CN117385018A - 一种快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒和扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速扩增miR‑208a的荧光定量PCR试剂盒及其扩增方法，本发明的荧光定量PCR试剂盒包括核酸快速扩增试剂。核酸快速扩增试剂包括反应缓冲液、基于miR‑208a的快速扩增引物和质控品。利用荧光定量PCR仪，本发明的扩增方法和检测方法可在15分钟内完成miR‑208a荧光定量检测。本发明miR‑208a检测方法操作简便、快速，灵敏度高、特异性强、重复性好，可为miRNA的定量检测提供新方法，对于急性心肌梗死的快速诊断具有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速扩增miR-208a的荧光定量PCR试剂盒和扩增方法，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
心血管疾病是全球死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率均居于前列，甚至高于肿瘤及其他疾病。其中，冠心病是发病率最高、危害性最大的一种心血管疾病，而急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是冠状动脉疾病最严重的表现。临床上，AMI在初始阶段没有明显的临床表现，许多患者只有在发生持续性剧烈胸骨后疼痛时才会选择前往医院就诊，从而错过了最佳治疗时机，预后不佳。因此实现AMI的早期诊断对于降低AMI的死亡率、改善患者的远期预后具有非常重要的意义。
目前临床诊断AMI的金标准为肌钙蛋白cTnI，但相关研究表明cTnI需在胸痛发作4～12h才可以在血浆中被检测到，而且cTnI在严重心力衰竭、心房颤动等心脏疾病以及慢性肾病、感染性休克等非心脏疾病中均有所增加。Micro RNA(miRNA)是一类长度为19-24个核苷酸的内源性非编码短单链RNA。目前大量研究表明，miRNA在心肌梗死时的表达水平变化比传统的心肌梗死标志物更早，且具有较高的特异性。其中miR-208a通过增加心肌内啡肽表达诱导急性心肌梗死的心肌纤维化。在AMI发病1小时内，miR-208a水平显著升高至可检测水平，并在3小时内达到峰值。因此miR-208a有望成为可替代cTnI的AMI早期诊断新型生物标志物。
目前传统的miRNA检测方法有以下几种：(1)RNA印迹(Northern Blotting)是系统分析miRNA表达的最早检测方法。然而这种基于探针杂交技术的方法特异性和灵敏度不高，存在耗时长、成本高、消耗样本量大的缺点。(2)微阵列芯片技术(Microarray Chips)与RNA印迹相似，常常被用于进行miRNA的高通量检测，且检测速度较快。然而由于miRNA序列较短且同种族序列相似度极高，导致此方法灵敏度和选择性较低、价格昂贵。(3)实时定量PCR(Quantitative real time-PCR，qRT-PCR)被认为是miRNA检测的金标准，具有灵敏度高、特异性强的优点。然而与DNA相比，miRNA需在PCR扩增前进行逆转录，导致miRNA的检测时间较长，不利于实现基于miRNA生物标志物的早期诊断。
因此，本领域亟需开发一种能够高效精准检测miR-208a，且检测时间短、灵敏度高、特异性强、成本可控的即时快速检测方法。这对于实现AMI的即时诊断、降低AMI死亡率具有极其重要的意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术在快速检测miRNA应用中存在的时间长、特异性差等问题，本发明提供了一种快速扩增miR-208a的荧光定量PCR试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是针对现有技术在检测miR-208a中存在的局限性，提供一种快速扩增miR-208a的方法，该扩增灵敏度优于荧光定量PCR方法，且可在15分钟内完成核酸检测。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速扩增miR-208a的荧光定量PCR试剂盒，所述荧光定量PCR试剂盒包括如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ IDNO：2所示的反向引物，所述正向引物和反向引物的摩尔比为1∶1～1∶2。
其中，所述荧光定量PCR试剂盒还包括核酸荧光染料，作为优选，所述核酸荧光染料包括但不仅限于SYBR Green I、Eva Green或SYTO 9中的一种或几种。
其中，所述荧光定量PCR试剂盒的正向引物和反向引物上标记有特定标记物，两种标记物相互靠近可激发或淬灭荧光，作为优选，所述特定标记物包括但不仅限于FITC、FAM、HEX、ROX、Cy3、Cy5、TAMRA、DabcyI、BHQ2、BHQ3中的两种或几种。
其中，所述荧光定量PCR试剂盒还包括扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、无酶水、阳性对照和阴性对照。
其中，所述阳性对照：miR-208a标准品；阴性对照：灭菌双蒸水。
本发明内容还包括一种快速扩增miR-208a的方法，包括以下步骤：
(1)配制含有miR-208a的反应体系，所述反应体系还包括所述荧光定量PCR试剂盒中的试剂；
(2)将步骤(1)得到的反应体系加入荧光定量PCR仪中，设置PCR反应程序，所述PCR反应程序包括：第一步变性，变性温度为65～75℃，反应时间为1～10秒；第二步扩增，扩增温度为55-65℃，反应时间为1～10秒；共0～50个循环，优选地，共40～50个循环，更优选地，共40个循环。
其中，所述反应体系的模板用量为1～5μL，作为优选，模板用量为4μL。
其中，所述第一步变性温度69～70℃，所述第二步扩增温度60～61℃，每步温度反应时间为6～8秒。
其中，所述反应体系的模板浓度为1×100～1010pmol/L。
其中，所述阳性对照：miR-208a标准品；阴性对照：灭菌双蒸水。
本发明内容还包括一种快速检测miR-208a的方法，当反应结束(约15分钟)后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.001)时判定为阴性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1)检测用时短：核酸扩增反应只需约15分钟，根据实时荧光扩增曲线即可判定结果。
2)操作简便：本发明的快速扩增方法所使用的聚合酶同时具有逆转录活性和聚合酶活性，仅需一对链交换扩增引物、一种聚合酶即可实现对靶标RNA的扩增，无需额外的逆转录步骤。
3)特异性强：本发明荧光定量PCR试剂盒对靶标miR-208a高效特异，与AMI相关的其他miRNA生物标志物无交叉反应性。
4)灵敏度高：本发明的荧光定量PCR试剂盒最低检测极限可达到1×100pmol/L，优于常规荧光定量PCR方法。
5)广泛的适用性：核酸快速扩增方法及其检测试剂盒具有广泛的适用性，可灵活应用于其他miRNA家族的扩增，常规引物即可扩增，应用前景广阔。
6)适于即时检测：本发明可使用便携式荧光定量设备完成检测，结果判读简单快捷，适于现场检测。
综上，本发明的荧光定量试剂盒及其检测方法具有用时短、适于短序列扩增、适用范围广、操作简便、特异性高、灵敏度高、重复性好、通用性强、适于即时检测等优点，为临床上快速诊断AMI提供了新的技术支持，具有广阔的市场前景和较大的社会、经济效益。
附图说明
图1为本发明快速扩增检测方法的建立。
图2为本发明扩增模板使用量优化结果。
图3为本发明快速扩增方法变性温度优化结果。
图4为本发明快速扩增方法扩增温度优化结果。
图5为本发明快速扩增方法变性时间优化结果。
图6为本发明快速扩增方法延伸时间优化结果。
图7为本发明快速扩增方法酶切验证结果。
图8为本发明快速扩增试剂盒特异性测试结果。
图9为本发明快速扩增试剂盒重复性测试结果。
图10为本发明快速扩增试剂盒灵敏度测试结果。
图11为本发明快速扩增试剂盒标准曲线的建立。
图12为本发明快速扩增试剂盒临床验证结果。
图13为本发明快速扩增试剂盒与临床金标准的相关性分析结果。
图14为本发明快速扩增试剂盒临床检测的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1：基于miR-208a的快速扩增引物组的设计
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的miR-208a参考序列(NC000014.9)，使用BLASTn、MAFFT、DNASTAR等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分析，获得miR-208a序列特异性的保守区域。根据保守靶基因序列，利用PrimerPremier5.0和在线工具NUPACK(http：//www.nupack.org/)进行快速扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST检索验证，优选一对正向引物与反向引物序列信息如下：
表1基于miR-208a的快速扩增引物信息
实施例2：快速扩增miR-208a方法的建立
使用实施例1中设计的miR-208a特异性扩增引物对(购自上海生工生物工程股份有限公司)、miR-208a标准品(AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU)(10nmol/L)(购自上海生工生物工程股份有限公司)和阴性对照(灭菌双蒸水)进行扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应时间，具体方法如下：
1、反应体系的优化
以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、1～5μL模板、4μL无酶水。其中，模板的具体添加量为：1μL、2μL、3μL、4μL、5μL。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：70℃6s，60℃8s，共50个循环。
如图1所示，使用优选的扩增引物对，可以在14.62min对miR-208a标准品实现高效扩增。反应结束后，荧光信号大幅升高，进行40个循环即可完成扩增，同时阴性对照无明显荧光信号，未出现有效扩增，表明本发明提出的优选扩增引物对及方法可实现miR-208a的高效扩增。
如图2和表2所示，随着模板用量的增加，快速扩增组的时间阈值Tt先减小后增加。当模板用量为4μL时，扩增所需时间最短，13.27min即可完成扩增，表明此时扩增效率最高。此时阴性对照组未出现明显扩增。因此，确定模板的优选添加量为4μL。
表2本发明快速扩增方法在不同模板用量下的扩增时间
2、反应温度的优化
以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1 μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、4μL模板、4μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：69℃～73℃(变性温度)6s，58℃～62℃(扩增温度)8s，共50个循环。其中，变性温度具体设置为：69℃、70℃、71℃、72℃、73℃；扩增温度具体设置为：58℃、59℃、60℃、61℃、62℃。
如图3和表3所示，随着变性温度的升高，快速扩增组的时间阈值数先减小后逐渐增大，阴性对照组未出现明显的扩增信号。当变性温度为70℃时，扩增所需时间最短，15.32min即可完成扩增，表明此时扩增效率最高。因此，变性温度优选70℃。
表3本发明快速扩增方法在不同变性温度下的扩增时间
如图4和表4所示，随着扩增温度的升高，快速扩增组的时间阈值数先减小后增大，阴性对照组未出现明显的扩增信号。当扩增温度为60℃时，扩增所需时间最短，15.49min即可完成扩增，表明此时扩增效率最高。因此，扩增温度优选60℃。
表4本发明快速扩增方法在不同扩增温度下的扩增时间
3、反应时间的优化
以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、4μL模板、4μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：70℃4～8s(变性时间)，60℃5～9s(延伸时间)，共50个循环。其中，变性时间具体设置为：4s、5s、6s、7s、8s；扩增时间具体设置为：5s、6s、7s、8s、9s。
如图5和表5所示，随着变性时间的增加，快速扩增组的时间阈值数先减小后增大，阴性对照组未出现明显的扩增信号。当变性时间为6s时，扩增所需时间最短，12.74min即完成扩增，对应着扩增效率最高。因此，变性时间优选6s。
表5本发明快速扩增方法在不同变性时间下的扩增时间
如图6和表6所示，随着延伸时间的增加，快速扩增组的时间阈值数先减小后增大，阴性对照组未出现明显的扩增信号。当延伸时间为8s时，扩增时间最短，16.28min即可完成扩增时间，对应着扩增效率最高。因此，延伸时间优选8s。
表6本发明快速扩增方法在不同延伸时间下的扩增时间
4、快速扩增产物酶切验证
本发明快速扩增产物中含有限制性核酸内切酶AluI(AG▲CT)的识别位点，可对miRNA-208a扩增产物进行酶切鉴定。
第一步，以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μLdNTPs(10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、4μL模板、4μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：70℃6s，60℃8s，共50个循环。
第二步，取5μL扩增产物进行酶切反应。20μL酶切反应体系包括：5μL扩增产物、1.5μL AluI限制性核酸内切酶(10000U/mL)、2μL CutSmart缓冲液、11.5μL无酶水。将含有反应体系的反应管混匀后离心，在37℃下恒温孵育1小时，取5μL酶切产物使用3.5％琼脂糖凝胶上以100V电压电泳40min，于紫外灯下观察结果。以20bp DNA Ladder作为参考。
如图7所示，琼脂糖凝胶电泳结果显示，快速扩增产物呈现典型的梯状条带，无弥散现象，与DNA Ladder标准品对比可知，扩增产物的长度约为44bp。经过酶切反应后，累积的碱基被充分剪切，酶切产物的电泳结果呈现单一明亮条带，表明扩增引物对正确，可高效实现快速扩增。
实施例3：快速扩增miR-208a检测试剂盒的特异性测试
用实施例2确定的优化反应体系及反应条件进行快速扩增及荧光定量检测。取miR-208a-3p标准品(AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU)、非互补序列(UUGUACUACACAAAAGUACUG)、miR-133a(UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG)、miR-499a(AACAUCACAGCAAGUCUGUGCU)，并设置阴性对照(无酶双蒸水)。按照实施例2确定的优化反应体系和反应条件进行快速扩增。反应程序为：70℃6s，60℃8s，共50个循环。
如图8所示，仅miR-208a显示出荧光扩增曲线，而其他3种核酸序列和阴性对照均无荧光信号。结果表明，本发明快速扩增检测方法的特异性好，具有较高的检测应用价值。
实施例4：快速扩增miR-208a检测试剂盒的重复性测试
以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、4μL模板、4μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：70℃6s，60℃8s，共50个循环。
结果如图9和表7所示，通过对miR-208a标准品进行10次扩增测试，荧光信号时间阈值(Tt)稳定在11.98附近，变异系数约为5.85％；阴性对照荧光信号时间阈值(Tt)稳定在18.94附近，变异系数为4.38％，二组数据存在极其显著的统计学差异，有利于实际应用。
表7本发明快速扩增miR-208a方法检测阳性质控和阴性质控结果对比
注：CV表示变异系数。
实施例5：快速扩增miR-208a检测试剂盒的灵敏度测试
本实施例测试本发明快速扩增miR-208a检测试剂盒的灵敏度。将miR-208a标准品从1×1010pmol/L进行10倍梯度稀释至1×10-1pmol/L。反应体系和程序如下所示：
以miR-208a合成标准物质(10nmol/L)为模板，采用实施例1设计得到的miR-208a特异性引物进行快速扩增。20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、2μL PEG 200、1.2μL MgSO4(100mM)、1μL 20×Eva Green、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1.5μL正向引物F和1.5μL反向引物R(10μM)、4μL不同浓度的miR-208a标准品、4μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照。将含有反应体系的反应管混匀后离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：70℃6s，60℃8s，共50个循环。
检测结果如图10所示，图中：荧光扩增曲线对应的miR-208a标准品模板浓度分别为1×1010pmol/L、1×109pmol/L、1×108pmol/L、1×107pmol/L、1×106pmol/L、1×105pmol/L、1×104pmol/L、1×103pmol/L、1×102pmol/L、1×101pmol/L、1×100pmol/L、1×10-1pmol/L，而1×10-1pmol/L和阴性对照则看不到明显的曲线。判定本试剂盒的检测灵敏度为1×100pmol/L，具有较高的灵敏度和应用价值。图11为本发明快速扩增miR-208a试剂盒的时间阈值(Tt)与梯度稀释的miR-208a标准品浓度所建立的线性关系。
结果表明，本试剂盒的荧光定量检测方法最低检出限1×100pmol/L，本发明快速扩增miR-208a试剂盒的时间阈值(Tt)与梯度稀释的miR-208a标准品浓度存在良好的线性关系，具有较高的灵敏度和检测价值，并可实现快速定量检测。
本发明的快速扩增方法与同类技术(常规链置换方法、PCR方法)主要指标对比如表8所示，本发明的快速扩增方法具有检测用时短，操作难度低、灵敏度高、特异性强等优点，可在15min内完成miRNA的高效扩增，有望成为miRNA定量检测新方法。
表8本发明与同类技术主要指标对比
实施例6：临床样本验证测试
1、基于血浆样本的miR-208a快速扩增检测
用实施例2确定的优化反应体系及反应条件进行快速扩增及荧光定量检测。为评估本发明方法在检测临床样品中miR-208a的应用性能，使用25例AMI患者的血浆作为AMI组，该组患者均符合AMI的诊断标准，并且排除恶性肿瘤、肝肾功能不全以及既往有心肌梗死、脑卒中等CVDs病史，在符合医院伦理要求情况下留取新鲜血液样本于EDTA抗凝管中，经4℃离心后采集上层血浆用于提取miRNA，使用miRNA提取试剂盒(Cwbio，Taizhou，China)对采集到的血浆进行细胞裂解与miRNA提取，使用30μL RNase-free Water洗脱miRNA。同时，随机选取近邻时间进行健康体检人群17例(身体无异常，未接受药物治疗)作为对照组。检测结果如图12所示，AMI组和对照组的时间阈值(Tt)结果具有极其显著的统计学差异。
2、miR-208a检测结果(Tt)与cTnI浓度相关性分析
为了验证本发明快速扩增miR-208a方法的临床诊断价值，使用25例AMI组的临床cTnI浓度值(由东南大学附属中大医院医学检验科提供)与其对应miR-208a的时间阈值进行相关性分析。结果如图13所示，miR-208a的时间阈值与cTnI浓度存在较强的相关性(R2＝0.8160)，表明miR-208a有可能成为替代cTnI的潜在生物标志物。
3、临床样本的ROC曲线分析
基于AMI组和对照组的miR-208a时间阈值与cTnI浓度，绘制ROC曲线对本发明快速扩增方法进行分析。结果如图14所示，本发明快速扩增miR-208a检测试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对于临床上实现AMI的早期诊断具有潜在的应用价值。
实施例7：miR-208a快速扩增试剂盒的组装
依据实施例1中设计的miR-208a特异性扩增引物委托上海生工生物工程股份有限公司进行合成，使用无酶双蒸水将正向引物和反向引物均稀释成10μM，等体积混合后得到检测引物。使用商品化的miRNA提取试剂盒提取AMI患者血浆样本中的miRNA作为阳性对照。核酸扩增试剂：10×反应缓冲液(其组成包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％TritonX-100，pH 8.6～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、PEG 200、荧光染料20×Eva Green、Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、扩增引物、阳性对照以及阴性对照(灭菌双蒸水)。
以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品说明书(包括产品保存条件、反应体系配制方法、反应程序设置和结果判定方法等)，组装成本发明所述的miR-2008a快速扩增检测试剂盒。
Claims (10)
1.一种快速扩增miR-208a的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物，所述正向引物和反向引物的摩尔比为1:1 ~ 1:2。
2.根据权利要求1所述的快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒还包括核酸荧光染料。
3.根据权利要求2所述的快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述核酸荧光染料包括SYBR Green I、Eva Green或SYTO 9中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述正向引物和反向引物上标记有特定标记物，两种标记物相互靠近可激发或淬灭荧光。
5.根据权利要求4所述的快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述特定标记物包括FITC、FAM、HEX、ROX、Cy3、Cy5、TAMRA、DabcyI、BHQ2、BHQ3中的两种或几种。
6.根据权利要求1所述的快速扩增miR-208a荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒还包括扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、无酶水、阳性对照和阴性对照。
7.一种快速扩增miR-208a的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制含有miR-208a的反应体系，所述反应体系还包括权利要求1~6任一项所述的荧光定量PCR试剂盒中的试剂；
（2）将步骤（1）得到的反应体系加入荧光定量PCR仪中，设置PCR反应程序，所述PCR反应程序包括：第一步变性，变性温度为65~75℃，反应时间为1~10秒；第二步扩增，扩增温度为55-65℃，反应时间为1~10秒；共0~50个循环。
8.根据权利要求7所述的快速扩增miR-208a的方法，其特征在于，所述反应体系的模板用量为1~5 μL，作为优选，模板用量为4 μL。
9.根据权利要求7所述的快速扩增miR-208a的方法，其特征在于，所述第一步变性温度69~70℃，所述第二步扩增温度60~61℃， 每步温度反应时间为6~8秒。
10.根据权利要求7所述的快速扩增miR-208a的方法，其特征在于，所述反应体系的模板浓度为1×100 ~1010 pmol/L。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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