CN117363801A - 用于检测生物制品中马病毒的荧光定量pcr检测组合物、检测方法及试剂盒 - Google Patents
用于检测生物制品中马病毒的荧光定量pcr检测组合物、检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于病毒分子生物学领域，特别涉及一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测组合物、检测方法及试剂盒。所述检测组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1至9所示的检测马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的引物和探针。本发明针对所选基因设计多对探针引物，最终得到的探针引物特异性好，灵敏度高，可准确定量2×107copies/μL至20copies/μL的病毒含量，同时灵敏度能达到2copies/μL；实现了在一个反应程序中同时检测DNA和RNA病毒的发明目的。
Description
技术领域
本发明属于病毒分子生物学领域，特别涉及一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测组合物、检测方法及试剂盒。
背景技术
人用生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞，都需要进行内、外源的病毒检测，以避免对产品的使用者造成危害或检测造成偏差。《中国药典》2020版，3601《生物制品生产及检定用实验动物质量控制》中微生物与寄生虫检测项目中，对马相关的病毒提出了相应检测要求。上述法规中涉及的马病毒有三种，分别为马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型，都为必检项目，且结果都要求阴性，这对检测方法有很高的灵敏度要求。《中国药典》2020版，通则中
《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》中也提到用于生产的工艺和原材料涉及外源病毒引入可能的，也需要对潜在风险病毒进行检测。这意味着生物制品中涉及马源细胞或物料的就需要对上述3种马相关病毒进行检测。
马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)，是马属动物的一种急烈性RNA传染病病毒，主要经由虫媒血液传播，以贫血、持续感染、反复发热为特征，存在于病马的血液和脏器中，尤其发病期的血液含毒量最高。
马流感病毒(Equine influenzavirus，EIV)属于正粘病毒科A型流感病毒属，其基因组由8股负链RNA构成，到目前为止，马流感仅有H7N7和H3N8两种亚型，目前临床上能检测到的马流感只有H3N8基因型，所以检测时只需要考虑H3N8这个亚型。
马疱疹病毒I型(Equine herpesvirus type I)是一种能引起孕马流产和新生马驹死亡的DNA病毒。上述这些病毒都可以通过病马的血清或细胞带入到生物制品中，从而影响生物制品的生物安全。因此及时诊断出马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型这三种病毒在生物制品的生产和检测中具有重大意义。
目前较通用的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型检测方法为酶联免疫法或单独检测PCR试剂盒。酶联免疫法操作复杂，耗时长，特异性差，容易出现假阳，需要特地制作抗体，生产周期长，灵敏度较PCR检测方法稍差。在DNA和RNA病毒同时检测时，RNA扩增比DNA多一个反转录的过程，市面上部分PCR检测试剂盒，检测DNA和RNA病毒时都需要用不同的程序，不能在同一个程序中同时检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR(qPCR)检测组合物，具有极高灵敏度和特异性，进而能在一个反应程序中同时检测DNA和RNA病毒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测组合物，所述马病毒包括马传染性贫血病毒、马A型流感病毒和马疱疹病毒I型，该荧光定量PCR检测组合物包括以下引物和探针：
上游引物EIAV：AGACCCTGCCYRCTGAACCTGGCTGAT，SEQ ID NO：1，下游引物EIAV：CTTCTCTARCTTCTTGAGCGCTTTGCTC，SEQ ID NO：2，探针EIAV：FAM-AGTTCTCCTCTGCTGTCCTAGGGATCCTA-BHQ1，SEQ ID NO：3，
上游引物EIV-A：TTTCGACAARCTATACATCTGGG，SEQ ID NO：4，下游引物EIV-A：TGTTGAGACTGTTACTCGTCCTG，SEQ ID NO：5，探针EIV-A：FAM-TTTGTCTGCTCTTGATTTGAACTCGGGTGAT-BHQ1，SEQ ID NO：6，上游引物EHV-1：CATCTCAACTCCAGCCTTATCATTAA，SEQ ID NO：7，下游引物EHV-1：CACTCACCCACTACGGTGTCTTCT，SEQ ID NO：8，
探针EHV-1：FAM-AAACACCGGCTTGCACAAGTCTGCTGCCC-BHQ1，SEQ ID NO：9。
一种马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的荧光定量PCR检测组合物。
作为优选，该试剂盒还包含阳性对照品、阴性对照品及荧光定量PCR反应试剂。
作为优选，该试剂盒组成是：
荧光定量PCR反应预混液，组成是2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，Ex Taq HS0.4μL，RT Enzyme MixⅡ0.4μL和ROX 0.4μL；
本发明所述的荧光定量PCR检测组合物，终浓度的上游引物各0.20μM，下游引物各0.20μM和探针各0.25μM；
EIAV、EIV-A和EHV-I的阳性对照品，浓度均为2×108copies/μL；
阴性对照，为无核酶水。
一种非诊断或治疗目的的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA/RNA模板；
(2)采用本发明所述的检测组合物建立荧光定量PCR反应体系；
(3)进行荧光定量PCR检测；
(4)待测样品的结果分析。
作为优选，荧光定量PCR反应体系为20μL，包含三种荧光定量PCR反应预混液分别用于检测三种不同的病毒，本发明所述的三种荧光定量PCR检测组合物分别为单种病毒的混合液15μL和模板5μL；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照标准品或阴性对照标准品。
作为优选，DNA和RNA靶位用相同的试剂和程序一起检测，步骤(3)所述荧光定量PCR检测的反应条件是：42℃反转录，5min，1个循环；95℃预变性3min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
本发明用一次qPCR程序同时进行既含DNA又含RNA病毒的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的扩增，大大节约了扩增的时间，同时具有高灵敏度和定量能力，可以提高生物制品监测、申报和放行效率。
本发明用成熟的qPCR检测方法检测马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型，设计具有高灵敏度(2copies/μL)和特异性的探针引物、成本低且快速，若结果为阳性则代表含有对应病毒，应用于生物制品或检测用细胞时能及时发现样品是否被污染，实现生物样本的安全检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明筛选设计引物时分别选取跟其病毒复制直接相关的基因，有较强的特异性；同时该基因序列为保守序列，可检出该病毒的绝大部分亚型；
2、将DNA和RNA靶位扩增程序统一时，需要DNA的引物探针要适应RNA程序，同时三个病毒的退火温度要保持一致。针对所选基因设计多对探针引物，最终筛选的探针引物特异性好，灵敏度高，可准确定量2×107copies/μL至20copies/μL的病毒含量，同时灵敏度能达到2copies/μL；
3、本发明所述的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测方法兼容性强，使用RNA扩增程序，可在一个程序里同时检测DNA和RNA病毒；
4、本发明所述的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，可以单独检测EIAV、EIV-A和EHV-1中的一种或两种，亦可同时检测，仅需在配置体系时选择对应病毒的预混液即可；
5、通过反复筛选优化反应体系，包括引物和探针的浓度，最终该检测方法需要的样本量极少，每次检测最低仅需5μL核酸样本且依然能稳定检出。
附图说明
图1是用qPCR方法检测EIAV的标准曲线；
图2是用qPCR方法检测EIAV的扩增曲线；
图3是用qPCR方法检测EIV-A的标准曲线；
图4是用qPCR方法检测EIV-A的扩增曲线；
图5是用qPCR方法检测EHV-1的标准曲线；
图6是用qPCR方法检测EHV-1的扩增曲线；
图7是EIAV质粒信息；
图8是EIV-A质粒信息。
图9是EHV-1质粒信息。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
本发明实施例中所用的实验材料：
PremScript RT Master mix和ROX生产厂家为TAKARA，无核酶水生产厂家为Invitrogen。
实施例1引物和探针的设计与合成
马传染性贫血病毒(EIAV)，马A型流感病毒(EIV-A)，马疱疹病毒I型(EHV-1)，需要在一个程序中同时完成扩增。然而这三个中既有DNA病毒又有RNA病毒。为了保证这个三个靶位能同时在一次扩增中完成，就必须要使用RNA的扩增程序，那么DNA靶位的引物也需要耐受42℃低温对引物非特异性扩增的影响。另外这个三个病毒中单个病毒不同株之间保守性差，即使是保守基因间，一致性也较低，序列一致的片段较短，需要用兼并引物来提高扩增的覆盖率。为了使3个靶位能同时扩增，需要在有限的引物探针设计区域中筛选得到扩增程序条件一致的引物探针。
根据马传染性贫血病毒(EIAV)(GeneBank登录号：AF327877.1、AF327878.1、MN560970.1、HM141923.1、HM141911.1、JX480632.1和MH580897.1)LTR和gag基因的比对序列结果；马A型流感病毒(EIV-A)
(GeneBank登录号：MK215822.1、MT664749.1、MT664747.1、ON652015.1、MG132047.1和KF806985.1)HA基因的比对序列结果；马疱疹病毒I型(EHV-1)(GeneBank登录号：KU557664.1、MN193768.1、KY201172.1、KY201168.1、KY201166.1和NC001491.2)ORF68基因的比对序列结果，然后选取保守的区域分别通过Primer Premier 5软件进行引物和探针设计，所有的引物和探针均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物和探针用无核酶水稀释到10μmol/L-1，于-20℃保存。
分别选择马传染性贫血病毒(EIAV)(AF327877.1)LTR和gag的序列(66-585bp)；马A型流感病毒(EIV-A)(MT664749.1)HA基因序列(346-1173bp)；马疱疹病毒I型(EHV-1)(KU557664.1)ORF68基因序列(1-613bp)，克隆构建到pMD19-T质粒载体上，从而获得质粒标准品pMD19-T-EIAV、pMD19-T-EIV-A和pMD19-T-EHV-1，该标准品由本实验室保存，标准质粒浓度用核酸浓度测定仪NanoDrop One测定。基因拷贝数(Y)计算公式如下：
Y(copies/μL)＝[质粒的浓度(ng/μL)×10-9/(质粒长度bp×660)]×6.02×1023。质粒长度见图7-9。
经测定，标准质粒的基因拷贝数分别为6.17×1011copies/μL(pMD19-T-EIAV)、5.58×1011copies/μL(pMD19-T-EIV-A)和6.12×1011copies/μL(pMD19-T-EHV-1)，分别将三种标准质粒稀释至2×108copies/μL，同时用TE缓冲液作为阴性对照。本发明人通过选择病毒复制相关基因设计多对探针引物，并且该基因序列为保守序列，最终筛选出结果最好的探针引物。
马传染性贫血病毒质粒信息(pMD19-T-EIAV)，EIAV标准品阳性模板，核苷酸序列如图7所示(苏州金唯智生物科技有限公司合成)；
探针引物为金唯智生物(苏州金唯智生物科技有限公司)合成：
上游引物EIAV：AGACCCTGCCYRCTGAACCTGGCTGAT，序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物EIAV：CTTCTCTARCTTCTTGAGCGCTTTGCTC，序列如SEQ ID NO：2所示，探针EIAV：FAM-AGTTCTCCTCTGCTGTCCTAGGGATCCTA-BHQ1，序列如SEQ ID NO：3所示，
马A型流感病毒(EIV-A)质粒信息(pMD19-T-EIV-A)，EIV-A标准品阳性模板，核苷酸序列如图8所示(苏州金唯智生物科技有限公司合成)；
探针引物为金唯智生物合成：
上游引物EIV-A：TTTCGACAARCTATACATCTGGG，序列如SEQ ID NO：4所示，
下游引物EIV-A：TGTTGAGACTGTTACTCGTCCTG，序列如SEQ ID NO：5所示，
探针EIV-A：FAM-TTTGTCTGCTCTTGATTTGAACTCGGGTGAT-BHQ1，序列如SEQ ID NO：6所示，
马疱疹病毒I型(EHV-1)质粒信息(pMD19-T-EHV-1)，EHV-1标准品阳性模板，核苷酸序列如图9所示(苏州金唯智生物科技有限公司合成)；
探针引物为金唯智生物合成：
上游引物EHV-1：CATCTCAACTCCAGCCTTATCATTAA，序列如SEQ ID NO：7所示，
下游引物EHV-1：CACTCACCCACTACGGTGTCTTCT，序列如SEQ ID NO：8所示，
探针EHV-1：FAM-AAACACCGGCTTGCACAAGTCTGCTGCCC-BHQ1，序列如SEQ ID NO：9所示。
实施例2一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测方法
1提取待测样品的DNA/RNA模板
病毒核酸提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒按照说明书提取加在293T细胞的病毒质粒。
2采用本发明所述的检测组合物建立荧光定量PCR反应体系；
用无核酶水将阳性质粒标准品(质粒信息见图7、图8和图9)稀释为2×107copies/μL(STD1)、2×106copies/μL(STD2)、2×105copies/μL(STD3)、2×104copies/μL(STD4)、2×103copies/μL(STD5)、2×102copies/μL(STD6)、2×101copies/μL(STD7)和2copies/μL(STD8)共8种不同浓度的标准品及阴性样本(NTC)。
EIAV、EIV-A和EHV-1荧光定量PCR反应体系
经过引物和探针浓度的摸索，确定荧光定量PCR的反应体系为20μL，荧光定量PCR检测组合物和阴性对照的混合液15μL和模板5μL(标准品，阴性对照和细胞样本)，三种反应体系的具体配比见表1、表2和表3。
表1
表2
| 组分 | 体积(μL) |
| 2×One Step RT-PCR BufferⅢ | 10 |
| Ex Taq HS | 0.4 |
| RT Enzyme MixⅡ | 0.4 |
| ROX | 0.4 |
| EIV-A探针(10μM) | 0.5 |
| EIV-A上游引物(10μM) | 0.4 |
| EIV-A下游引物(10μM) | 0.4 |
| 无核酶水 | 2.5 |
| 标准品/待测样本 | 5.0 |
| 总计 | 20.0 |
表3
| 组分 | 体积(μL) |
| 2×One Step RT-PCR BufferⅢ | 10 |
| Ex Taq HS | 0.4 |
| RT Enzyme MixⅡ | 0.4 |
| ROX | 0.4 |
| EHV-1探针(10μM) | 0.5 |
| EHV-1上游引物(10μM) | 0.4 |
| EHV-1下游引物(10μM) | 0.4 |
| 无核酶水 | 2.5 |
| 标准品/待测样本 | 5.0 |
| 总计 | 20.0 |
3进行荧光定量PCR检测；
使用ABI7500PCR仪，反应程序为：
第一步：42℃5min，1个循环；
第二步：95℃3min，1个循环
第三步：95℃5s，60℃34s，40个循环，在60℃时采集信号。
4待测样品的结果分析见表4、表5和表6。
表4
表5
表6
该检测方法每次实验的标准曲线相关系数(R2)应不低于0.990；扩增效率应在90％-110％之间。定量限(LOQ)的要求是CV≤20％，回收率在50-150％之间。检测限(LOD)的要求是对应浓度全检出。
检测结果见表4、表5和表6和图1-图6，根据表4-6和图1-图6可知，模板拷贝数在102～108范围内时，所建立的荧光定量PCR检测方法可以获得良好的扩增动力学曲线，EIAV-1的相关系数R2＝0.999，扩增效率为91.20％(图1)，EIV-A的相关系数R2＝0.999，扩增效率为101.40％(图3)，EHV-1的相关系数R2＝0.999，扩增效率为99.74％(图5)，并且在293-T细胞基因组和靶位间的交叉扩增(不含引物对应的质粒)中都不会发生非特异性扩增，在293-T中加入目标基因能特异性检出EIAV、EIV-A和EHV-1基因，说明引物能特异性扩增目标靶位，对其它基因组不会发生非特异性扩增。
实施例3一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测试剂盒
用实施例2中配制的每个病毒的8个标准品和阴性样本(NTC)分别进行荧光定量PCR检测，检测结果见表7。
EIAV荧光定量PCR反应体系(见表1)
经过引物和探针浓度的摸索，确定荧光定量PCR的反应体系为20μL，荧光定量PCR检测组合物和阴性对照的混合液15μL和5μL的模板(标准品，阴性对照和病毒基因组)；混合液中荧光定量PCR反应预混液、荧光定量PCR检测EIAV探针引物组合物、余量为无核酶水。
EIV-A荧光定量PCR反应体系(见表2)
经过引物和探针浓度的摸索，确定荧光定量PCR的反应体系为20μL，荧光定量PCR检测组合物和阴性对照的混合液15μL和5μL的模板(标准品，阴性对照和病毒基因组)；混合液中荧光定量PCR反应预混液、荧光定量PCR检测EIV-A探针引物组合物、余量为无核酶水。
EHV-1荧光定量PCR反应体系(见表3)
经过引物和探针浓度的摸索，确定荧光定量PCR的反应体系为20μL，荧光定量PCR检测组合物和阴性对照的混合液15μL和5μL的模板(标准品，阴性对照和病毒基因组)；混合液中荧光定量PCR反应预混液、荧光定量PCR检测EHV-1探针引物组合物、余量为无核酶水。
表7
该检测方法每次实验的标准曲线相关系数(R2)应不低于0.990；扩增效率应在90％-110％之间。2copies/ul的检测限必须检出。
检测结果如表7所示，可知模板拷贝数在102～108范围内时，所建立的荧光定量PCR检测方法可以获得良好的扩增动力学曲线，EIAV的相关系数R2＝0.999，扩增效率为90.41％，EIV-A的相关系数R2＝0.99，扩增效率为102.59％，EHV-1的相关系数R2＝1，扩增效率为99.42％。EIAV、EIV-A和EHV-1的检测限2copies/ul都能检测出来，NTC都未检出。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测组合物、检测方法及试剂盒进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于检测生物制品中马病毒的荧光定量PCR检测组合物，其特征在于：所述马病毒包括马传染性贫血病毒、马A型流感病毒和马疱疹病毒I型，该荧光定量PCR检测组合物包括以下引物和探针：
上游引物EIAV：AGACCCTGCCYRCTGAACCTGGCTGAT，SEQ ID NO：1，
下游引物EIAV：CTTCTCTARCTTCTTGAGCGCTTTGCTC，SEQ ID NO：2，
探针EIAV：FAM-AGTTCTCCTCTGCTGTCCTAGGGATCCTA-BHQ1，SEQ ID
NO：3，
上游引物EIV-A：TTTCGACAARCTATACATCTGGG，SEQ ID NO：4，
下游引物EIV-A：TGTTGAGACTGTTACTCGTCCTG，SEQ ID NO：5，
探针EIV-A：FAM-TTTGTCTGCTCTTGATTTGAACTCGGGTGAT-BHQ1，SEQ ID NO：6，
上游引物EHV-1：CATCTCAACTCCAGCCTTATCATTAA，SEQ ID NO：7，
下游引物EHV-1：CACTCACCCACTACGGTGTCTTCT，SEQ ID NO：8，
探针EHV-1：FAM-AAACACCGGCTTGCACAAGTCTGCTGCCC-BHQ1，SEQ ID NO：9。
2.一种马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的荧光定量PCR检测组合物。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含阳性对照品、阴性对照品及荧光定量PCR反应试剂。
4.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成是：
荧光定量PCR反应预混液，组成是2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，Ex Taq HS 0.4μL，RT Enzyme MixⅡ0.4μL和ROX 0.4μL；
权利要求1所述的荧光定量PCR检测组合物，终浓度的上游引物各0.20μM，下游引物各0.20μM和探针各0.25μM；
EIAV、EIV-A和EHV-I的阳性对照品，浓度均为2×108copies/μL；
阴性对照，为无核酶水。
5.一种非诊断或治疗目的的马传染性贫血病毒、马A型流感病毒、马疱疹病毒I型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA/RNA模板；
(2)采用权利要求1所述的检测组合物建立荧光定量PCR反应体系；
(3)进行荧光定量PCR检测；
(4)待测样品的结果分析。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：荧光定量PCR反应体系为20μL，包含荧光定量PCR反应预混液、权利要求1所述的荧光定量PCR检测组合物和阴性对照的混合液15μL和模板5μL；所述模板为待测样品的核酸、阳性对照标准品或阴性对照标准品。
7.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测方法，其特征在于DNA和RNA靶位用相同的试剂和程序一起检测：步骤(3)所述荧光定量PCR检测的反应条件是：
42℃反转录，5min，1个循环；95℃预变性3min，1个循环；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。
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