primers (or antisense primers) selected from the antisense strands complementary to the sense strands.
  • forward primers or sense primers
  • reverse primers or antisense primers
  • the term “adaptor” refers to the 5 ′ of a reverse transcription primer for reverse transcription of an oligonucleotide or miRNA that is added to the 5′-end of the sense DNA corresponding to the miRNA to specifically distinguish a particular miRNA. Means an oligonucleotide added at the end.
  • these adapters can be used as a primer sequence used to amplify the extended cDNA, the latter can be used for the purpose of correcting the low Tm value when the primer is composed only of a nucleic acid sequence that can hybridize with miRNA.
  • the adapter may be designed to minimize nonspecific amplification because there is no homology with other primers except the template nucleic acid and the extension oligonucleotide to be amplified.
  • hybridized oligonucleotide refers to a nucleic acid molecule capable of hybridizing by complementary binding to miRNA or cDNA reverse transcribed from the miRNA.
  • the term "universal primer” is a primer capable of amplification irrespective of the type of nucleic acid molecule to be amplified, and may be prepared using a nucleic acid sequence of an adapter oligonucleotide added by reverse transcription and primer extension reactions. In this case, by using a single primer set there is an advantage that can lower the manufacturing cost of the kit.
  • forward primer refers to a primer when the direction of the primer (5 '-> 3') coincides with the direction of the gene.
  • reverse primer refers to a primer whose direction is reversed to that of the gene.
  • a hybridization is performed with a first hybridization oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which specifically hybridizes with the 3'-terminus of a poly A linked poly A linked miRNA by a miRNA or a poly A polymerase and a target miRNA.
  • a reverse transcription primer composed of a first adapter oligonucleotide that is any nucleic acid sequence that is not present; A second hybridized oligonucleotide that is capable of specifically hybridizing with cDNA reverse-transcribed from the miRNA or poly A tailed miRNA except for the portion corresponding to the 3′-end of the miRNA or poly A tailed miRNA that hybridizes with the first hybridized oligonucleotide And a second primer oligonucleotide composed of any nucleic acid sequence which is not hybridized with the cDNA. And it provides a kit for detecting miRNA comprising a forward primer selected from the second adapter oligonucleotide.
  • the kit may further include a reverse primer composed of the same nucleic acid sequence as the first adapter oligonucleotide, and the reverse primer may be a universal reverse primer composed of the same nucleic acid sequence regardless of the type of miRNA.
  • the forward primer may be a universal forward primer composed of the same nucleic acid sequence regardless of the type of miRNA.
  • the first hybridizing oligonucleotide that specifically hybridizes with the 3′-end of the miRNA may have a length of 3 to 12 nt.
  • the first hybridizing oligonucleotide that specifically hybridizes with the 3′-end of the poly A tailing miRNA may have a length of 15 to 30 nt.
  • the first adapter oligonucleotide may have a length of 3 to 30 nt.
  • the kit may further comprise a reverse transcriptase, a thermostable DNA polymerase and a dNTP mixture, and may further comprise a poly A polymerase and ATP.
  • the first adapter oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that specifically hybridizes the amplification target miRNA with the 3'-end of the miRNA and any nucleic acid sequence that does not hybridize with the target miRNA
  • a reverse transcription step of reverse transcription with a reverse transcription primer composed of oligonucleotides With a second hybridizing oligonucleotide that is specifically hybridizable with cDNA reversely transcribed from the miRNA, except for the portion corresponding to the 3'-end of the miRNA hybridized with the first hybridized oligonucleotide, and with any nucleic acid sequence that does not hybridize with the cDNA.
  • a reverse primer composed of the same nucleic acid sequence as the reverse transcription primer or the first adapter oligonucleotide and a forward primer selected from the second adapter oligonucleotide as a template.
  • Reverse transcription with a reverse hybridization primer consisting of a first hybridizing oligonucleotide consisting of a poly dT specifically hybridizing with a poly A tail of the poly A tailing miRNA and a first adapter oligonucleotide that is any nucleic acid sequence that does not hybridize with a target miRNA.
  • Reverse transcription reaction step A second hybridized oligonucleotide and a cDNA capable of specifically hybridizing with a cDNA reverse-transcribed from the poly A tailed miRNA except for a portion corresponding to the 3′-end of the poly A tailed miRNA hybridized with the first hybridized oligonucleotide;
  • the forward primer may be a universal forward primer composed of the same nucleic acid sequence regardless of the type of miRNA
  • the reverse primer may be a universal reverse primer composed of the same nucleic acid sequence regardless of the type of miRNA.
  • the first hybridized oligonucleotide may have a length of 3 to 12 nt or 15 to 30 nt.
  • the first adapter oligonucleotide may have a length of 3 to 30 nt.
  • the PCR step may be performed by a real-time PCR reaction.
  • nucleic acid molecules composed of a plurality of oligonucleotides and / or polynucleotides are described in the order of 5'-end to 3'-end.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a miRNA detection method using a poly A polymerase according to an embodiment of the present invention.
  • miRNA 101 is a very short nucleic acid molecule of about 22 nt. Unlike the mRNA, the miRNA 101 does not have a poly A tail, so that when the poly A polymerase and ATP are mixed and reacted on the sample containing the miRNA 101, the poly A tail 102 is attached to the miRNA 101. This results in poly A tailing miRNA 110.
  • the poly A tail 102 and the first hybridized oligonucleotide 102 are complementary when the reverse hybrid primer 104 composed of poly dT, which is the first hybridized oligonucleotide 102, and the first adapter oligonucleotide 103 are mixed.
  • the reverse transcription reaction is performed by adding a reverse transcriptase and a dNTP mixture thereto, the reverse transcription product of the target miRNA consisting of the first adapter oligonucleotide-first hybridized oligonucleotide 102 and the antisense strand cDNA 111 106 is generated.
  • the extension primer 120 having the second adapter oligonucleotide 121 at the 5'-end After hybridizing with the extension primer 120 having the second adapter oligonucleotide 121 at the 5'-end, and performing a primer extension reaction with a DNA polymerase, an extended double-stranded cDNA 130 is generated.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a miRNA detection method using a miRNA specific forward primer according to an embodiment of the present invention.
  • the first hybridized oligonucleotide 134 which is capable of specific complementary binding to the 5-7 nt, preferably 6 nt, portion of the 3′-end of miRNA 101 and linked thereto
  • the miRNA specific reverse primer 136 composed of the first adapter oligonucleotide 135 composed of any nucleic acid sequence that does not hybridize with the target miRNA hybridizes, and then reverse transcription reaction occurs by reverse transcriptase, the antisense strand cDNA 137 ) Is generated.
  • the extension reaction is performed with the extension primer 143 composed of the second adapter oligonucleotide 142 not complementary to both 137 and miRNA 101, extension is made in both directions, and thus, miRNA specific primer 136
  • An extension product is produced that comprises the complementary strands of the)) and second adapter oligonucleotide 142 portions.
  • the second adapter oligonucleotide 142 includes a 5'-region 141, which is a universal reverse primer portion commonly used in all miRNA detection kits, at the 5'-end, and the other portion is a 3'-region. (139) makes it possible to detect various miRNAs simultaneously in multiplex analysis by varying the sequence and / or length depending on the miRNA type.
  • the PCR product 145 is generated by PCR using the forward primer 144 corresponding to the miRNA specific primer 136 and the 5'-region 141 in the same tube.
  • the 5'-terminal sequence of the second adapter oligonucleotide is selected from the nucleic acid sequence.
  • PCR product 145 can be detected in the reaction process by real-time PCR, after the reaction is complete, it can be confirmed by agarose gel electrophoresis and the like.
  • a reverse primer composed of all or part of the sequence of the first adapter oligonucleotide may be used, in which case the same nucleic acid sequence regardless of the type of miRNA This can be used as a universal reverse primer.
  • the present inventors detect a variety of miRNAs using PCR after bi-directional extension reaction using an extension primer including a miRNA specific sequence after reverse transcription using oligo dT primer after poly A linking to miRNA according to an embodiment of the present invention. It was.
  • the inventors of the present invention provide miRNA-specific forward primers having the 5'-terminus of the 3'-terminus of the specific 6 nt nucleic acid sequence of the miRNA, without using an oligo dT primer according to an embodiment of the present invention.
  • Various miRNAs were detected using an extension primer having a miRNA specific sequence other than the nucleic acid sequence of nt. MiRNAs to be detected are shown in Table 1 below.
  • the poly A tailing and reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 60 minutes, and then heated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme, and the primer extension reaction and PCR were performed at 95 ° C.
  • the melting curve is heated to 65 ° C to 95 ° C after heating 95 ° C for 10 seconds. It measured by making it rise by 0.5 degreeC per 5 second.
  • reverse transcription was performed at 42 ° C. for 60 minutes, and then heated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme.
  • Primer extension reaction and PCR dissolved DNA at 95 ° C. for 15 minutes. After 40 cycles of 10 seconds at 95 ° C and 40 seconds at 60 ° C, the melting curve was measured by heating 0.5 ° C per 5 seconds from 65 ° C to 95 ° C after heating at 95 ° C for 10 seconds.
  • the PCR reaction was performed using a real-time PCR device of ABI, and in order to confirm that the actual PCR reaction was properly performed, the band pattern was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • Embodiment of the present invention Example Amplified target miRNA Whether to use poly A polymerase Reverse primer (SEQ ID NO) Extension primer (SEQ ID NO) Forward primer Reverse primer One miR-532 Y One 10 18 19 2 miR-196b Y 11 3 miR-362 Y 12 4 miR-29c Y 13 5 miR-106b Y 14 6 miR-200c Y 15 7 miR-127 Y 16 8 miR-145 Y 17 9 miR-532 N 2 10 2 10 miR-196b N 3 11 3 11 miR-362 N 4 12 4 12 miR-29c N 5 13 5 13 miR-106b N 6 14 6 14 miR-200c N 7 15 7 15 miR-127 N 8 16 8 16 miR-145 N 9 17 9
  • the present inventors compared the performance with the miRNA detection kit according to an embodiment of the present invention, using a miRNA detection kit sold by Qiagen as a comparative example.
  • Comparative example Comparative example Amplified target miRNA Detection method One miR-532 Using Anchor Oligo dT Adapters 2 miR-196b Using Anchor Oligo dT Adapters 3 miR-362 Using Anchor Oligo dT Adapters 4 miR-29c Using Anchor Oligo dT Adapters 5 miR-106b Using Anchor Oligo dT Adapters 6 miR-200c Using Anchor Oligo dT Adapters 7 miR-127 Using Anchor Oligo dT Adapters 8 miR-145 Using Anchor Oligo dT Adapters
  • miRNA detection kit and method according to an embodiment of the present invention can be very useful for the diagnosis and prognosis of various diseases including cancer.
  • SEQ ID Nos: 1 to 19 are nucleic acid sequences of various primers used in the miRNA detection kit according to an embodiment of the present invention.

Abstract

본 발명은 miRNA 검출 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 miRNA 또는 poly A 폴리머라제에 의해 poly A가 연결된 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 miRNA 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 miRNA 검출방법에 관한 것이다.

Description

마이크로알앤에이 검출용 키트 및 방법
본 발명은 핵산 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 마이크로알앤에이 검출용 키트 및 방법에 관한 것이다.
마이크로RNA(microRNA 또는 miRNA, 이하, 'miRNA'로 약칭함)은 22개 정도의 리보뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA로, 전사단계에서 RNA 침묵(RNA silencing) 그리고 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행하며, 이러한 miRNA의 기능은 mRNA 내의 상보서열과의 염기쌍의 형성을 통해 수행되는 것으로 알려지고 있다(Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009).
최초에 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 발견된 이후, 동물, 식물 및 바이러스에 유전자 발현의 조절기구로 활용되고 있음이 알려지면서 다양한 종류의 miRNA들이 속속 보고되고 있는 실정이다. 뿐만 아니라, miRNA 유전자의 돌연변이 등에 기인하는 기능의 부조화에 의해 암 등 특정 질병이 발생할 수 있음이 알려지고 있어(Mraz, M. and Pospisilova, S., Expert Rev. Hematol., 5(6): 579-581, 2012; Hughes et al., Am. J. Hum. Genet., 89: 628-633, 2011; Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005), 그 중요성이 더욱 부각되고 있다.
miRNA는 그 크기가 매우 작고(~22 nt) mRNA보다 더 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이를 분리하거나 검출하는데 큰 여려움이 있다. 이를 검출하기 위한 통상적인 방법으로는 노던 블랏 분석과 마이크로어레이를 이용한 교잡에 기반한 검출, 특정 miRNA와 특이적으로 상보결합을 하는 스템루프 구조의 프라이머를 이용한 RT-PCR과 그에 수반되는 정량적 PCR의 두 단계에 걸친 공정으로 검출 및 정량을 하는 방법(Chen et al., Nucleic Acids Res., 33(20): e179, 2005), 폴리 A polymerase로 miRNA의 3'-말단에 폴리 A 꼬리를 연결하고, Poly(T) 어댑터를 프라이머로 사용하여 cDNA를 합성한 후, miRNA 특이적 포워드 프라이머와 poly(T) 어댑터에 기반한 리버스 프라이머를 이용하여 miRNA를 증폭하는 방법(Shi, R. and Chiang, V.L., BioTechniques, 39: 519-525, 2005) 등이 알려져 있다.
그러나, 상기 방법들은 제한된 상보서열을 이용하기 때문에 비특이적 증폭이 가능할 수 있고, 통상적으로 실시간 PCR 기술에 기반하고 있기 때문에, 고가의 실시간 PCR 장비가 필요하며, 생성된 PCR 산물의 크기가 비슷하기 때문에 다양한 miRNA를 동시에 검출하는 멀티플렉스 분석이 제한적이라는 단점을 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 용이하고 경제적인 miRNA 검출 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, miRNA 또는 poly A 폴리머라제에 의해 poly A가 연결된 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 miRNA 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증폭대상 miRNA를 상기 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및 상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 증폭 대상 miRNA에 poly A 꼬리를 연결하는 poly A 꼬리연결 miRNA 제조단계;
상기 poly A 꼬리연결 miRNA의 poly A 꼬리와 특이적으로 혼성화하는 poly dT로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및 상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 miRNA를 고가의 장비 없이도 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하며, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석 역시 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출용 키트 및 방법은 암을 비롯한 각종 질병의 진단 및 예후 판정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리 A 폴리머라아제를 이용한 miRNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 특이적 역전사용 프라이머를 이용한 miRNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 3 내지 도 10은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 poly A polymerase 및 oligo dT 프라이머를 이용한 miRNA 검출 키트 및 방법에 의해 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 하단의 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 11 내지 도 18은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 특이적 포워드 프라이머를 이용한 miRNA 검출키트 및 방법에 의해 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 왼쪽 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 왼쪽중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 왼쪽하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 19 내지 도 26은 비교예로서 각각 Qiagen사의 miRNA 검출키트를 이용하여 miR-532, miR-196b, miR-362, miR-29c, miR-106b, miR-200c, miR-127 및 miR-145를 증폭한 결과를 나타낸다. 각각의 도에 있어서 상단은 증폭 사이클 수에 따른 형광 값의 변화를 나타내고, 중단은 온도에 따른 형광방출 속도의 변화를 나타내는 그래프이고, 하단의 왼쪽 표는 샘플의 종류 및 형광검출 기준값 및 녹는점을 나타내며, 하단의 오른쪽은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:
본 문서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 핵산을 구성하는 단위체 분자로 염기, 오탄당 및 인산으로 구성되어 있으며, 상기 염기는 DNA의 경우 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 및 티민(thymine)의 네 가지가 존재하고, RNA의 경우에는 상기 티민 대신 우라실(uracil)이 사용된다. 상기 오탄당은 DNA의 경우 2'-디옥시리보스(2'-deoxyribose), RNA의 경우 리보스(ribose)가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일쇄 핵산 사슬을 의미하는데, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개 미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개 초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 통상적으로 상기 올리고뉴클레오티드 보다 더 긴 뉴클레오티드 단위체의 중합체 사슬을 의미하나, 상기 올리고뉴클레오티드와 혼용되어 사용되기도 한다. 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산사슬 모두를 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "센스 가닥"은 이중가닥 DNA 분자 중 유전자의 코드의 진행방향과 동일한 방향의 단일가닥 핵산분자를 의미하고, "안티센스 가닥"은 상기 센스 가닥과 상보결합을 하는 다른 단일가닥 핵산분자를 의미하나, 유전자의 코드 진행방향과 무관하게, 최초로 핵산서열이 규명된 가닥을 "센스 가닥"으로 정의하고 그의 상보가닥을 "안티센스 가닥"으로 정의하는 것도 무방하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg2 + 등의 2가 이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머 연장반응(primer extension)"은 DNA 중합효소가 제한된 길이의 주형 핵산에 상보적으로 혼성화된 프라이머를 연장시켜 상기 주형 핵산의 5'-말단에서 종료가 되는 비연쇄반응을 의미한다. 상기 프라이머 연장반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "연장산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의 개시를 위해 사용되는, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "어댑터(adaptor)"는 특정 miRNA를 특이적으로 구분하기 위해 miRNA에 상응하는 센스 DNA의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드 또는 miRNA의 역전사를 위한 역전사용 프라이머의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 경우 이들 어댑터는 연장된 cDNA를 증폭하는데 사용되는 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 후자의 경우 miRNA와 혼성화 가능한 핵산서열로만 프라이머를 구성할 경우 낮은 Tm 값을 보정할 목적으로 사용될 수 있다. 상기 어댑터는 증폭 대상 주형핵산과 연장용 올리고뉴클레오티드를 제외한 다른 프라이머와 상동성이 존재하지 아니하여 비특이적 증폭반응을 최소화하도록 고안될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "혼성화 올리고뉴클레오티드"는 miRNA 또는 상기 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 상보결합에 의해 혼성화가능한 핵산분자를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "유니버셜 프라이머"는 증폭하고자 하는 대상 핵산분자의 종류에 무관하게 증폭이 가능한 프라이머로서 역전사 및 프라이머 연장 반응에 의해 추가된 어댑터 올리고뉴클레오티드의 핵산서열을 이용하여 제조가 가능하다. 이 경우 단일한 프라이머 세트를 활용함으로써 키트의 제조원가를 낮출 수 있는 장점이 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "포워드 프라이머"는 해당 프라이머의 방향(5' -> 3')이 유전자의 방향과 일치하는 경우의 프라이머를 의미한다. 반대로 "리버스 프라이머"는 해당 프라이머의 방향이 유전자의 방향과 반대로 되는 프라이머를 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, miRNA 또는 poly A 폴리머라제에 의해 poly A가 연결된 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 miRNA 검출용 키트가 제공된다.
상기 키트는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함할 수 있고, 상기 리버스 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 포워드 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성된 유니버셜 포워드 프라이머일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 3 내지 12 nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 3 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 키트는 역전사 효소, 열안정성 DNA 중합효소 및 dNTP 혼합물을 추가적으로 포함할 수 있고, 폴리 A 폴리머라아제 및 ATP를 더 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 증폭대상 miRNA를 상기 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및 상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 증폭 대상 miRNA에 poly A 꼬리를 연결하는 poly A 꼬리연결 miRNA 제조단계;
상기 poly A 꼬리연결 miRNA의 poly A 꼬리와 특이적으로 혼성화하는 poly dT로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계; 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및 상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법이 제공된다.
상기 검출방법에 있어서, 상기 포워드 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 포워드 프라이머일 수 있고, 상기 리버스 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성된 유니버셜 리버스 프라이머일 수 있다.
상기 검출방법에 있어서, 상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 3 내지 12 nt 또는 15 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 검출방법에 있어서, 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 3 내지 30 nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 검출방법에 있어서, 상기 PCR 단계는 실시간 PCR 반응에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 특별히 언급되지 않은 한, 복수의 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로 구성된 핵산분자는 5'-말단에서 3'-말단의 순서로 설명된다.
이하 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법을 첨부된 도면을 통해 보다 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리 A 폴리머라아제를 이용한 miRNA 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, miRNA(101)는 약 22 nt 정도의 매우 짧은 핵산분자이다. miRNA(101)는 mRNA와는 달리 폴리 A 꼬리가 없기 때문에, miRNA(101)가 포함된 시료에 폴리 A 폴리머라제와 ATP를 혼합하여 반응을 시키면, miRNA(101)에 폴리 A 꼬리(102)가 부착되어 폴리 A 꼬리화 miRNA(110)이 생성된다. 여기에 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(102)인 poly dT와 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드(103)로 구성된 역전사용 프라이머(104)을 혼합하면 폴리 A 꼬리(102)와 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(102)가 상보결합을 하게 되고, 여기에 역전사효소와 dNTP 혼합물을 첨가하여 역전사반응을 수행하면, 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드-제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(102)-안티센스가닥 cDNA(111)로 구성된 표적 miRNA의 역전사 산물(106)이 생성된다. 상기 역전사 산물(106)에 대하여 안티센스가닥 cDNA에 상보적인 서열을 갖는 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드(122)을 3'-말단으로 갖고 miRNA(110) 및 안티센스 cDNA(111)와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드(121)를 5'-말단으로 갖는 연장용 프라이머(120)와 혼성화시킨 후, DNA 중합효소로 프라이머 연장반응을 수행하면, 연장된 이중가닥 cDNA(130)가 생성된다. 연장된 이중가닥 cDNA(130)을 주형으로 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열을 갖는 리버스 프라이머(133)과 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단의 핵산서열을 갖는 포워드 프라이머(132)로 PCR 반응을 수행하면 연장된 이중가닥 cDNA(130) 지수적으로 증폭되게 된다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 특이적 포워드 프라이머를 이용한 miRNA 검출방법를 개략적으로 나타낸 개요도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, miRNA(101)의 3'-말단의 5-7 nt 바람직하게는 6 nt의 부분과 특이적으로 상보결합할 수 있는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드(134) 및 이와 연결되어 있으며, 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드(135)로 구성된 miRNA 특이적 리버스 프라이머(136)가 혼성화한 후, 역전사효소에 의해 역전사 반응이 일어나면 안티센스 가닥 cDNA(137)이 생성된다. 안티센스 가닥 cDNA(137)에 상술한 6 nt를 제외한 miRNA 부분(즉, 16 nt 정도)과 특이적으로 상보결합할 수 있는 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드(138) 및 이에 연결된 임의의 올리고뉴클레오티드로서 안티센스 가닥 cDNA(137)이나 miRNA(101) 모두에 대하여 상보결합하지 않는 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드(142)로 구성된 연장용 프라이머(143)로 연장반응을 수행하면, 양방향으로 연장이 이루어져, miRNA 특이적 프라이머(136) 부분 및 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드(142) 부분의 상보적인 가닥을 포함한 연장 산물이 생성된다. 이때, 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드(142)는 모든 miRNA 검출 키트에서 공통으로 사용되는 유니버셜 리버스 프라이머 부분인 5'-영역(141)을 5'-말단에 포함하고 있고, 그 외의 부분인 3'-영역(139)은 miRNA 종류에 따라 서열 및/또는 길이를 달리함으로써 multiplex 분석시 동시에 다양한 miRNA를 검출할 수 있게 한다. 연장반응이 완료되면 동일 튜브에서 miRNA 특이적 프라이머(136)과 5'-영역(141)에 상응하는 포워드 프라이머(144)를 이용한 PCR을 통해 PCR 산물(145)이 생성된다. 상기 포워드 프라이머(144)의 경우 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단의 핵산서열로부터 선택되는데, 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 서열을 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 서열로 고안할 경우, 유니버셜 포워드 프라이머가 되게 된다. PCR 산물(145)는 실시간 PCR에 의해 반응과정에서 검출될 수 있고, 반응이 완결된 후, 아가로즈 겔 전기영동 등에 의해 확인이 가능하다. 상기 miRNA 특이적 프라이머의 경우, 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 길이가 충분히 길 경우, 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 전부 또는 일부 서열로 구성된 리버스 프라이머가 사용될 수 있고, 이 경우 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열을 사용할 수 있는데, 이를 유니버셜 리버스 프라이머라고 한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예:
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른, miRNA에 poly A 연결 후 oligo dT 프라이머를 이용한 역전사 이후, miRNA 특이적 서열을 포함한 연장용 프라이머를 이용한 양방향 연장반응 후, PCR을 이용하여 다양한 miRNA를 검출하였다. 아울러, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른, oligo dT 프리이머 사용 없이, miRNA의 3'-말단의 특이적인 6 nt의 핵산서열을 5'-말단으로 갖는 miRNA 특이적 포워드 프라이머와 상기 6 nt의 핵산서열 외의 miRNA 특이적 서열을 갖는 연장용 프라이머를 이용하여 다양한 miRNA를 검출하였다. 검출하고자 한 miRNA는 하기와 표 1과 같다.
폴리 A 폴리머라아제를 사용한 방법의 경우, 42℃에서 60분간 poly A 꼬리연결 및 역전사 반응을 수행한 후, 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰고, 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 15분간 DNA를 녹인 후, 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 70℃에서 30초를 40 사이클 돌린 후, 녹는점곡선(melting curve)은 95℃ 10초 가열 후 65℃에서 95℃까지 5초당 0.5℃씩 상승하게 함으로써 측정하였다.
miRNA 특이적 프라이머를 사용한 방법의 경우, 42℃에서 60분간 역전사 반응을 수행한 후, 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰고, 프라이머 연장반응 및 PCR은 95℃에서 15분간 DNA를 녹인 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 40초를 40 사이클 돌린 후, 녹는점곡선(melting curve)은 95℃ 10초 가열 후 65℃에서 95℃까지 5초당 0.5℃씩 상승하게 함으로써 측정하였다.
PCR 반응은 ABI사의 실시간 PCR 장치를 이용하여 수행하였으며, 실제 PCR 반응이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위하여, 1.5% 아가로즈 겔 전기영동을 통해 밴드패턴을 확인하였다.
본 발명의 실시예
실시예 증폭 대상 miRNA 폴리 A 폴리머라아제 사용 여부 역전사용 프라이머(서열번호) 연장용 프라이머(서열번호) 포워드 프라이머 리버스 프라이머
1 miR-532 Y 1 10 18 19
2 miR-196b Y 11
3 miR-362 Y 12
4 miR-29c Y 13
5 miR-106b Y 14
6 miR-200c Y 15
7 miR-127 Y 16
8 miR-145 Y 17
9 miR-532 N 2 10 2
10 miR-196b N 3 11 3
11 miR-362 N 4 12 4
12 miR-29c N 5 13 5
13 miR-106b N 6 14 6
14 miR-200c N 7 15 7
15 miR-127 N 8 16 8
16 miR-145 N 9 17 9
비교예:
본 발명자들은 비교예로 Qiagen 사에서 판매되는 miRNA 검출키트를 사용하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트와 성능을 비교하였다.
비교예
비교예 증폭 대상 miRNA 검출방식
1 miR-532 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
2 miR-196b 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
3 miR-362 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
4 miR-29c 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
5 miR-106b 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
6 miR-200c 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
7 miR-127 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
8 miR-145 앵커 올리고 dT 어댑터 사용
상술한 분석 결과, 도 3 내지 25에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트 및 방법에 따르면, Qiagen사의 상용 miRNA 검출키트보다 더 선명하고 정확한 miRNA 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 miRNA를 고가의 장비 없이도 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하며, 복수의 miRNA를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 분석 역시 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출용 키트 및 방법은 암을 비롯한 각종 질병의 진단 및 예후 판정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
서열번호 1 내지 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA 검출 키트에 사용되는 각종 프라이머들의 핵산서열이다.

Claims (17)

  1. miRNA 또는 poly A 폴리머라제에 의해 poly A가 연결된 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머;
    상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA 또는 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머; 및
    상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 포함하는 miRNA 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 추가로 포함하는, miRNA 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 리버스 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 리버스 프라이머인, miRNA 검출용 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 포워드 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성된 유니버셜 포워드 프라이머인, miRNA 검출용 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 3 내지 12 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출용 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출용 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 3 내지 30 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출용 키트.
  8. 제1항에 있어서,
    역전사 효소, 열안정성 DNA 중합효소 및 dNTP 혼합물을 추가적으로 포함하는, miRNA 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    폴리 A 폴리머라아제 및 ATP를 추가적으로 포함하는, miRNA 검출용 키트.
  10. 증폭대상 miRNA를 상기 miRNA의 3'-말단과 특이적으로 혼성화하는 핵산서열로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계;
    상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및
    상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법.
  11. 폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 증폭 대상 miRNA에 poly A 꼬리를 연결하는 poly A 꼬리연결 miRNA 제조단계;
    상기 poly A 꼬리연결 miRNA의 poly A 꼬리와 특이적으로 혼성화하는 poly dT로 구성된 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 표적 miRNA와 혼성화하지 않는 임의의 핵산서열인 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 역전사용 프라이머로 역전사하는 역전사반응단계;
    상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 poly A 꼬리연결 miRNA의 3'-말단에 상응하는 부분을 제외한 상기 poly A 꼬리연결 miRNA로부터 역전사된 cDNA와 특이적으로 혼성화 가능한 제2 혼성화 올리고뉴클레오티드 및 상기 cDNA와 혼성화되지 않는 임의의 핵산서열로 구성된 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드로 구성된 연장용 프라이머로 상기 cDNA를 연장하는 연장반응단계; 및
    상기 연장된 cDNA를 주형으로 상기 역전사용 프라이머 또는 상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드와 동일한 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머 및 상기 제2 어댑터 올리고뉴클레오티드 내에서 선택되는 포워드 프라이머를 이용하여 증폭하는 PCR 단계를 포함하는, miRNA의 검출방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 포워드 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성되는 유니버셜 포워드 프라이머인, miRNA 검출방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 리버스 프라이머는 miRNA의 종류와 무관하게 동일한 핵산서열로 구성된 유니버셜 리버스 프라이머인, miRNA 검출용 키트.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 3 내지 12 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 제1 혼성화 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출방법.
  16. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 3 내지 30 nt의 길이를 갖는, miRNA 검출방법.
  17. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 PCR 단계는 실시간 PCR 반응에 의해 수행되는, 검출방법.
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