CN102140509B - 一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当目的片段被固相载体上的探针识别后，能够进行核酸序列的合成延长，使得被生物素标记的扩增片段固定在检测阵列上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。

Description

一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及基因序列特定位点的检测，特别涉及一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法。

背景技术

基因突变是指基因组DNA分子也就是脱氧核糖核酸序列产生了碱基对组成或者排列顺序的改变，包括碱基替换、缺失、插入、重复等。基因突变不仅仅是遗传病产生的原因，同时也是癌症发生、细菌病毒耐药性产生等的重要原因。而单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，也是基因突变在各物种的遗传累积。以SNP为主的遗传突变检测不仅仅对临床某些疾病的早期快速诊断，同时对于避免药物耐药性产生、指导合理用药、预警疾病发生具有重要的导向意义。

目前检测基因突变的方法有很多。金标准仍然是基因测序的方法，同时还有焦磷酸测序、核酸杂交、等位基因特异性扩增、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、多聚酶链限制性多态性长度分析(PCR-RFLP)、多聚酶链单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、反向斑点杂交法等许多针对已知或者位置的单核苷酸突变检测。虽然这些方法能够检测到基因突变，但是均面临的问题就是除引物、探针设计复杂外，同时需要具备昂贵的荧光检测用仪器，即使是金标准---基因测序的方法最直接有效，但周期过长。另外目前最容易推广的反向斑点杂交方法及延伸出来的技术一样面临杂交环境严格、准确率低、反应时间长、肉眼难以判读等问题。这些方法对于医疗系统和早期科研开发均难以普及应用。

基因芯片是近年出现的快速、高通量的检测工具，它是结合测序原理，通过在固相载体上固定具有针对性的核酸探针或蛋白质，对被检测组分进行杂交结合，最后引入发光信号(如荧光、生物素、放射性同位素)进行分析检测，从而达到样品分析的目的。但是，目前的核酸杂交芯片配备设备复杂、昂贵，同时假阴性、假阳性率也同时存在，尤其对于核酸分子的基因芯片，其质量控制更加难以掌握。

固相PCR技术是利用PCR原理，在固相载体上如毛细管、硅胶片、磁珠、玻璃片上等固定修饰的特异性引物进行PCR反应，其特点是反应简单，准确性高。但就实际操作而言，对于引物修饰及固定需要较为复杂的化学处理，如在硅胶片或毛细管上不仅需要对载体表面处理，同时需要对探针或引物进行修饰，以及同固相载体的配套的PCR仪器并不能推广应用，这样不仅使得制作程序复杂，同时引起实验重复性降低，导致常规固相PCR只能在实验室环境下完成科研工作。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，以检测基因序列特定位点的多态性，而且肉眼就可直接判断检测结果。

本发明是通过以下技术方案来实现：

1)针对目的基因的待测区域设计并合成PCR扩增引物对，在扩增引物的5`端增加生物素标记；提取包含目的基因的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以生物素标记的扩增引物对进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)针对目的基因待测区域的突变多态性，设计并合成多个长度为15～25nt的检测探针，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后；并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

3)对固相载体的表面进行修饰后，将检测探针和对照探针呈矩阵分布的固定在固相载体上，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列；

4)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于包含DNA聚合酶和反应底物的PCR反应液中，然后再加入检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

5)固相核酸扩增完成后，取出检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用含亲和素-碱性磷酸酶的反应液覆盖检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH2O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH2O终止反应；

6)显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域相匹配，未显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域不相匹配；根据设计的检测探针及其阵列上的检测位点设计情况，对待测区域的突变多态性进行判读。

所述的以基因组DNA为模板的PCR扩增，扩增循环数为25～40，所扩增的片段长度不超过1000bp。

所述的检测探针包括多个针对检测突变多态性的位点，同一阵列上分布的探针的Tm值相差不超过2℃。

所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在检测探针5`端进行polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6～15C序列的延长修饰；

所述的固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，检测探针5`端的辅助固定修饰为在检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

所述的固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，检测探针5`端的辅助固定修饰为在检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

所述的固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜，将硝酸纤维素膜或尼龙膜在SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃条件下干燥，然后再将检测探针和对照探针均匀喷涂在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经50～80℃干燥30～120min，紫外光照1～10min后，得到固定有检测探针和对照探针的硝酸纤维素或尼龙膜的检测阵列。

所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记。

所述的检测阵列在使用前还在体积浓度为2％～5％的BSA中37℃封闭至少15min。

所述的变性处理为热变性处理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

或者，所述的变性处理为碱变性处理：将质量浓度10％的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1∶10～20的体积比混合，放置至少3min。

所述的进行固相核酸扩增反应，其反应体系为40～200μl，包括变性处理后的PCR扩增产物，含DNA聚合酶、反应底物和Mg²⁺的PCR反应液，以及ddH₂O；加入的检测阵列浸没于反应体系内。

所述的固相核酸扩增反应完成后，取出检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；然后将检测阵列覆盖亲和素反应液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；取出检测阵列用ddH₂O冲洗，最后覆盖显色液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；

所述的洗脱液A的组成为100mmol/L pH＝7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；洗脱液B的组成为100mmol/L pH＝9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；

所述的亲和素反应液组成为1mL ddH₂O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT合3.5μl BCIP。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，是将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当扩增的片段被检测探针识别后，能够进行序列的延长(固相核酸扩增)，使得被生物素标记的扩增片段固定在膜阵列上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过检测探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，通过一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。

该方法是以基因芯片为基础、PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、并且易于推广的检测方法，通过在以硝酸纤维素膜为代表的固相介质上进行特异性探针引发的核酸扩增反应，结合反向斑点杂交技术，将携带生物素标记的靶序列与膜阵列上探针结合后，通过生物素-亲和素-碱性磷酸酶-BCIP/NBT反应，可以观察到明显蓝紫色斑点，从而进行肉眼判读。

2、本发明提供的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，检测准确性高：包括通过特异性的探针设计、利用已经成熟PCR技术的退火温度以阻止非特异的结合、以及利用Taq酶5`-3`外切酶活性阻止错配之后的延伸，完全可以达到对核酸序列单碱基差异的良好分辨力，保障了检测的准确性；并且对实验室及仪器设备的要求不高：在普通实验室PCR仪上即可完成整体实验，无需特殊和昂贵设备；操作简单：主要操作以PCR技术为核心，常规操作，成本低廉，易于推广；同时解决了现有方法的检测速度慢、分辨率不高、配套仪器昂贵、检测过程复杂等技术问题。

3、本发明提供的基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，可以在基因分型、耐药突变检测、SNP位点筛查等基于核酸突变的领域具有广泛应用。尤其是对各种耐药病毒、细菌以及基因分型或感染初期检查具有重要的检测意义，进而为临床早期诊断、早期治疗及指导用药提供参考依据和准确导向。

附图说明

图1为扩增片段与固定在固相载体上的检测探针结合、延伸、显色的程序示意图；其中①为硝酸纤维素膜，②为5`端延长修饰的C₁₀链，③为检测探针，④为扩增片段靶序列互补区，⑤为Taq酶，⑥为生物素标记，⑦为亲和素-碱性磷酸酶，⑧为BCIP/NBT显色；

图2为乙型肝炎病毒分型检测用检测探针和对照探针的分布示意图；其中①为阳性对照探针，②为阴性对照探针，③～⑥分别为HBV的A型、B型、C型、D型的检测探针；

图3为乙型肝炎病毒分型检测的显色结果图；图3a～图3d分别为检测出的HBV的A型、B型、C型、D型的显色结果图。

具体实施方式

下面结合具体的检测片段的扩增和检测探针的设计，检测探针与固相载体的固定，检测探针与扩增片段在固相载体上杂交、扩增，以及在乙型肝炎病毒分型检测中的应用，对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

参见图1，基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，是将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，，当扩增的片段被检测探针识别后，能够进行序列的延长(固相核酸扩增)，使得被生物素标记的扩增片段固定在基膜上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过检测探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，通过一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。

所针对的目的基因的获取一般采用检测片段一般为已知的序列，其扩增采用通常的PCR体外扩增，要求循环数25～40，扩增片段的长度建议不超过1000bp，而扩增引物对上亲和素的标记既可以在正向引物也可以在反向引物上，具有由待测的突变位点在扩增片段的位置关系来决定。

检测探针的长度设计为15～25nt，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在5`端5nt之后，根据目的基因的待测区域的突变多态性，设计一系列(多个)探针呈矩阵分布在固相载体上，具有高通量的检测效果；而根据具体检测的目的，检测探针可以设计成要求与检测位点的匹配或不匹配，相应的结果为显色或不显色。而针对目的基因的待测区域的突变连锁情况，检测探针上相应的设计多个检测位点。

对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，阴性对照探针和阳性对照探针的序列设计可以相同或不相同，原则是其序列不能与扩增片段有交叉互补性。阳性对照探针的5`端被生物素标记，能够被显色，用以监测显色系统是否正常；阴性对照探针用以监测杂交和固相核酸扩增的特异性。

检测探针5`端的修饰包括：减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；其中减少空间位阻的序列延长修饰是出于减少核酸扩增错配和扩增后的序列与固相载体的附着、显色的考虑，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6～15C等多种序列的延长修饰。

5`端的辅助固定修饰一般与固相载体结合考虑，固相载体可以为硝酸纤维素膜、尼龙膜或者载玻片，通过在检测探针的5`端添加氨基、巯基、羟基或醛基的辅助固定修饰与其固定，为了检测探针更好的固定和将来的显色效果，固相载体可以进行多种表面修饰。

比如，以硝酸纤维素膜为固相载体，通过在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得显色斑点不扩散；通过检测探针5`端的羟基，经紫外光照后与硝酸纤维素膜固定。

固相核酸扩增即检测探针与目的基因片段在固相载体上杂交、扩增，是探针特异性识别的核心，其中，扩增体系采用常规的PCR反应液，其独特之处就在于以包含检测位点的检测探针作为引物，能够与目的基因互补杂交并进行核酸扩增，且通过检测探针被固定在固相载体上不被洗脱；同时，为了保证杂交的特异性，退火温度一般设置在不低于探针Tm值的5℃范围内。

洗脱过程是为了将未与固相载体结合的扩增片段洗脱掉，洗脱液可以为一般常用的缓冲液，结合离心洗脱效果比较好。

显色通过亲和素-碱性磷酸酶液+NBT/BCIP的显示方式，其优势在于底色不明显，反应精确，结果容易判定，效果比较好；而且实现方便，亲和素-碱性磷酸酶液和NBT/BCIP显色液均可采用现有的试剂盒。

实施例1基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，对乙肝病毒进行基因分型检测，具体操作为：

1)检测用扩增产物的制备

利用ClustalX和Bioedit软件进行对已报道的乙肝病毒HBV 8个型的47个序列进行多重比对，找出S区和PreS2区的型内保守序列作为待测目的片段，依此设计PCR扩增引物对，并对反向扩增引物的5`端增加生物素(Biotin)标记，所设计的引物对P具体为：

正向引物：tacacagacg ccgcaaata              19；

反向引物：Biotin-ccttgataat ccagaagaac c    21；

从乙肝患者血清中利用病毒提取试剂盒提取出乙肝病毒HBV的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行30个循环的PCR扩增，能够获得长度为630bp的扩增片段。

2)检测探针的设计与合成

根据中国人群感染实际情况，设计并人工合成了乙肝病毒HBV的A、B、C、D四型探针，探针Tm值设计为59±1℃，探针长度为16～24nt，同时在探针序列5`端进行加上polyT(T₁₀)、polyC(C₁₀)的序列延长修饰，进行减少空间位阻的延长修饰是为了利于靶序列与固定在基膜上的探针进行结合，具体的检测探针序列如下：

探针1：C₁₀T₁₀-ccttgataat ccagaagaac c      21；

探针2：C₁₀T₁₀-tccaggatca acaacaacca gt     22；

探针3：C₁₀T₁₀-tgactggaga tttgggact         19；

探针4：C₁₀T₁₀-cagcaggatg cagaggaa           18；

探针5：C₁₀T₁₀-ggtagttgat gttcctggaa g      21；

探针6：C₁₀T₁₀-ccataggaat cttgcgaaag        20；

探针7：C₁₀T₁₀-atgttcagcg cagggt            16；

探针8：C₁₀T₁₀-ttccttggag atacatagggagga    24；

其中，探针序列当中的划线位点为针对HBV基因突变产生的多态性的识别位点。探针1～2为针对HBV的A型设计的探针，探针3～4为针对HBV的B型设计的探针，探针5～6为针对HBV的C型设计的探针，探针7～8为针对HBV的D型设计的探针；探针上检测多态性的位点设置均在探针5`端5nt之后。

3)检测探针在检测阵列上的固定

将硝酸纤维素膜在2×SSC溶液(柠檬酸三钠15mM，氯化钠150mM，pH7.0)中浸泡30min后取出，在37℃孵箱内烘干2小时，再将检测探针和对照探针用点膜仪喷涂至膜上(1滴500nl，间隔1mm，呈矩阵分布，具体分布如图2所示)，裁减至4mm×6mm大小，将点完探针的硝酸纤维素膜放入80℃烘箱烘干30分钟，254nm波长紫外光照6分钟，通过紫外光照将探针与硝酸纤维素膜固定连接，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列。在干燥条件下，检测阵列可长期储备待用，使用前将该膜浸入2％BSA液37℃封闭15min。

4)固相核酸扩增反应

首先对第一步获得的基因扩增产物进行序号标记，然后对扩增产物进行热变性处理：95℃水浴5min，然后冰上放置3min；再将变性后的扩增产物10μl、PCR反应液(欣百诺公司，TagMixMaster)20μl、ddH₂O 10μl放入干净的PCR反应管中混匀，将制备好的检测阵列放入，检测阵列的膜背面靠管壁，进行固相核酸扩增反应；设计反应程序：A：57℃退火30s；B：72℃延伸30s；A-B循环数为1；最后72℃延伸3min。

5)洗脱与显色

固相PCR反应完成后，取出检测阵列进行洗脱，将未与检测阵列固定的片段洗脱掉，全部洗脱过程均在37℃条件下完成，具体为：

将检测阵列取出，放入洗脱液A(100mmol/L pH＝7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl)中离心洗脱(转速为30rpm，洗脱1min)，取出检测阵列后，用碱性磷酸酯酶标记的亲和素反应液(购自碧云天公司，碱性磷酸酯酶标记Streptavidin)覆盖后，37℃条件下孵育10min；孵育完成后将检测阵列放入干净的洗脱液A进行洗脱(转速30rpm，洗脱1min)，取出后再放入洗脱液B(100mmol/L pH＝9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl)中，再离心洗脱(转速30rpm，洗脱1min)；取出检测阵列，用清水对膜块表面冲洗，并利用吸水纸去除膜块上的液体，将膜块覆盖显色液(碧云天公司，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒)，30秒后肉眼可看到斑点后，即用清水中止反应。

具体的检测结果如图3所示，其中，①为阳性对照，②为阴性对照，可以看到被生物素标记的阳性对照均正常显色，说明显色系统工作正常；阴性对照不显色，说明固相扩增的特异性好，没有非特异性杂交和核酸扩增。

图3a～图3d分别为检测出的HBV的A型、B型、C型、D型的显色结果图，其中③、④、⑤、⑥固定的检测探针均与HBV病毒靶序列特异结合并显色，膜阵列中其他探针并无显色，那么根据膜阵列上的检测探针的分布位置，令③、④、⑤、⑥检测探针显色所检测的HBV病毒分别为A型、B型、C型、D型靶序列。这表明检测探针上设计的检测位点特异性的识别到了由于位点突变而产生的HBV病毒的分型，本发明提供的检测方法准确、明显。注：由于中国人群感染HBV A型极为稀少，尚未在患者提取的标本当中获得A型病毒株，为了验证本发明的效果，本实验中对HBV A型的检测使用了人工合成DNA模板。

准确性和重复性考证：

对100例乙型肝炎病毒患者的血清中HBV扩增产物进行测序，用NCBI的genotyping tool进行分型，其中A型为人工合成序列1例，B型25例，C型67例，D型7例，再同上述方法检测结果进行比对，该方法检测准确率为99％。其中1例误检因在设计探针的位点旁边碱基产生突变引起。

Claims (7)

1.一种基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）针对目的基因的待测区域设计并合成PCR扩增引物对，在扩增引物的5`端增加生物素标记；提取包含目的基因的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以生物素标记的扩增引物对进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物，所扩增的片段长度不超过1000bp；

2）针对目的基因待测区域的突变多态性，设计并合成多个长度为15～25nt的检测探针，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后；并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

所述的检测探针为：

探针1：C₁₀T₁₀-ccttgataat ccagaagaac c；

探针2：C₁₀T₁₀-tccaggatca acaacaacca gt；

探针3：C₁₀T₁₀-tgactggaga tttgggact；

探针4：C₁₀T₁₀-cagcaggatg cagaggaa；

探针5：C₁₀T₁₀-ggtagttgat gttcctggaa g；

探针6：C₁₀T₁₀-ccataggaat cttgcgaaag；

探针7：C₁₀T₁₀-atgttcagcg cagggt；

探针8：C₁₀T₁₀-ttccttggag atacataggg agga；

3）对固相载体的表面进行修饰后，将检测探针和对照探针呈矩阵分布的固定在固相载体上，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列；

所述的固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜，将硝酸纤维素膜或尼龙膜在2×SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃条件下干燥，然后再将检测探针和对照探针均匀喷涂在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经50～80℃干燥30～120min，紫外光照1～10min后，得到固定有检测探针和对照探针的硝酸纤维素或尼龙膜的检测阵列；

所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记；

4）将PCR扩增产物进行变性处理后，置于包含DNA聚合酶和反应底物的PCR反应液中，然后再加入检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；所述的DNA聚合酶为Taq酶；

5）固相核酸扩增完成后，取出检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用含亲和素-碱性磷酸酶的反应液覆盖检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH₂O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH₂O终止反应；

6）显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域相匹配，未显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域不相匹配；根据设计的检测探针及其阵列上的检测位点设计情况，对待测区域的突变多态性进行判读。

2.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的以基因组DNA为模板的PCR扩增，扩增循环数为25～40。

3.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，检测探针5`端的辅助固定修饰为在检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

4.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的检测阵列在使用前还在体积浓度为2%～5%的BSA中37℃封闭至少15min。

5.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的变性处理为热变性处理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

或者，所述的变性处理为碱变性处理：将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1:10～20的体积比混合，放置至少3min。

6.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的进行固相核酸扩增反应，其反应体系为40～200μl，包括变性处理后的PCR扩增产物，含DNA聚合酶、反应底物和Mg²⁺的PCR反应液，以及ddH₂O；加入的检测阵列浸没于反应体系内。

7.如权利要求1所述的基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，所述的固相核酸扩增反应完成后，取出检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；然后将检测阵列覆盖亲和素反应液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；取出检测阵列用ddH₂O冲洗，最后覆盖显色液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；

所述的洗脱液A的组成为100mmol/L pH=7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；洗脱液B的组成为100mmol/L pH=9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L Mg₂Cl；

所述的亲和素反应液组成为1mL ddH₂O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT合3.5μl BCIP。

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