CN108300804B

CN108300804B - 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法

Info

Publication number: CN108300804B
Application number: CN201810014502.8A
Authority: CN
Inventors: 王通
Original assignee: Dongguan Microprecision Testing Research Institute Co ltd
Current assignee: Dongguan Microprecision Testing Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2018-01-08
Filing date: 2018-01-08
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2038-01-08
Also published as: CN108300804A

Abstract

本发明公开了一种用于HBV miR‑3荧光定量PCR检测的材料及方法，材料中包括逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针，其中逆转录引物序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGC；qPCR前引物序列为：TACAACCTGGATGTGTCTGCG；qPCR后引物序列为：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA；特异性荧光探针序列为：荧光基团‑CGTTTGTCGTATCCAGT‑淬灭基团。经验证表明使用本发明中的引物和特异性荧光探针结合本发明中提供的方法，可以实现HBV miR‑3的高特异性的定量检测。

Description

用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法

技术领域

本发明涉及用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法。

背景技术

miRNA是一类有重要功能的非编码RNA，生物体中存在有种类繁多的大量miRNA。而在感染性疾病领域，病原体来源的miRNA往往被认为具有潜在的诊断能力，最突出的例子是在艾滋病领域，Narayanan等在2013年发现人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus,HIV)编码的miRNA被证实可被感染细胞分泌至胞外(Narayanan A,Iordanskiy S,Das R,et al.Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA.[J].Journal of Biological Chemistry,2013,288(27):20014.)。

对于乙型肝炎的病原体——乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)，Jin等早期研究通过计算预测HBV基因组有且仅有一个编码miRNA的潜在位点(Jin W B,Wu F L,KongD,et al.Brief communication:HBV-encoded microRNA candidate and its target[J].Computational Biology&Chemistry,2007,31(2):124.)，但该研究并未给出确切的证据。随后10年间，这一领域未见任何发表物证实HBV来源miRNA的存在。直至2017年，Yang等人在其发表的研究论文中才终于证实了HBV来源miRNA的存在，并将其命名为HBV miR-3(Xi Y,Li H,Sun H,et al.Hepatitis B Virus-Encoded MicroRNA Controls ViralReplication[J].Journal of Virology,2017,91(10):JVI.01919-16.)。

该研究使用miRNA芯片发现了HBV miR-3的存在，并使用经典的茎环逆转录定量PCR(stem-loop reverse transcript quantitative PCR,stem loop RT qPCR)法在HBV阳性样品中实现了定量检测。因而该项工作中发表的引物序列是目前基于PCR实现HBV miR-3定量检测的唯一方法。

Yang等人在其研究使用的检测方法中使用SYBR Green染料来对HBV miR-3进行定量。由于SYBR Green可非选择性地插入到双链DNA内部并发出荧光，其显示的实际上是qPCR体系中双链DNA的数量，而并不区分这些双链DNA是否为HBV miR-3的PCR产物，在我们的实验中也证明该方法的PCR反应中存在大量的非特异扩增产物，而且通过人工合成的标准品测试显示Yang等人的引物组合仅能在PCR体系中存在高丰度(>6.02×10⁷拷贝)的HBVmiR-3时特异性扩增出目的产物，而一旦反应体系中标准品丰度<6.02×10⁷拷贝，反应结束后体系中就几乎仅剩非特异扩增产物了。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料和方法，对样本中的HBV miR-3实现高特异性的定量检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料，包括逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针，

逆转录引物序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGC(SEQ ID NO.1)；

qPCR前引物序列为：

TACAACCTGGATGTGTCTGCG(SEQ ID NO.2)；

qPCR后引物序列为：

CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA(SEQ ID NO.3)；

特异性荧光探针序列为：

荧光基团-CGTTTGTCGTATCCAGT-淬灭基团(SEQ ID NO.4)。

进一步地，荧光基团为6-FAM、5-FAM、TET、HEX、JOE、R110、TAMRA和BODIPYFL中的任意一种，淬灭基团为TAM和MGB中的任意一种。

一种HBV miR-3荧光定量检测试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及本发明中提供的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针。

进一步地，逆转录试剂包括：缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为TaqMan荧光定量PCR体系。

一种本发明中HBV miR-3荧光定量检测试剂盒的使用方法，包括：

1)从样本中提取总RNA或富集小分子RNA；

2)将上述样本RNA或小分子RNA作为模板，将逆转录试剂配制预混液，将预混液、模板、逆转录引物混匀，并加入无RNA酶H₂O补足体积，冰上孵育后使用PCR仪进行逆转录反应得到逆转录产物；

3)使用无RNA酶H₂O稀释逆转录产物，加入qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针和荧光定量PCR试剂混匀，并加入无RNA酶H₂O补足体积，将混合物放入qPCR仪中进行PCR。

进一步地，逆转录引物的工作浓度为50～100nM。

进一步地，冰上孵育时间为5～10min。

进一步地，逆转录过程中，PCR仪的程序设置为：16℃保温30min；42℃保温30min；85℃保温5min；4℃保温。

进一步地，qPCR前引物的工作浓度为0.8～2.0μM；qPCR后引物的工作浓度为0.4～1.0μM；特异性荧光探针的工作浓度为100～500nM。

进一步地，qPCR仪的程序设置为：95℃10min，95℃15s、60℃1min共循环40次。

本发明的有益效果是：

相对于现有的对HBV miR-3进行荧光定量PCR检测的材料与方法(后文中简称为：文献方法)，本发明在定量范围与特异性上均有优势：(1)本发明在HBV miR-3标准品的定量测试中检测范围可达7个数量级，由10¹¹拷贝至10⁵拷贝，而文献方法在同等条件下检测范围仅为5个数量级；(2)文献方法中通过使用SYBR Green体系进行测试，本发明中使用了HBVmiR-3特异性荧光探针，其对于HBV miR-3的扩增特异性明显高于文献方法中的方法，在10¹¹拷贝至10⁵拷贝丰度范围内有极好的线性关系(R²＝0.996)，荧光定量PCR检测范围达7个数量级。

附图说明

图1为本发明引物组的荧光PCR扩增曲线图，图中5组曲线，从左至右的4组曲线的模板丰度依次为6.02×10¹¹拷贝，6.02×10⁹拷贝，6.02×10⁷拷贝，6.02×10⁵拷贝，第5组为H₂O对照组；

图2为文献方法引物组的荧光PCR扩增曲线图，图中5组曲线，从左至右的4组曲线的模板丰度依次为6.02×10¹¹拷贝，6.02×10⁹拷贝，6.02×10⁷拷贝，6.02×10⁵拷贝，第5组为H₂O对照组；

图3为分别使用本发明引物组和文献方法引物组，模板丰度依次为6.02×10¹¹拷贝，6.02×10⁹拷贝，6.02×10⁷拷贝，6.02×10⁵拷贝的梯度样本定量结果的标准曲线图；

图4为本发明引物组与文献方法引物组扩增特异性对比；

图5为本发明方法的荧光PCR扩增曲线图，图中9组曲线，从左至右的7组曲线的模板丰度依次为6.02×10¹¹拷贝、6.02×10¹⁰拷贝、6.02×10⁹拷贝、6.02×10⁸拷贝、6.02×10⁷拷贝、6.02×10⁶拷贝、6.02×10⁵拷贝，第8组为无逆转录引物对照组，第9组为H₂O对照组；

图6为使用本发明方法，模板丰度依次为6.02×10¹¹拷贝、6.02×10¹⁰拷贝、6.02×10⁹拷贝、6.02×10⁸拷贝、6.02×10⁷拷贝、6.02×10⁶拷贝、6.02×10⁵拷贝的梯度样本定量结果的标准曲线图。

具体实施方式

针对现有测序引物和测序方法中存在的问题，我们通过研究HBV miR-3的序列特征，经过大量实验，对引物序列以及特异性探针序列进行不断改进与人工优化，最终得到了本发明中HBV miR-3荧光定量PCR检测的引物与特异性荧光探针，经过检验，新设计的引物与现有技术中的引物相比，具有更好的特异性，将新设计的引物与特异性荧光探针一起应用于HBV miR-3荧光定量PCR检测可以使特异性进一步优化，检测准确度也进一步提高，在10¹¹拷贝至10⁵拷贝丰度范围内有极好的线性关系(R²＝0.996)，荧光定量PCR检测范围达7个数量级。

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验包括RNA提取、逆转录、qPCR等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔,萨姆布鲁克,等.分子克隆实验指南(第三版)[M].科学出版社,2002.)，或按照厂商所建议的条件。以下实施例中所用到的原始试剂和材料均可商购得到。其中HBV miR-3标准品购自宝生物工程(大连)有限公司，逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针由赛默飞世尔科技合成。

实施例1：HBV miR-3检测特异性的比较

由于目前仅有一种HBV miR-3定量PCR检测方法，故本发明主要参比对象为文献方法中使用的引物组合，其中，

逆转录引物序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAACGCCG(SEQ IDNO.5)；

qPCR前引物序列：TGCGGCTGGATGTGTCTGCGG(SEQ ID NO.6)。

文献方法报道的定量方法基于非特异的SYBR Green染料进行，故我们首先使用与文献方法中相同的SYBR Green方法对人工合成的HBV miR-3标准品进行实验，以比较本发明引物组(包括逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物)与文献引物组检测性能的差别。

实施步骤如下：

1)对HBV miR-3标准品进行倍比稀释，稀释至浓度分别为6.02×10¹¹拷贝、6.02×10⁹拷贝、6.02×10⁷拷贝、6.02×10⁵拷贝的标准液，分别命名为E11、E9、E7和E5标准液；

2)使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcript Kit(Applied Biosystems)进行逆转录反应，根据试剂盒说明书配制预混液，预混液配方如表1：

表1逆转录预混液配方

	每管体积(μL)
		10×RT Buffer	1.5
RNA酶抑制剂	0.19
		dNTP	0.15
H<sub>2</sub>O	4.16
		逆转录酶	1
总体积	7

3)在0.2mL PCR管中按表2加入标准液与逆转录引物，进行两个平衡实验，其中一个实验使用本发明的逆转录引物(下称实验1)，另一个使用文献方法报道的逆转录引物(下称实验2)：

表2逆转录上样顺序

标准液浓度(拷贝)	6.02×10<sup>11</sup>	6.02×10<sup>9</sup>	6.02×10<sup>7</sup>	6.02×10<sup>5</sup>
					模板体积(μL)	1	1	1	1
逆转录引物(μL)	1.5	1.5	1.5	1.5
					H<sub>2</sub>O(μL)	5.5	5.5	5.5	5.5

4)在步骤3)管中每管加入7μL预混液，温和吹打混匀；

5)冰上孵育5min，将PCR管转移至PCR仪内，设置反应程序：16℃保温30min、42℃保温30min、85℃保温5min、4℃保温；

6)待PCR仪显示温度下降至4℃后取出PCR管；

7)将步骤6)得到的逆转录引物用无RNA酶H₂O稀释5倍，同时增加一个H₂O对照孔(仅加入无RNA酶H₂O作为模板)，使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix进行qPCR。在qPCR管中按表3配制qPCR反应体系，其中实验1使用本发明的HBV miR-3qPCR前/后引物，实验2使用文献方法报道的前/后引物，qPCR反应对每个样品做两个技术重复：

表3qPCR反应体系

	体积(μL)
		模板	2
qPCR前引物	2.5
		qPCR后引物	2.5
H<sub>2</sub>O	5.5
		SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	12.5
总体积	25

8)混匀体系，放入qPCR仪中，设置反应程序：95℃ 30s，95℃ 15s、60℃ 15s共循环40次；熔解曲线；

9)收集荧光定量数据进行分析。

扩增曲线如图1、图2所示，根据图1、图2显示，在相同条件下，扩增曲线显示对于相同丰度的模板，本发明引物组与文献方法可得到近似的定量数值。而本发明中的引物组对于相同的模板，技术重复间显示出优势，定量结果的标准曲线图如图3所示，使用本发明引物组R²＝0.988，使用文献方法引物组R²＝0.949，本发明的决定系数明显高于文献方法，表明使用本发明引物组的特异性优于使用文献方法引物组。

为了确定qPCR对目的RNA扩增的特异性，结果如图4所示，我们对qPCR产物进行了熔解曲线分析。我们发现在高浓度(6.02×10¹¹拷贝)时，两种引物组均有单一的扩增产物，其退火温度(Tm)约为84℃(下称产物1)。而在阴性对照(以无菌H₂O为模板)孔中，这两种引物组均存在一定的荧光信号，该产物的Tm约为92℃(下称产物2)。根据分子动力学原理，产物1是由高浓度模板特异性结合引物组扩增出来的特异性扩增产物，而产物2则是引物自连等扩增出来的非特异扩增产物。

据此分析，使用两种引物组在模板丰度较低，即<6.02×10⁷拷贝时均存在一定量的产物2，即存在非特异扩增现象。相对而言，本发明引物组对于6.02×10⁷拷贝的模板扩增的大部分产物仍为特异性的产物1，而此时文献方法扩增的大部分均为非特异的产物2。当模板量降至6.02×10⁵拷贝时，本发明引物组仍能扩增出部分特异性的产物1，文献方法则几乎仅剩非特异的产物2。

上述结果证明本发明引物组在使用非特异的SYBR Green荧光定量方法的情况下，相较于文献方法中的引物组，在定量准确性与特异性上有优势。

实施例2：HBV miR-3定量特异性的优化

在实施例1结果的基础上，我们设法优化对HBV miR-3定量的特异性。TaqMan探针法利用可与目的片段互补配对的荧光探针，在具有5’→3’校正功能的DNA聚合酶作用下将结合于目的片段上的荧光探针水解，从而发出荧光信号，故可大大增加qPCR检测的特异性。据此本发明在引物组的基础上，设计了HBV miR-3特异性的TaqMan荧光探针，并通过实验测试加入探针后的性能。

实施步骤如下(以下步骤中使用的为本发明中的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针)：

1)对HBV miR-3标准品进行连续10倍倍比稀释，稀释至浓度分别为6.02×10¹¹～6.02×10⁵拷贝的标准液，样品间隔1个数量级，分别命名为E11～E5标准液；

3)在0.2mL PCR管中按表4加入标准液与逆转录引物：

表4逆转录上样顺序

4)在步骤3)管中每管加入7μL预混液，温和吹打混匀；

6)待PCR仪显示温度下降至4℃后取出PCR管；

7)将步骤6)得到的逆转录引物用无RNA酶H₂O稀释5倍，同时增加一个H₂O对照孔(仅加入无RNA酶H₂O作为模板)，使用TaqMan Universal Master Mix II进行qPCR，在qPCR管中按表5配制qPCR反应体系，qPCR反应对每个样品做两个技术重复：

表5qPCR反应体系

	体积(μL)
		模板	2
qPCR前引物	2
		qPCR后引物	2
特异性荧光探针	2
		H<sub>2</sub>O	2
TaqMan Universal Master Mix II	10
		总体积	20

8)混匀体系，放入qPCR仪中，设置反应程序：95℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min共循环40次；

9)收集荧光定量数据进行分析。

加入TaqMan特异性荧光探针后本发明在定量性能上较SYBR Green方法有了进一步提高。加入TaqMan特异性荧光探针后，本发明对于样品检测的重复性依旧十分优秀，如图5所示各技术重复间荧光信号一致性高。经过优化，本发明对于同样模板检测的线性范围基本一致，检测范围达7个数量级，在更多数据点的情况下定量结果的回归曲线如图6所示，定量结果的R²为0.996，决定系数进一步提高，显示出更准确的定量能力。

这一结果表明在引物组的基础上经过优化，本发明对于HBV miR-3定量的特异性进一步优化，检测准确度也进一步提高。可认为本发明是目前HBV miR-3定量检测的最佳方法。

<110> 东莞暨南大学研究院

<120> 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaacgc 50

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tacaacctgg atgtgtctgc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccagtgcagg gtccgaggta 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgtttgtcgt atccagt 17

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtgcac tggatacgac aaacgccg 48

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgcggctgga tgtgtctgcg g 21

Claims

1.一种用于HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料，包括逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针，

逆转录引物序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACGC(SEQ ID NO.1)；

qPCR前引物序列为：

TACAACCTGGATGTGTCTGCG(SEQ ID NO.2)；

qPCR后引物序列为：

CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA(SEQ ID NO.3)；

特异性荧光探针序列为：

荧光基团-CGTTTGTCGTATCCAGT-淬灭基团(SEQ ID NO.4)。

2.根据权利要求1所述的HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料，其特征在于，荧光基团为6-FAM、5-FAM、TET、HEX、JOE、R110、TAMRA和BODIPY FL中的任意一种，淬灭基团为TAM和MGB中的任意一种。

3.一种HBV miR-3荧光定量检测试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及如权利要求1所述的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针。

4.根据权利要求3所述的HBV miR-3荧光定量检测试剂盒，其特征在于，逆转录试剂包括：缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为TaqMan荧光定量PCR体系。

5.一种如权利要求3所述的HBV miR-3荧光定量检测试剂盒的使用方法，包括：

1)从样本中提取总RNA或富集小分子RNA；

3)使用无RNA酶H₂O稀释逆转录产物，加入qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针和荧光定量PCR试剂混匀，并加入无RNA酶H₂O补足体积，将混合物放入qPCR仪中进行PCR；

所述方法不用于疾病的诊断或治疗。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，逆转录引物的工作浓度为50～100nM。

7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，冰上孵育时间为5～10min。

8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，逆转录过程中，PCR仪的程序设置为：16℃保温30min；42℃保温30min；85℃保温5min；4℃保温。

9.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，qPCR前引物的工作浓度为0.8～2.0μM；qPCR后引物的工作浓度为0.4～1.0μM；特异性荧光探针的工作浓度为100～500nM。

10.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，qPCR仪的程序设置为：95℃10min，95℃15s、60℃1min共循环40次。