CN110241255B - 一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒 - Google Patents

一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于HBV miR‑3的荧光定量PCR检测材料及试剂盒，其中荧光定量PCR检测材料包括6组逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针。提供的6组荧光定量PCR检测材料具有非常显著的特异性，直接使用SYBR Green染料，其阴性对照也基本不存在非特异干扰；结合TaqMan MGB探针后，阴性对照的非特异干扰完全消除，定量范围上，覆盖7个数量级，从108至102，决定系数R2为0.997，说明在定量方面覆盖范围广，定量效果好，在样品HBV miR‑3浓度较低时也能准确定量。相比较现有技术而言，本发明的定量效果更好，结果更为可信。

Description

一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒。
背景技术
miRNA作为一类重要的调节基因表达的内源性分子，已有大量的研究表明其具有疾病诊断，发展及预后判断的重要价值。比如在癌症领域，有大型队列研究验证了血清中组合miRNA检测可筛查早期肺癌；也有研究验证了血清中两种miRNA可作为前列腺癌患者手术治疗情况的评价因子。在传染病领域，研究发现病毒可编码miRNA，与肿瘤的发生有关，且病毒的miRNA可在患者血清中检测到，与炎症生物标志物相关。表明了病毒编码的miRNA在传染病领域具有潜在的疾病评价意义。
乙型肝炎的发生是由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致，中国的慢性感染率为5％-8％。在HBV的miRNA领域的研究中，2007年首次通过了生物信息学的分析发现了HBV可能编码miRNA，但并未得到验证。直到2017年，Yang等人验证了HBV可编码miRNA，确定了其序列并将其命名为HBV miR-3，且通过生物学实验验证其存在。因此，这是第一篇公开发表HBV miR-3的文献。该文献采用了Chen等人在2005年发表的茎环法RT-PCR(Stem-loop RT-PCR)的方法对HBV-miR-3进行检测，但Yang等人并未使用特异性荧光探针，因此该检测方法的特异性仍有待提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种用于HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种用于检测HBV miR-3的SYBR Green荧光定量试剂盒。
本发明要解决的还一技术问题是提供上述试剂盒的使用方法。
本发明要解决的还一技术问题是提供一种用于检测HBV miR-3的TaqMan荧光定量试剂盒。
本发明要解决的还一技术问题是提供上述试剂盒的使用方法。
本发明所采取的技术方案是：
提供一种用于HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料，包括以下A～F共6组逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物，
A：逆转录引物序列为：
CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA(SEQ ID NO.1)；
qPCR前引物序列为：
TGTGCCCGCTGGATGTGTC(SEQ ID NO.2)；
qPCR后引物序列为：
CGCGAGCACAGAATTAATACG(SEQ ID NO.3)；
B：逆转录引物序列为：
CCCATCCCACACACAGCCTGCGAGACTGAGGGATGGGAAACGCCG(SEQ ID NO.5)；
qPCR前引物序列为：
CCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.6)；
qPCR后引物序列为：
CTGCGAGACTGAGGGA(SEQ ID NO.7)；
C：逆转录引物序列为：
CGCCATTACCCAGGCATACGATGACCAGGCGAAACGCCG(SEQ ID NO.9)；
qPCR前引物序列为：
CGTCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.10)；
qPCR后引物序列为：
CCATTACCCAGGCATACGATGACCA(SEQ ID NO.11)；
D：逆转录引物序列为：
CTTCGTAATCGCTGCTATTACCCAGGCATACGATGACCAAGCAGCGATTACGAAGAAACGCCG(SEQID NO.13)；
qPCR前引物序列为：
TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.14)；
qPCR后引物序列为：
TATTACCCAGGCATACGATGACCAA(SEQ ID NO.15)；
E：逆转录引物序列为：
GCGTGGTCCACACCAGTTGACGGGCGACGACCACGCAAACGCCG(SEQ ID NO.17)；
qPCR前引物序列为：
TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.18)；
qPCR后引物序列为：
CCACACCAGTTGACGGGC(SEQ ID NO.19)；
F：逆转录引物序列为：
CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAAACGCCG(SEQ ID NO.21)；
qPCR前引物序列为：
TGCCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.22)；
qPCR后引物序列为：
GGCTGTCGTGGACTGCG(SEQ ID NO.23)。
进一步地，所述检测材料对应的还包括A～F共6条特异性荧光探针，
A：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-CTCACTATACGCGAAACG-淬灭基团(SEQ ID NO.4)；
B：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-AGGGATGGGAAACGCCG-淬灭基团(SEQ ID NO.8)；
C：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-CGAAACGCCGCA-淬灭基团(SEQ ID NO.12)；
D：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-AGCGATTACGAAGAAACGCC-淬灭基团(SEQ ID NO.16)；
E：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-ACGACCACGCAAACGCCG-淬灭基团(SEQ ID NO.20)；
F：特异性荧光探针序列为：
荧光基团-CTGCCGCTGAGAAACGCCG-淬灭基团(SEQ ID NO.24)。
优选地，所述特异性荧光探针的荧光基团为羧基荧光素FAM；所述淬灭基团为MGB。
提供一种用于检测HBV miR-3的荧光定量试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及上述逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物。
进一步地，所述逆转录试剂包括缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为SYBR Green荧光定量染料体系。
提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S01.从待测样品中提取总RNA或富集小分子RNA；
S02.将待测样品中提取的RNA逆转录合成cDNA；
S03.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、SYBR Green荧光定量染料及其缓冲体系，进行荧光定量PCR检测。
提供一种用于检测HBV miR-3的荧光定量试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及如上述的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针。
进一步地，所述逆转录试剂包括缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为TaqMan荧光定量PCR体系。
优选地，所述特异性荧光探针为TaqMan MGB探针。
上述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S11.从样本中提取总RNA或富集小分子RNA；
S12.将样本中提取的RNA逆转录合成cDNA；
S13.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针、TaqManqPCR酶及其缓冲体系进行荧光定量PCR检测。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的6组荧光定量PCR检测材料具有非常显著的特异性，直接使用SYBRGreen染料，其阴性对照也基本不存在非特异干扰。
2.本发明提供的6组荧光定量PCR检测材料，结合TaqMan MGB探针后，阴性对照的非特异干扰完全消除，定量范围上，本发明在加入TaqMan探针后，定量范围覆盖7个数量级，从108至102，决定系数R2为0.997，表明本发明在定量方面覆盖范围广，定量效果好，在样品HBV miR-3浓度较低时也能准确定量。相比较现有技术而言，本发明的定量效果更好，结果更为可信。
附图说明
图1本发明引物组(未使用引物组中的特异荧光探针)与现有文献中引物组的SYBRGreen染料荧光PCR扩增曲线图。
图2本发明引物组(未使用引物组中的特异荧光探针)与现有文献中引物组的SYBRGreen染料荧光PCR定量标准曲线图。
图3本发明引物组(使用引物组中的特异荧光探针)TaqMan MGB探针荧光定量PCR扩增曲线图与定量标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。
针对现有检测HBV miR-3的引物和方法中存在的问题，我们通过研究HBV miR-3的序列特征，经过大量实验，对引物序列以及特异性探针序列进行不断改进与人工优化，最终得到了本发明中HBV miR-3荧光定量PCR检测的引物与特异性荧光探针，经过检验，新设计的引物与现有技术中的引物相比，具有更好的特异性，将新设计的引物与特异性荧光探针一起应用于HBV miR-3荧光定量PCR检测可以使特异性进一步优化，检测准确度也进一步提高。本发明创造性地筛选出了6组用于HBV miR-3的荧光定量PCR检测材料，包括6套逆转录引物，qPCR前引物，qPCR后引物和TaqMan MGB探针的组合。
表1 HBV miR-3荧光定量PCR检测材料的序列表
实施例1
使用本发明的引物组合中的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物，和现有技术——Yang发表文献中提供的引物，用SYBR Green染料进行qPCR，从而对两者的特异性进行比较，具体的实施方案如下：
Yang发表文献中使用的引物组合，其中，
逆转录引物序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAACGCCG(SEQ IDNO.25)；
qPCR前引物序列：TGCGGCTGGATGTGTCTGCGG(SEQ ID NO.26)。
S01.从待测样品中提取总RNA或富集小分子RNA；
实验样品：人工合成的HBV miR-3序列RNA(浓度为6.02×1012copies/μL)标准品溶液，10倍梯度稀释，稀释至实验样品浓度分别为6.02×105、6.02×104、6.02×103、6.02×102copies/μL，一共4个样品，分别记为E5、E4、E3、E2；
逆转录时在加入一个阴性对照，简称NTC(no template control)：以无菌水为阴性对照样品。
S02.将待测样品中提取的RNA逆转录合成cDNA；
(1)根据逆转录试剂盒( MicroRNA Reverse Transcription Kit)说明书要求，先配制逆转录预混液，逆转录引物为另外合成，试剂及其添加量如下表2所示：
表2逆转录反应体系
(2)每个PCR管中加入5μL体积样品，和10μL体积(1)步中配制的逆转录预混液，短暂离心后，按照说明书程序进行逆转录，程序为：冰上孵育5min；16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min；4℃保存。
S03.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、SYBR Green荧光定量染料及其缓冲体系，进行荧光定量PCR检测。
本步骤加入一个以无菌水为空白对照，即无经过逆转录，直接以无菌水为模板，加入qPCR预混液进行扩增(简称为H2O)。因此加上逆转录的5个样品一共有6个样品进行qPCR，且每个样品做两个技术重复。
(1)根据SYBR Green法试剂盒(SsoAdvancedTMuniversal Green)说明书要求，配制qPCR预混液，其中qPCR前引物、qPCR后引物为另外合成，试剂及其添加量如下表3所示：
表3 SYBR Green荧光定量PCR反应体系
(2)每个qPCR孔中加入2μL体积样品，和18μL体积qPCR预混液，短暂离心后，按照说明书程序进行qPCR扩增，程序为：Fast模式，95℃，30sec；40个循环(95℃，10sec+60℃，10sec)，熔解曲线程序：95℃，15sec；60℃，60sec；60℃至95℃，每升高0.3℃检测一次荧光。
实验结果见附图1和2。从图中可以看出：
(1)采用本发明提供的引物组阴性对照基本无非特异扩增干扰。
附图1A图为本发明引物组的结果，B图为文献引物组的结果，本发明引物组的阴性对照NTC和空白对照基本没有扩增，梯度标准品的扩增可明显区分开。文献引物组的结果则显示NTC和H2O有明显的扩增，且与E2标准品样品扩增曲线十分接近，难以区分。从C图的熔解曲线可更加明显看出，文献引物组的NTC的扩增产物与标准品扩增产物熔解温度十分接近，难以确认阳性结果的真实性，而本发明提供的引物组不存在这个问题。
(2)本发明引物组定量更为准确，且可比文献组定量低一个数量级。
如附图2所示，本发明引物组在本实施例中可使用所有标准品样品建立标准曲线进行定量，定量范围达4个数量级，可文献组引物的阴性对照NTC与E2样品扩增曲线十分接近，因此绘制定量曲线时不纳入E2样品的结果。再者从附图2中绘制的标准曲线的决定系数R2来看，本发明提供的引物组为0.999，高于文献组引物0.994，说明定量结果更为准确。
实施例2
使用本发明的引物组合中的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物，特异性荧光探针，采用TaqMan MGB荧光探针检测方法进行qPCR，从而对设计的特异性荧光探针的特异性进行验证，具体的实施方案如下：
S11.从样本中提取总RNA或富集小分子RNA；
实验样品：人工合成的HBV miR-3序列RNA(浓度为6.02×1012copies/μL)标准品溶液，10倍梯度稀释，稀释至实验样品浓度分别为6.02×108、6.02×107、6.02×106、6.02×105、6.02×104、6.02×103、6.02×102、6.02×101copies/μL，一共8个样品，分别简写为E8、E7、E6、E5、E4、E3、E2，E1，
逆转录时再加入一个阴性对照，简称NTC(no template control)；以无菌水为样品，因此逆转录时一共为9个样品。
S12.将样本中提取的RNA逆转录合成cDNA；
(1)根据逆转录试剂盒( MicroRNA Reverse Transcription Kit)说明书要求，先配制逆转录预混液，逆转录引物为另外合成，试剂及其添加量如下表4所示：
表4.逆转录反应体系
(2)每个PCR管中加入5μL体积样品，和10μL体积(1)步中配制的逆转录预混液，短暂离心后，按照说明书程序进行逆转录，程序为：冰上孵育5min；16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min；4℃保存。
S13.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针、TaqManqPCR酶及其缓冲体系进行荧光定量PCR检测。
本步骤加入一个以无菌水为对照的样品，即无经过逆转录，直接以无菌水为模板的空白对照。因此加上逆转录的9个样品一共有10个样品进行qPCR，每个样品做两个技术重复。
(2)根据试剂盒( Universal Master Mix II)说明书要求，配制qPCR预混液，其中qPCR前引物、qPCR后引物、TaqMan MGB探针为另外合成，试剂及其添加量如下表5所示：
表5 TaqMan探针荧光定量PCR反应体系
(2)每个qPCR孔中加入2μL体积样品，和18μL体积qPCR预混液，短暂离心后，按照说明书程序进行qPCR扩增，程序为：95℃，10min；40个循环(95℃，15sec+60℃，1min)。
结果如附图3所示，从结果中可以说明：
(1)本发明提供的引物组能特异性检测HBV miR-3。
如附图3A图所示，阴性对照NTC、H2O完全没有非特异扩增出现，能够特异性检测能够特异性检测到浓度数量级为102的样品。
(2)本发明定量范围达7个数量级，且定量效果好。
如附图3B图定量标准曲线所示，用浓度梯度标准品绘制标定量准曲线，覆盖范围可达7个数量级(108-102)，且决定系数为0.997，定量准确性高。
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<213> 人工序列
<400> 26
tgcggctgga tgtgtctgcg g 21

Claims (2)

1.一种用于检测HBVmiR-3的荧光定量试剂盒，其特征在于，包括逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物；其中，
所述逆转录引物序列为：
CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA；
所述qPCR前引物序列为：
TGTGCCCGCTGGATGTGTC；
所述qPCR后引物序列为：
CGCGAGCACAGAATTAATACG；
所述荧光定量试剂盒还包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂；
所述逆转录试剂包括缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；所述荧光定量PCR试剂为SYBR Green荧光定量染料及其缓冲体系；
所述荧光定量试剂盒的使用方法包括以下步骤：
S01.从待测样品中提取总RNA或富集小分子RNA；
S02.利用所述逆转录引物将待测样品中提取的RNA逆转录合成cDNA；
S03.以所述cDNA为模板，加入所述qPCR前引物、所述qPCR后引物和所述SYBR Green荧光定量染料及其缓冲体系，进行荧光定量PCR检测；
所述逆转录的反应程序为：冰上孵育5min；16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min；4℃保存；
所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃，30sec；95℃，10sec，60℃，10sec，40个循环；其中熔解曲线程序：95℃，15sec；60℃，60sec；60℃至95℃，每升高0.3℃检测一次荧光。
2.一种非疾病诊断目的的HBVmiR-3荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01.从待测样品中提取总RNA或富集小分子RNA；
S02.以所述总RNA或富集小分子RNA作为模板，使用如权利要求1所述的荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR检测。
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