CN111518959A

CN111518959A - 新型冠状病毒的数字pcr检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111518959A
Application number: CN202010504396.9A
Authority: CN
Inventors: 梁文; 杨雪; 杨镇州; 许丽; 刘刚; 闻艳丽; 李兰英; 丁敏; 樊春海; 左小磊; 孙洁林; 王丽华
Original assignee: Shanghai Jiaotong University; Shanghai Advanced Research Institute of CAS; Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology
Current assignee: Shanghai Jiaotong University; Shanghai Advanced Research Institute of CAS; Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明提供了新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒，具体地本发明针对新型冠状病毒ORF1ab基因和E基因设计了双重数字PCR检测体系，实验结果表明本发明的双重数字PCR检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

Description

新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的一种急性传染性疾病。SARS-CoV-2是属单股正链RNA病毒，巢病毒目，冠状病毒科，其基因组全长约29kb。

实时荧光反转录PCR(RT-PCR)可以对SARS-CoV-2的病毒RNA进行快速检测，由于此方法快速、灵敏、高效、特异性强、易于普及推广，该方法成为此次疫情防控中的首推确诊检测方法。国家卫生健康委员会印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，将RT-PCR检测新冠病毒核酸阳性为疑似病例确诊的病原学证据之一。

准确可靠的检验技术是疫情防控的关键支撑。然而，近期的新冠病毒核酸检测出现了阳性率低、检测结果与临床表现不吻合等问题。据推测，病原学因素、样本因素、人员因素、仪器设备因素、试剂因素等都有可能影响检测而造成假阴性结果。

因此，为了更有效地应对新冠疫情，本领域迫切需要开发灵敏度、准确性更高的新型冠状病毒检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQID NO.:5所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.3所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。

在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1-6所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR反应预混液。优选地，所述PCR反应预混液包含选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、M-MLV逆转录酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。

本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：

其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述dPCR反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和引物探针混合液，所述引物探针混合液包含SEQ ID NO：1-6所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为ORF1ab基因的一维扩增图。

图2为E基因的一维扩增图。

图3为双重扩增的二维扩增图。

图4E基因对照组1和ORF1ab引物探针组的扩增图(一维图和二维图)。

图5E基因对照组2和ORF1ab引物探针组的扩增图(一维图和二维图)。

图6ORF1ab基因对照组1和E基因引物探针组的二维扩增图。

图7ORF1ab基因对照组2和E基因引物探针组的二维扩增图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，针对新型冠状病毒ORF1ab基因和E设计了双重数字PCR检测体系，实验结果表明本发明的双重数字PCR检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

具体地，本发明双重数字PCR检测体系目标基因范围涵盖已公布的COVID-19病毒检测的2个主要靶标基因：包膜蛋白E基因全长(基因组坐标：26245-26472，GenBank：MT027064.1)、开放阅读框1ab(ORF1ab)基因片段(基因组坐标：266-21555，GenBank：MT027064.1)，灵敏度可达到1.2copies/μL，具有极高的灵敏度。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

数字PCR(digital PCR，dPCR)

dPCR能实现核酸分子的绝对定量，在检测基因突变时具有较高的灵敏度和特异性。其通过物理或化学分割的方式，将一个荧光PCR反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。

利用数字PCR技术针对新型冠状病毒进行检测，具有较高的灵敏度，非常有利于疫情防控。

但是，由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

试剂盒及检测方法

采用合成的DNA为模板，将DNA稀释至5000copies/uL(添加鲑鱼精DNA20g/mL做为保护剂)分装100管作为方法研究。使用不同的引物、探针进行筛选优化(E基因20组，ORF1ab基因20组)。

最终筛选出的最佳的E基因、ORF1ab基因双重检测引物、探针如下：

ORF1ab-F：GCTGGCACAGACTTAGAAGGTAACT(SEQ ID NO.:1)

ORF1ab-R：GCAGCGTACAACCAAGCTAAAAC(SEQ ID NO.:2)

ORF1ab-P：FAM-TTGACAGGCAAACAGCACAAGCAGC-BHQ1(SEQ ID NO.:3)

E-F：GTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAAT(SEQ ID NO.:4)

E-R：TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA(SEQ ID NO.:5)

E-P：VIC-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ1(SEQ ID NO.:6)

优化引物探针浓度：

设置不同的引物浓度(200nM,400nM，600nM)，探针浓度(100nM，200nM,400nM)，每个重复3次进行检测。

结果表明：ORF1ab基因最优引物浓度为400nM，最优探针浓度为200nM；E基因最优引物浓度为400nM，最优探针浓度为200nM探针。

PCR程序中退火温度优化

采用梯度PCR，温度(52-60℃)，每个设置3个重复。从扩增图看，阴阳性区分明显，较少有雨滴现象。扩增结果拷贝数较高，RSD较小。最后选择54℃为退火温度。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒，具有极高的灵敏度；

(2)本发明提供的新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒为多重检测体系，能够在一定程度上避免因病毒突变导致的假阴性，进一步增加了临床检测的准确性。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

试剂及仪器

二硫苏糖醇DTT(Sigma)；RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor，东洋纺)；无核酸酶水(Thermofisher)；一步法数字PCR预混液(One-step RT-ddPCR Advanced kit for Probes，Bio-rad)；新型冠状病毒核酸提取试剂盒(购自天根生物科技公司)；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

实时荧光定量PCR仪(Life technologies公司)；微量核酸蛋白定量仪Nanodrop2000(Life technologies公司)；微滴数字PCR仪(QX200，bio-rad公司)。GBW(E)091111新型冠状病毒体外转录RNA标准物质(可获自上海市计量测试技术研究院)。GBW(E)091098新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质(中国计量科学研究院)

实验方法

(1)模板样品稀释

a.实验前将新型冠状病毒体外转录RNA标准物质在振荡器振荡30s，3000g离心10s。

低浓度的RNA标准物质可使用GBW(E)091111进行稀释，然后振荡30s，3000g离心10s，可得相应浓度的样品。

(2)引物/探针

采用双重数字PCR反应体系。在配制反应体系前，把引物/探针(见表1)混合液放至室温5min，涡旋10s，然后3000g离心10s。

表1 RNA标准物质dPCR定值的引物探针序列

(3)数字PCR反应体系配制

微滴数字PCR反应体系按照表2进行配制。扩增条件按照表3

表2数字PCR反应体系

表3数字PCR反应参数

结果分析

将RNA标准物质采用本案中的一步法dPCR法进行定值。dPCR定量RNA拷贝数的技术原理是将RNA样品的逆转录和PCR扩增整合到一个体系中，通过将原始RT-PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增并后续检测，最后通过阳性反应孔的统计和泊松分布原理，计算出模板RNA的拷贝数浓度。为了使dPCR反应中RNA分子的分布符合泊松分布，将模板RNA的靶基因拷贝数浓度稀释至(200-2000)copies/μL，能得到更好的精密度。dPCR的扩增图见图1至图3，从图中可以看出，数字PCR中阳性反应孔的荧光信号和阴性反应的荧光信号信噪比大，区分明显。方法的定量重复性好，RSD小于3％(n＝8)。

图1为ORF1ab基因的一维扩增图。

图2为E基因的一维扩增图。

图3为双重扩增的二维扩增图。

使用该方法，采用4家实验室协同定值，汇总全部原始数据后经统计检验确认各组数据无离群值、各组数据等精度、每组数据的平均值之间不存在显著性差异。

表4 RNA标准物质检测结果

试剂盒的检出限考察

将GBW(E)091111国家标准物质稀释100000倍，ORF1ab的浓度为1.2copies/μL，E基因的拷贝数浓度为2.0copies/μL。重复检测20次，检测结果的RSD小于5％，该方法的定量限可达到1.2copies/μL。

新型冠状病毒基因组样本检测

重复检测10次新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质核酸样本和10例健康人咽拭子核酸样本，按照上述数字PCR反应体系和反应参数进行检测。

检测结果如下：

在所检测的20例临床样本中，检出10例新型冠状病毒核酸阳性样本和10例阴性样本。结果表明本发明试剂盒检测准确率达到了100％，进一步证明了本发明试剂盒检测的准确性。

对比例1

由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的性能要求很高，引物和探针组合的设计难度较大。在试剂盒开发过程中，本发明人针对新型冠状病毒E基因和ORF基因设计并筛选了大量PCR引物和探针，并进行了效果测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。

例举部分典型引物和探针序列如下：

E基因对照引物对和探针组1：

上游引物：CTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCT(SEQ ID NO.:7)

下游引物：TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA(SEQ ID NO.:8)

探针：CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG(SEQ ID NO.:9)

E基因对照引物对和探针组2：

上游引物：ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT(SEQ ID NO.:10)

下游引物：ATATTGCAGCAGTACGCACACA(SEQ ID NO.:11)

探针：ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG(SEQ ID NO.:12)

ORF基因对照引物对和探针组1：

上游引物：GGACCTTTTGTTGACAGGCAAA(SEQ ID NO.:13)

下游引物：GCAGCGTACAACCAAGCTAAAAC(SEQ ID NO.:14)

探针：AGCACAAGCAGCTGGTACGGACACAAC(SEQ ID NO.:15)

ORF基因对照引物对和探针组2：

上游引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO.:16)

下游引物：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO.:17)

探针：CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(SEQ ID NO.:18)

分别将上述E基因对照引物对和探针组1、E基因对照引物对和探针组2和本发明的靶向ORF基因的引物探针组成双重检测体系进行数字PCR检测，检测步骤、检测条件同上。结果表明，在该双重检测体系中，使用E基因对照引物对和探针组1的检测体系，无法检测出E基因；使用E基因对照引物对和探针组2的检测体系，针对ORF基因的灵敏度显著降低，检出限降低到了1.2×10³copies/μL。如图4，使用E基因对照引物对和探针组1的检测体系进行检出限验证，ORF1ab基因为260ng/uL，E基因未检出。使用E基因对照引物对和探针组2的检测体系进行检出限验证，见图5。针对ORF基因的灵敏度显著降低，检出限降低到了1.2×10³copies/μL。从图5可以看出即使高浓度的样品检测，阳性峰图出现了双峰线性，说明扩增效率不高导致部分样品扩增不充分。

分别将上述ORF基因对照引物对和探针组1、ORF基因对照引物对和探针组2和本发明的靶向E基因的引物探针组成双重检测体系进行数字PCR检测，检测步骤、检测条件同上。结果表明，在该双重检测体系中，使用ORF基因对照引物对和探针组1的检测体系，针对ORF基因的灵敏度仅有1.2×10²copies/μL，针对E基因的灵敏度仅有2×10²copies/μL，扩增图见图6；使用ORF基因对照引物对和探针组2的检测体系，针对ORF基因的灵敏度仅有1.2×10²copies/μL，针对E基因的灵敏度仅有2×10³copies/μL，扩增图见图7。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计量测试技术研究院

上海交通大学

中国科学院上海高等研究院

<120> 新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒

<130> 050002

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gctggcacag acttagaagg taact 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gcagcgtaca accaagctaa aac 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ttgacaggca aacagcacaa gcagc 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gtttcggaag agacaggtac gttaat 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tacaagactc acgttaacaa tattgca 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtg 29

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ctttttcttg ctttcgtggt attct 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tacaagactc acgttaacaa tattgca 27

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtg 29

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ggaccttttg ttgacaggca aa 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gcagcgtaca accaagctaa aac 23

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

agcacaagca gctggtacgg acacaac 27

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒核酸的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：

2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：

第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物。

3.一种检测新型冠状病毒核酸的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQ ID NO.3所示的第一探针。

4.如权利要求3所述的探针集，其特征在于，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。

5.如权利要求4所述的探针集，其特征在于，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团；

所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

并且，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。

6.一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1-6所示的多核苷酸序列。

9.一种检测新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：

其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求3所述的探针集。

10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求3所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒核酸。