KR101598398B1 - 5''-플랩 엔도뉴클레이즈 활성의 억제를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법 - Google Patents

5''-플랩 엔도뉴클레이즈 활성의 억제를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR 산물의 말단에 프로브를 상보결합시킬 경우 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 (FEN) 활성이 억제되는 특징을 이용하여 단일염기 다형성(SNP)을 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 에 사용되는 프로브를 PCR 산물 말단 부위에 상보결합시킬 경우 프로브에 대한 내열성 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되는 특징을 확인하고, 이를 이용하여 프로브의 5'-말단 부위에 검출하고자 하는 단일염기 다형성(SNP) 부위가 위치하게 디자인할 경우 대립형질(allele)에 따라 5'-플랩 형성이 유도됨으로써 효과적인 단일염기 다형성(SNP) 검출이 가능한 새로운 방법에 관한 것이다.

Description

5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성의 억제를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법 {Mutant Detection Method by Real-Time Polymerase Chain Reaction using selective working of 5'-flap endonuclease activity}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR, RT-PCR)을 이용하여 DNA 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 자세하게 설명하면, DNA 폴리머레이즈, 구체적으로 패밀리 A DNA 폴리머레이즈, 더욱 구체적으로 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'-FEN (5'-flap endonuclease; 이하 "FEN"과 혼용함) 활성을 억제하는 방법, 억제된 FEN 활성을 이용하여 단일염기다형성 (single point nucleotide polymorphisms, 이하 SNP) 등 유전자 돌연변이를 검사하는 방법, 유전자 돌연변이 검사용 프로브의 디자인 방법 및 다양한 프로브 유형에 대한 적용 방법 등 효과적이며 정교하게 유전자 돌연변이를 검사할 수 있는 새롭고 효과적인 방법에 관한 것이다.
유전자의 돌연변이 분석은 인간 유전질환 진단, 약물 유전학, 약물 개발 그리고 미생물학 등 다양한 과학 분야에서 그 중요성이 강조되면서 빠르게 성장하고 있는 분야이다. 유전학 분야에서 돌연변이는 DNA를 구성하는 염기서열의 변화를 말하며 전좌, 역위를 비롯하여 특정 유전자의 삽입/결실과 단일염기 다형성 (SNP)이 포함된다. 이들 중에서 SNP는 가장 일반적인 형태의 DNA 염기서열의 변화이며 인간 유전체의 경우 1,000 염기당 1개의 빈도로 나타나고 있다 (Sachidanandam, R. et al. 2001. Nature, 409: 928-933). 인간 유전체 상에서 SNP는 암호화 부위 (coding regions)보다는 비암호화 부위 (non-coding regions)에서 더 빈번히 나타나며 (LI, W. H. and Sadler, L. A. 1991. Genetics, 129: 513-523), 비암호화 부위의 SNP는 진화학적인 연구에 있어서 분자 마커로 사용되고 있으며, 암호화 부위의 SNP는 유전자의 기능, 단백질의 구조 또는 발현에 영향을 줄 수 있기 때문에 유전질환 연구 및 진단에 있어서 마커로 사용되고 있다 (Kim, S. and Misra, A. 2007. Annu. Rev. Biomed. Eng., 9: 289-320). 이렇듯 분자 마커로써 SNP를 높은 신뢰도와 민감도로, 빠르고 경제적으로 분석할 수 있는 다양한 방법들이 개발되고 있다 (Syvanen, A. C. 2001. Nat. Rev. Genet., 2: 930-942; Kirk, B. W. et al. 2002. Nucleic acids Res., 30: 3295-3311; Kwok, P-Y., 2002. Hum. Mutat., 19: 315-323).
RT-PCR을 이용하는 SNP 분석방법은 가장 광범위하게 사용되는 방법으로 이용 가능한 유전정보가 풍부해지면서 그 활용도는 더욱더 커지고 있다. 다른 SNP 분석법과 비교하여 RT-PCR은 빠르고, 민감도와 특이도가 높으며, 분석 비용이 저렴하고, 또한 쉽게 자동화가 가능하다는 장점이 있다. 더욱이 기존의 일반 PCR (conventional PCR)과 달리 RT-PCR은 아가로즈 겔을 이용하는 전기영동 분석이 필요 없어 오염에 의한 분석 오류를 최소화할 수 있는 장점도 있다.
RT-PCR을 이용하여 SNP를 분석하기 위해서는 올리고뉴클레오타이드 형태의 프로브 또는 프라이머를 이용하게 되며, 주로 혼성화 프로브 (hybridization probe), 가수분해 프로브 (hydrolysis probe 또는 TaqMan probe), 분자 비콘 (molecular beacons) 그리고 스콜피온 프라이머 (scorpion primers) 방법 등이 사용되고 있다. 혼성화 프로브를 이용하는 돌연변이 분석 방법은 형광 공명 에너지 전달 (fluorescent resonance energy transfer; FRET)을 원리로 하는 Roche 사의 LightCycler PCR system을 사용하는 방법이 상용화되어 있다 (Wittwer, C. T. et al., 1997. BioTechniques, 22: 176-181). 분석에는 두 종류의 프로브가 사용되며 FRET은 두 프로브가 표적 DNA에 인접하여 혼성화 결합될 경우 형광이 발생되는 원리를 이용한 것이다. 혼성화 프로브를 이용한 돌연변이 분석은 PCR이 종료된 후 용융곡선 (melting curve)을 분석함으로써 가능하다. 즉, 돌연변이로 표적 서열의 일부 서열이 프로브 서열과 불일치하는 경우는 완벽하게 일치하는 경우보다 용융 온도가 낮기 때문에 용융곡선의 양상에 차이를 보이게 된다 (Lohmann, S.,et al., 2000. Biochemica, 4: 23-28). 혼성화 프로브와 용융곡선을 이용하여 돌연변이를 분석하는 방법은 매우 빠른 분석 방법이고, 프로브 디자인도 상대적으로 쉽다. 그러나 실질적으로 용융곡선은 항상 기대하는 만큼의 돌연변이 판독 능력을 보이지 못한다.
가수분해 프로브 방법은 PCR 반응시 프라이머와 함께 양 말단에 리포터 (reporter)와 퀀처 (quencher)가 결합된 프로브를 사용하며, 형광 공명 에너지 전달 원리를 이용한다. 즉, 리포터와 퀀처가 인접되어 있을 경우 리포터로부터 방출된 에너지가 인접한 퀀처로 에너지 전이가 일어나 형광이 검출되지 않다가, PCR 증폭 산물이 증가되면서 표적 유전자에 결합된 프로브가 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3’ 뉴클레이즈 활성에 의해 분해되면서 리포터의 형광이 발산되는 원리이다. 가수분해 프로브 분석 방법(TaqMan probe assay)은 표적 염기서열에 프로브의 결합과 이어지는 뉴클레이즈 활성에 의한 프로브의 분해가 일어날 수 있는 최적의 조건을 찾는 것이 매우 중요하다. 즉, PCR에 사용되는 프라이머와 프로브가 표적서열에 혼성화 결합되고 동시에 프로브가 분해될 수 있는 PCR 조건 (thermal profile) 이 중요하다. 이 두 가지 요구 조건을 충족하기 위해 일반적으로 2 단계 PCR이 적용된다. 즉 95℃에서 변성 (denaturation) 단계가 수행되고, 프로브의 Tm보다 7~10℃ 낮은 60℃에서 어닐링 (annealing)과 연장 (extension)이 동시에 수행된다. 만약 너무 높은 온도에서 반응을 하게 되면 프로브는 Taq DNA 폴리머레이즈에 의해 분해되기보다는 표적으로부터 분리 (strand-displace)되고 형광은 증가하지 않게 된다 (Logan, J. et al. 2009. Caister Academic Press). TaqMan™ 프로브는 형광물질을 다양하게 사용하여 SNP 검출 또는 돌연변이 분석이 가능한 장점이 있다. 그러나, 이 방법에서는 프로브의 특이도를 부여하기 위해서 짧은 프로브를 사용하여야 하며, 이로 인해 Tm 값이 필연적으로 낮아지게 되어 안정한 어닐링 상태 유지가 어려워진다. 이를 극복하기 위해 고가의 MGB (Miner Groove Binder) 프로브 또는 LNA (Locked Nucleic Acid) 프로브를 사용하여야 하는 단점이 있다 (Letertre, C. et al. 2003. Mol. Cell Probes, 17: 307-311). MGB TaqMan 프로브는 일반적인 TaqMan 프로브와 유사하지만 3' 말단에 마이너 그루브 결합부분을 더해 줌으로써 프로브가 길이가 짧아도 Tm이 높기 때문에 PCR 조건에서 안정한 어닐링 상태를 유지하게 한다 (Kutyavin, I. V. et al. 2000. Nucleic Acids Res., 28: 655-661). MGB와 같이 별도의 변형 프로브를 사용하지 않고 TaqMan 프로브와 함께 AMRS (Amplification Refractory Mutation System) PCR 원리를 적용하여 SNP를 분석하기도 한다 (Ellison, G. et al. 2010. J. Exp. Clin. Cancer Res., 29:132). 그러나 ARMS PCR은 SNP를 구분할 수 있는 최적의 PCR 조건을 찾기가 매우 까다롭다 (Punia P. and SAunders. N. http://www.horizonpress. com/pcrbooks).
분자 비콘 (Molecular beacon)과 스콜피온 프라이머 (Scorpion primer)는 스템-루프 (stem-loop) 구조를 포함하는 구조화된 탐침 (structured probes)이며, 혼성화 프로브나 TaqMan 프로브와 같은 선형 프로브보다 상대적으로 높은 특이도를 보이고, 미스매치 식별 능력이 뛰어나기 때문에 유사한 서열의 구별 또는 SNP와 대립형질 구분에 적합하다. 그러나 루프 구조를 갖는 프로브를 디자인하기가 매우 까다롭기 때문에, 일반적으로 여러 종류의 프로브를 제작하여 실험한 후 목적하는 결과를 얻을 수 있는 프로브를 확보하기가 어렵다 (Bonnet, G., et al. 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 6171-6176; Broude, N. E. 2002. Trends Biotechnol., 20; 249-256.; Tapp, I. et al. 2000. Biotechniques, 28: 732-738).
가장 대표적으로 사용되고 있는 실시간 중합효소 반응법은 가수분해 프로브 방식인 TaqMan 분석방법이며, 이에 적용된 기본 원리는 Taq DNA 폴리머레이즈가 보유하고 있는 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성을 이용하는 것이다. 1991년 Holland 등은 주형 DNA와 상보적 염기서열을 갖는 프로브를 사용할 경우 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성에 의해 특정 PCR 반응을 실시간으로 확인할 수 있음을 밝혔다. 또한, 이때 사용되는 프로브는 주형 DNA와 100% 상보성을 갖는 경우뿐 아니라 5'-말단의 비상보적 플랩 (flap) 부위를 갖는 프로브도 구분 없이 Taq DNA의 5’→3' 엑소뉴클레이즈 활성에 의해 분해됨을 확인하였다 (Holland P. M. et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7276-7280). 이후 이 방법을 기반으로 형광 안료로 수식된 프로브를 활용한 다양한 RT-PCR 기법들이 개발되어 여러 분야에서 광범위하게 활용되고 있다 (Heid, C. A. et al., 1996. Genome Res. 6. 986-994.; Livak K. J. 1999. Genet. Anal., 14:143-149).
일반적으로 진핵생물(eukarya)과 고세균류(archaea)는 DNA 폴리머레이즈와 FEN1 뉴클레이즈 (Lieber, M. R., 1997. BioEssays 19: 233-240)라 불리는 DNA 엔도뉴클레이즈 IV가 구분되어 있으며, 플랩 엔도뉴클레이즈 1 (FEN1)은 DNA의 복제와 수선과정에서 생성되는 5'-플랩을 제거하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Rossi, M. L. et al., Chem. Rev. 106, 453-473, Kim, K. et al., 1998. J. Biol. Chem., 273: 8842-8848: Klungland, A. and Lindahl, T. 1997. EMBO J. 16: 3341-3348). 특히, 진핵생물의 FEN은 암, 바이러스성 질병의 진행 등에 연관되어 있어, 신약개발을 위해 FEN 특히 FEN-1의 활성 저해제에 대한 관심이 매우 커지고 있다 (McWhirter C. et al. 2013. J. biomol. Screen. 18: 567-75).
이에 반해 써머스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 유래의 DNA 폴리머레이즈 (Taq)를 포함한 원핵생물 패밀리 A 폴리머레이즈의 경우는 한 단백질 내에 5'-뉴클레이즈와 DNA 폴리머레이즈가 서로 다른 도메인에 존재하며, 5'-뉴클레이즈는 일반적인 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성 이외에 5’-플랩을 제거하는 엔도뉴클레이즈 (FEN) 활성을 동시에 가지고 있는 것으로 알려져 있다 (Lyamichev, V. et al. 1993. Science, 260: 778-783).
상기 언급된 Holland 등의 실험 결과는 사용되는 프로브의 5'-말단에 플랩 부위가 존재할 경우에는 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3’엑소뉴클레이즈 활성이 아닌 FEN 활성에 의한 것임을 알 수 있다. 하지만 TaqMan 프로브를 사용하는 기존 방법에서는 5'→3’엑소뉴클레이즈와 FEN 활성을 구별하지 않고 통칭하여 5'-뉴클레이즈로 사용하고 있다. 2005년 발표된 Invader assay (Olivier M., 2005. Mutat. Res., 573: 103-110)는 열안정성 (thermostable) FEN 효소의 특성을 이용하여 SNP를 검출할 수 있는 방법을 제시했으나, 회전 신호 증폭이 아닌 등온 (isothermal) 반응에서 기인하는 낮은 민감도 때문에 폭넓게 활용되지는 못하고 있다.
상기와 같이 다양한 분자진단 기술 등이 개발되어 왔지만, 여전히 충분한 민감도와 특이성을 가지는 분자진단 기술의 개발이 필요하다. 특히 유전자 변이를 효과적으로 검사하기 위한 많은 방법들이 활용되고 있지만 검사 시간, 비용, 특이도, 민감도 및 다종 검사 등 실제 임상에서 필요로 하는 문제점을 모두 만족 시키는 검사법은 존재하지 않는다.
TaqMan 프로브등 많은 방법은 SNP를 구분하기 위해 특정 온도에서 알릴 특이적 (allele-specific) 프로브의 상보적 결합을 기본적 원리로 사용한다. 이들 방법은 단순히 온도에 따른 프로브의 상보적 결합력의 차이를 이용하기 때문에 결합력의 차이를 극대화하기 위해 MGB 변형, PNA 사용 등 추가적인 비용이 발생한다. 또한 온도에 따른 구분성은 다종의 SNP를 동시에 분석할 경우 모든 종류 프로브의 특이성을 보장하지 못한다.
본 발명에서는 RT-PCR 기반의 알릴-특이적 프로브를 사용하지만, 추가 변형이 없으며, 온도에 따른 구분성이 아닌 효소의 특이성을 이용함으로써 추가 비용 없이 검사 특이성 및 다종 분석에 장점을 갖는 새로운 검사 방법을 제시하고자 한다.
이에 본 발명자들은 현재 보편적으로 활용되고 있는 RT-PCR을 기반으로 사용하며, 프로브의 5'-말단 부위에 검출하고자 하는 단일염기다형성 (SNP) 부위가 위치하게 디자인하여 대립형질에 따라 형성되는 5’-말단 비상보적 플랩을 유도하고, 원핵생물의 DNA 폴리머레이즈, 대표적으로 Taq DNA 폴리머레이즈가 가지고 있는 5'-말단의 비상보적 플랩을 제거하는 FEN 활성을 억제한다면 효과적으로 단일염기다형성 (SNP)을 검출할 수 있는 새로운 검사 방법이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 원핵생물의 DNA 폴리머레이즈, 대표적으로 Taq DNA 폴리머레이즈의 FEN 활성을 억제할 수 있는 새로운 방법을 도출했으며, 이 원리를 적용함으로써 프로브의 대립유전자 (allele)에 대한 특이 결합과 비특이적 결합을 특정 온도가 아닌 Taq DNA 폴리머레이즈의 특성으로 구분할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 Taq DNA 폴리머레이즈를 비롯한 원핵생물의 DNA 폴리머레이즈의 FEN 특이성에 적합한 프로브의 디자인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TaqMan 프로브 등 다양한 형광 프로브뿐만 아니라 SYBR Green을 이용한 비형광 프로브를 사용하여 값싸게 SNP를 검사할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 포함하는 DNA 폴리머레이즈 중 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성 억제를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 폴리머레이즈가 내열성 DNA 폴리머레이즈임을 특징으로 하는, 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제된 DNA 폴리머레이즈를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 이용되는 내열성 DNA 폴리머레이즈로는 특별한 제한은 없으나, 구체적인 예로서는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 써머스 플라부스(Thermus flavus), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 써모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 써모코커스 코다카라엔시스 KOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1), 파이로코커스 워에세이(Pyrococcus woesei), 파이로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 아에로파이룸 퍼닉스(Aeropyrum pernix), 아퀴펙스 애올리쿠스(Aquifex aeolicus), 술포로부스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 파이롤로부스 퓨마리(Pyrolobus fumarii), 메타노피루스 칸드레리(Methanopyrus kandleri) 유래의 내열성 DNA 폴리머레이즈 또는 Ultra DNA 폴리머레이즈 등을 포함하는 야생형 또는 그 유래의 변이형 내열성 DNA 폴리머레이즈를 들 수 있다. 내열성 DNA 폴리머레이즈는 유전공학적으로 인공적으로 합성된 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포괄한다.
본 발명에서 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성의 억제는 프로브 및 프라이머가 적절한 위치에 있도록 함으로써 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 방법, DNA 폴리머레이즈의 변이를 통해 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 방법, 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성 저해제를 첨가하는 방법, 기타 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성에 영향을 미치는 반응조건, 예컨대 염 이온의 농도를 조절하는 등의 방법으로 달성할 수 있을 것이다.
이러한 방법 중 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 중합효소 연쇄반응 산물과 짝을 이루는 프로브를 적절한 위치에 있게 하여 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 방법으로 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 제시하였다.
또한, 본 발명은 PCR 산물과 짝을 이루는 검출용 프로브의 5'-말단이 PCR 산물의 5' 말단으로부터 24-38 염기 이내에 위치하게 하도록 하여 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되도록 함을 특징으로 하는, DNA 폴리머레이즈를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 프로브가 5'-말단에 플랩 부위를 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는, DNA 폴리머레이즈를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 프로브의 5'-말단이 2 염기 이상의 연속적인 들뜸구조 또는 비연속적 들뜸구조를 갖는 것을 특징으로 하는, DNA 폴리머레이즈를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이 유전자가 단일염기다형성 (SNP), 1 염기 이상의 결실, 치환 및 유입 중 한 가지 이상을 나타냄을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 포함하는 DNA 폴리머레이즈를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 있어서, DNA 폴리머레이즈 중 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 프로브를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 돌연변이 부위가 PCR 산물과 짝을 이루는 프로브의 5'-말단 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는, DNA 폴리머레이즈 중 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 프로브를 이용하여 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이 유전자가 단일염기다형성 (SNP), 1 염기 이상의 결실, 치환 및 유입 중 한 가지 이상을 나타냄을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프로브가 대립형질에 따라 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되는 5'-말단 플랩 구조가 유도되는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 1 염기 이상의 결실, 치환 및 유입 중 한 가지 이상의 돌연변이 부위가 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되는 프로브의 5'-말단에 위치함을 특징으로 한다.
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또한, 본 발명은 유전자 돌연변이 검사용 중합효소 연쇄반응 킷트에 있어서, 시료 DNA, 전방 프라이머, 후방 프라이머, 프로브 및 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포함하며, 상기 프로브는 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성을 억제하는 것임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 프로브가, 리포터 안료와 퀀처 안료가 동시에 수식되어 있는 듀얼 레이블 프로브 또는 비수식 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 전방 프라이머 및 후방 프라이머는 각각 상보 결합 서열을 포함하며, 프로브는 리포터 안료와 퀀처 안료가 동시에 수식되어 있는 듀얼 레이블 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 비수식 프로브를 사용하는 경우에는 SYBR-green과 같이 DNA 이중결합에 결합하여 형광을 나타내는 삽입제 (intercalating agents) 또는 표면결합제 (surface binding agents)를 부가하는 것을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 신속하고 민감도와 특이도가 우수한 새로운 원리가 적용된 경제적인 유전자 돌연변이 검출 수단이 제공된다.
본 발명의 방법에 의하면, 혼성화 결합시 프로브의 5'-플랩 구조의 염기가 없거나 하나인 프로브를 사용하는 경우에는 PCR 증폭산물이 생성되는데 반해 5'-플랩 구조가 2염기 이상인 경우에는 PCR 증폭산물이 생성되지 않는다.
본 발명의 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 돌연변이 검사방법은 5'-말단에 퀀처 안료, 3'-말단에 리포터 안료가 결합된 이중가닥 프라이머를 사용하거나, 안료를 프라이머에 결합시키는 대신 이중가닥에 삽입되거나 이중가닥 표면에 부착되는 표면결합제를 이용하는 등 종래 실시간 PCR에 사용되던 프라이머와 프로브도 본 발명에 이용 가능하다.
또한, 본 발명의 방법은 종래 가장 널리 이용되는 TaqMan 프로브도 프로브를 PCR 증폭산물의 5' 말단 부위에 위치시키는 경우 효과적으로 이용 가능하다.
뿐만 아니라, 종래 방법은 동시에 여러 종류의 DNA를 분석할 때 프로브의 어닐링 온도 차이를 이용하였으나, 본 발명의 방법은 효소의 반응 특이성을 이용하기 때문에 어닐링 온도에 민감하지 않게 다종의 SNP를 타이핑할 수 있다.
도 1은 “NST 프로브 시스템”의 작용 기작을 설명하는 모식도를 나타낸 것이다. 프로브의 위치가 PCR 산물의 말단에 위치하며, 프로브의 5'-말단이 대립형질에 의해 유도되는 플랩 구조를 갖게 되는 특징이 있으며, 이 경우 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되어 SNP 타이핑 (typing)이 가능하다.
도 2는 프라이머를 이용한 RT-PCR의 기본 모식도 및 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 프라이머를 활용한 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성 측정을 위한 모식도 및 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 NSTS/dsp 프로브, NSTS/SYBR-green 프로브 대한 플랩 엔도뉴클레이즈 활성도 측정 결과이며, 다양한 프로브 형태가 “NST 프로브 시스템”에 활용될 수 있음을 나타낸 것이다.
도 5는 NSTS/taqman 프로브 및 TaqMan 프로브에 대한 플랩 엔도뉴클레이즈 활성도 측정 결과이며, TaqMan 프로브도 PCR 산물의 말단 부위에 위치할 경우 “NST 프로브 시스템”에 활용될 수 있음을 나타낸 것이다.
도 6은 NSTS/sybr-green 시스템이 작용하는 프로브의 위치의 한계를 시험하기 위해 프라이머의 길이를 조절하여 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성 억제를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 NSTS/taqman 시스템이 작용하는 프로브의 위치의 한계를 시험하기 위해 프라이머의 길이를 조절하여 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성 억제를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 “NST 프로브 시스템”에 적용 가능한 프로브의 5'-말단 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 프로브 쌍이 SNP 타이핑에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인한 결과이다.
도 10은 람다 DNA를 주형으로 임의로 선택된 5종의 NSTS/sybr-green 프로브 쌍에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 프로브의 상보결합 온도에 예민하지 않게 다종의 프로브를 동시에 사용할 수 있다는 “NST 프로브 시스템”의 장점을 나타낸 것이다.
도 11은 "NST 프로브 시스템“ 이 기존의 ”TaqMan 프로브 시스템“과는 달리 온도 차이가 아닌 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'-뉴클레이즈 활성 특이도에 의해 프로브를 구분하므로, 기존 방법에 비해 특이도가 높고 다종의 SNP 타이핑에 장점을 갖는 특징을 나타내는 모식도이다.
본 발명은 SNP 등의 돌연변이 DNA를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하여 유전질환검사, 종양관련 유전자 검사 등에 임상적으로 이용하기 위한 것이다.
본 발명은 실시간 PCR을 위해 필요한 한 쌍의 프라이머와, 두 프라이머 중 한 개와 일부분 상보적인 염기서열로 구성되면서 표적 유전자 염기서열과 같은 프로브, 그리고 5'-뉴클레이즈 활성을 가진 DNA 폴리머레이즈를 이용하여 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 5'-플랩 구조를 인식하여 분해하는 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 (Flap endonuclease; FEN) 활성 능력이 PCR시 혼성화 결합되는 프로브의 위치에 따라서 달라질 수 있음을 발견하였다 (도 1a). 이 발견을 이용하여 DNA 폴리머레이즈의 뉴클레이즈 활성을 이용한 새로운 개념의 SNP 검출 방법을 발명할 수 있었다 (도 1b).
본 발명에서 용어, “NSTS (Novel SNP Typing System)"는 DNA 폴리머레이즈의 뉴클레이즈 활성의 특이도를 이용한 본 발명의 새로운 SNP 검출용 시스템을 총괄적으로 지칭한다. 구체적으로 설명하면, 프로브가 표적 염기서열과 혼성화 결합 후 형성되는 프로브의 5' 말단 구조에 따라서 DNA 폴리머레이즈의 뉴클레이즈 활성이 달라지는데, 이 현상을 이용하여 SNP 등의 유전자 돌연변이를 구별할 수 있는 새로운 검사 시스템을 의미한다.
본 발명에서 용어 "TaqMan 프로브”는 양말단에 리포터와 퀀처 기능이 가능한 형광물질이 결합된 변형 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 구체적으로 리포터는 FAM, 퀀처는 TAMRA를 이용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "NSTS/dsp”는 NSTS에 이중사슬 프라이머가 적용된 프로브를 사용한 경우를 통칭하며, “NSTS/taqman”은 NSTS에 TaqMan 프로브를 사용한 경우를 통칭한다. 또한 "NSTS/sybr-green"은 NSTS에 SYBR GREEN 시스템을 사용한 경우를 통칭한다.
본 발명에서 5'-플랩 구조를 인식하여 가수분해하는 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성은 PCR 시 혼성화 결합되는 프로브의 위치에 따라서 달라질 수 있다 (도 1). 구체적으로 혼성화 결합시 5'-플랩 구조를 갖는 프로브가 PCR 증폭산물의 말단에 위치하면 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 제한되어 프로브는 분해되지 않는다. 좀 더 구체적으로는, 혼성화 결합시 프로브의 5'-플랩 염기가 0개인 구조를 갖는 프로브 (이하 Mis+0) 및 1염기인 구조를 갖는 프로브 (이하 Mis+1)를 사용하는 경우는 PCR 증폭 산물이 생기는데 반해, 5'-플랩 염기가 2염기인 구조를 갖는 프로브 (이하Mis+2) 및 3염기인 구조를 갖는 프로브 (이하 Mis+3)를 사용할 경우는 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 제한되어 PCR 증폭산물이 생성되지 않는다 (도 3).
본 발명에서 적용 가능한 프라이머와 프로브 유형은 프라이머의 5‘-말단에 퀀처, 프로브의 3’-말단에 리포터 기능이 가능한 형광물질이 결합된 변형 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 DSP (double stranded primer) 시스템을 이용한 NSTS/dsp (도 4a)가 있고, SYBR Green 원리를 적용한 비수식 프라이머 및 프로브를 이용하는 NSTS/sybr-green (도 4b) 등 기존의 실시간 PCR에 사용되는 프라이머와 프로브도 가능하다.
또한, 기존에 가장 폭넓게 활용되고 있는 TaqMan 프로브 시스템의 경우는 프로브의 5'-플랩 부위가 2염기 이상인 경우도 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되지 않지만 (도 5b), TaqMan 프로브를 PCR 산물의 말단 위치에 적용시킨 NSTS/taqman의 경우는 프로브의 5-플랩 부위가 2염기 이상인 경우, Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되어 PCR 증폭 산물이 생기지 않음을 확인할 수 있었고 (도 5a), 따라서 TaqMan 프로브도 프로브가 PCR 산물의 말단 부위에 위치할 경우 효과적으로 적용 가능함을 확인할 수 있다.
본 발명에서 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 억제되는 조건인 프로브의 PCR 산물 내 말단 위치는 프로브의 5'-플랩 부위로부터 PCR 산물의 5’-말단 위치까지 28 내지 34 염기 내로 한정하여 사용 가능하나 (도 6, 도 7), 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 특정 SNP 포인트를 검사하는데 사용되는 NSTS 프로브 쌍의 5'-말단 부위의 구조를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 다양한 SNP 부위와 이에 적절한 NSTS 프로브 쌍에 대한 적용을 NSTS/sybr-green을 활용하여 검증함으로써 Mis+1/Mis+2 (도 9a), Mis+3(2)/Mis+3(1) (도 9b) 혹은 Mis+2(1)/Mis+2 (도 9c) 쌍의 프로브가 효과적으로 SNP 타이핑에 사용될 수 있음을 알 수 있다. 하지만, 이들 5'-말단 구조에만 한정하여 프로브의 사용이 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 프로브의 상보결합 온도 차이에 따라 프로브를 구분하는 것을 특징으로 하는 기존 방법이 가지고 있는 동시 다종분석 및 온도 민감성의 한계점을 극복할 수 있는 새로운 SNP 타이핑 방법을 제공한다.
본 발명에서는 임의로 선택된 8종의 NSTS/sybr-green용 프로브쌍에 대해 동시에 RT-PCR을 수행하여 이들 프로브쌍이 동시에 효과적으로 SNP 타이핑에 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 10a). 또한, 동일한 8종 프로브쌍에 대해 다른 어닐링 온도 (10℃ 차이)에서 반복하여 수행한 RT-PCR 결과 (도 10b)도 동일한 결과를 보임으로써, 본 발명의 SNP 타이핑 방법이 어닐링 온도에 민감하지 않고, 효소의 반응 특이성을 이용하여 여러 종의 프로브쌍을 구분할 수 있으므로, 동시에 효과적으로 다종 SNP를 타이핑할 수 있음을 확인하였다 (도 11).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
DNA 시료 준비
람다 DNA (Catalog # N3011S, New England BioLabs사)를 PCR용 주형 DNA로 사용하였다. 람다 DNA는 멸균증류수를 이용하여 희석하여 100 pg/ul 준비하였다. 이와 같이 준비된 DNA는 실험에 사용하기까지 냉동보관하였다.
프라이머 및 프로브 제작
람다 DNA의 특정 유전자 부위를 PCR 증폭할 수 있도록 프라이머를 디자인 하였고, 프로브는 증폭산물에 혼성화 결합이 가능한 염기서열을 갖도록 디자인 하였다. 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 원리를 적용하기 위해서 형광물질이 결합된 프라이머와 프로브를 사용하였다. 디자인된 프라이머 및 프로브는 본 출원인인 (주)제노텍의 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다.
RT - PCR 반응 및 확인
상기에서 준비한 람다 DNA 시료를 주형으로 하고, 준비한 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 사용한 프라이머와 프로브는 각 실시예에 기재하였다. 본 실시예에 사용한 폴리머레이즈 및 반응 조성물은 3.1X qPCRMix (31 mM Tris, pH 9.0, 4.65 mM MgCl2, 124 mM KCl, 620 mM 메틸 글루코스, 3.1 mM dNTPs, 3.1 u Taq DNA 폴리머레이즈, (주)제노텍, 한국)을 사용하였다. RT-PCR 증폭 산물은 ABI7500 Real-Time PCR Systems 또는 CFX9600 Real-Time System을 이용하여 실시간으로 확인하였다.
실시예 1: 이중가닥 프라이머(Double-Stranded primer; DSP) 시스템을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응의 증폭곡선 확인시험
이중가닥을 형성하는 프라이머/프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 하여 PCR 증폭 곡선을 확인하는 시험이다. 전방 프라이머의 5'-말단에서 4번째 서열부터 프로브와 혼성화 결합하는 이중가닥 프라이머/프로브이다. 전방 프라이머의 5'-말단에는 퀀처로 TAMRA가, 프로브의 3-말단에는 리포터로 FAM이 결합되어 있다.
* DSP 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머 : 5'-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3'
프로브 : 5'-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
* RT-PCR 반응 조건:
95℃, 5분(1회),
95℃, 15초 - 60℃, 40초 - 72℃, 30초 (35회 반복)
* RT-PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul(100 pg), 상기 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 3.1x qPCRMix 6.45 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 용량 20 ul가 되도록 한다.
PCR 증폭 산물이 생성됨에 따라 DSP 프로브가 가수분해되어 FAM의 신호가 점차적으로 증가되는 전형적인 RT-PCR 신호가 관찰되었다. 이로 미루어 이중가닥을 형성하는 프라이머/프로브가 RT-PCR 연쇄반응을 방해하지 않음을 확인할 수 있었다 (도 2).
실시예 2: DSP 프로브의 5'-말단 구조의 특성에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응
DSP 프로브의 5-말단 구조에 변화를 주어 5' 뉴클레이즈 활성화 정도 차이를 확인하고자 하였다. 프로브의 5-말단 구조는 들뜸 구조가 없는 프로브(Mis+0). 1개의 염기가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+1). 2개의 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+2). 3개의 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+3)를 사용하여 시험하였다.
* 프라이머
전방 프라이머 : 5'-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
* 프로브
Mis+0 : 5'-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
Mis+1 : 5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
Mis+2 : 5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
Mis+3 : 5'-catccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
* RT-PCR 반응 조건
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 - 60℃, 30초 - 72℃, 30초 (40회 반복)
* RT-PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul(100 pg), 상기 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), 및 Taq DNA 폴리머레이즈 등 실시간 PCR에 필요한 반응 조성물이 미리 혼합된 3.1x qPCRMix 6.45 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20 ul로 맞추었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 프로브의 5-말단의 들뜸 구조에 따라서 Taq DNA 폴리머레이즈의 5' 뉴클레이즈 활성 차이가 나타남을 확인할 수 있다. Mis+0와 Mis+1 프로브를 사용한 시험에서는 PCR 증폭곡선이 증가를 보이지만, 1개의 들뜸 구조를 갖는 Mis+1 프로브를 사용한 경우의 증폭 곡선의 Ct 값이 더 크다. Mis+2와 Mis+3 프로브를 사용한 시험에서는 신호가 증폭되지 않았다. 이러한 결과는 기존 TaqMan 프로브와 달리 DSP 프로브가 PCR 증폭 산물 말단에 위치하는 점과, 프로브의 5-말단 들뜸 구조의 차이를 반영한 것으로 보인다. 또한, 이러한 결과는 Taq DNA 폴리머레이즈의 5'→3' 엑소뉴클레이즈 작용에 의한 유리 FAM의 생성을 5-말단의 들뜸 구조가 억제하여 발생한 것으로 추론할 수 있을 것이다.
실시예 3: 다양한 프로브 형태에 따른 5-말단 들뜸 구조를 갖는 프로브의 실시간 중합효소 연쇄반응
실시예 2에서 발생한 5'-말단 구조에 의한 Taq DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈 (FEN) 활성 억제 작용을 더욱 구체적으로 확인하기 위해, DSP 프로브와 SYBR Green 프로브 및 외측 (External) TaqMan 프로브와 TaqMan 프로브를 이용하여, PCR 증폭 산물의 프로브 결합 위치와 프로브의 5'-말단 구조에 따른 Taq DNA 폴리머레이즈의 5 뉴클레이즈 활성 차이를 확인하고자 하였다.
실시예의 프라이머와 프로브 RT-PCR 조건은 하기와 같다.
* DSP 프로브 시험용 프라이머 (도 4a)
전방 프라이머 : 5'-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
* 프로브
Mis+0 : 5'-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
Mis+1 : 5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
Mis+2 : 5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
* SYBR Green 프로브 시험용 프라이머 (도 4b)
전방 프라이머 : 5'-gccgcgctggatgaactgatac-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
* 프로브
Mis+0 : 5'-ccggtatcagttcatccagcgc-3'
Mis+1 : 5'-tccggtatcagttcatccagcgc-3'
Mis+2 : 5'-atccggtatcagttcatccagcgc-3'
* 외측 TaqMan 프로브 시험용 프라이머와 프로브(도 5a)
전방 프라이머 : 5'-taccggggttgctgagtgaatata-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
프로브
Mis+0 : 5'-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
Mis+1 : 5'-FAM-acgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
Mis+2 : 5'-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
* TaqMan 프로브 시험용 프라이머와 프로브(도 5b)
전방 프라이머 : 5'-gccgcgctggatgaactgatac-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
프로브
Mis+0 : 5'-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
Mis+1 : 5'-FAM-acgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
Mis+2 : 5'-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 - 60℃, 30초 - 72℃, 30초 (35회 반복)
* PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul (100 pg), 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), SYBR Green(Takara) 1 ul(10X)및 3.1X qPCRMix 6.45 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20 ul로 만들어 사용하였다.
도 4, 5에서 알 수 있듯이, 프로브의 형태에 따라 PCR 증폭 곡선이 다른 형태를 보인다. 전방 프라이머와 프로브가 혼성화 결합되어 있는 SYBR Green, 외측 TaqMan 프로브의 경우 DSP와 유사하게 프로브 말단의 들뜸 구조에 따라서 PCR 증폭 곡선의 차이를 보였다. 즉 들뜸 구조가 없는 Mis+0와 들뜸 구조가 1개인 Mis+1 프로브는 가수분해되며, 들뜸 구조가 2개인 Mis+2는 PCR 증폭 곡선의 증가가 없었다(도 4a, 4b, 5a). 그러나 TaqMan 프로브 시스템의 경우, 프로브의 종류와 관계없이 신호가 증폭되었다 (도 5b). 이러한 결과는 PCR 증폭 산물 말단에 프로브가 위치하게 되면, 5'-말단 구조의 차이에 따라 Taq DNA 폴리머레이즈의 5' 뉴클레이즈 활성에 의한 신호의 증폭의 차이가 발생함을 확인할 수 있었다. 그러나, 프로브가 PCR 증폭 산물의 중간에 위치하는 TaqMan 프로브는 5'-말단 구조와 상관없이 모두 가수분해됨을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 5'- 엔도뉴클레이즈 활성화 정도에 영향을 주는 PCR 증폭 산물의 말단으로부터 프로브의 혼성화 결합 위치까지의 거리 확인 시험
5-말단이 들뜸 구조를 갖는 프로브가 PCR 증폭산물의 말단에 위치할 때, 말단에서 거리가 Taq DNA 폴리머레이즈의 5-뉴클레이즈 활성에 영향을 주는지 확인하기 위한 시험이다. NSTS/sybr-green 프로브 및 NSTS/taqman 프로브가 시험에 사용되었다. 각각의 후방 프라이머와 프로브는 고정시키고, 전방 프라이머를 PCR 증폭산물의 3'-말단 방향으로 이동시켜 시험하였다. 전방 프라이머 5-말단에서 혼성화 결합되어 있는 프로브의 5-말단 들뜸 구조까지의 거리를 기준으로 하였으며, NSTS/sybr-green 프로브의 경우에는 23 염기, 26 염기, 28 염기, 30 염기에 해당하는 전방 프라이머 (도 6)를 사용하였으며, NSTS/taqman 프로브는 27 염기, 32 염기, 34 염기, 38 염기이다 (도 7). Mis+2 프로브는 Mis+0의 5'-말단에 임의의 2 염기를 추가하여 합성하였다.
* SYBR Green 시험용 프라이머와 프로브
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
프로브
Mis+0 : 5'-ggtatcagttcatccagcgc-3'
Mis+2 : 5'-atggtatcagttcatccagcgc-3'
① 23 염기 전방 프라이머 : 5'-gccgcgctggatgaactgatac-3'
② 26 염기 전방 프라이머 : 5'-gcagccgcgctggatgaactga-3'
③ 28 염기 전방 프라이머 : 5'-aagcagccgcgctggatgaact-3'
④ 30 염기 전방 프라이머 : 5'-caaagcagccgcgctggatgaa-3'
* 바깥쪽 TaqMan 프로브 시험용 프라이머와 프로브
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
프로브
Mis+0 : 5'-FAM-cgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
Mis+2 : 5'-FAM-cacgatatattcactcagcaaccccg-TAMRA-3'
① 27 염기 전방 프라이머 : 5'-taccggggttgctgagtgaatata-3'
② 32 염기 전방 프라이머 : 5'-actgataccggggttgctgagt-3'
③ 34 염기 전방 프라이머 : 5'-gaactgataccggggttgctga-3'
④ 38 염기 전방 프라이머 : 5'-ggatgaactgataccggggttg-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 - 60℃, 30초 - 72℃, 30초 (35회 반복)
* PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul(100 pg), 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul), SYBR Green(10X) 1 ul 및 3.1X qPCRMix 6.45 ul 와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20 ul로 맞추어 사용하였다.
NSTS/sybr-green 프로브에서는 전방 프라이머 5-말단에서 혼성화 결합되어 있는 프로브의 5-말단까지의 거리가 30 염기, NSTS/taqman 프로브에서는 34 염기에서부터 Mis+2 프로브의 PCR 증폭 곡선이 증가하였다 (도 6, 7). 전방 프라이머 5-말단에서 혼성화 결합되어 있는 프로브의 5-말단까지의 거리가 NSTS 프로브의 5플랩 구조 인식에 있어서 중요한 요소임을 확인할 수 있었다. 이는 폴리머레이즈의 5' 뉴클레이즈 활성 중 5' 플랩을 인식하여 절단하는 FEN 활성이 5' 플랩의 말단에서부터 일정한 길이(약 28-34 염기) 이상이 요구되며, 그 이하의 경우 FEN의 작용이 원활하지 못하기 때문으로 추정된다. 또한, NSTS를 이용한 SNP 등의 돌연변이 부위를 구별하기 위한 진단용 프라이머/프로브의 설계시 두 5-말단에서 혼성화 결합되어 있는 프로브의 5'-말단까지 거리를 적절하게 (약 28-30 염기 이내) 유지하여야, 목적하는 구별이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 5: SNP 타이핑을 위한 프로브 쌍 테스트
NSTS 프로브에 대한 폴리머레이즈의 FEN 활성 차이를 이용하여 프로브의 5'-말단 구조에 변화를 주어 SNP 타이핑에 적용하고자 하였다. 변이가 예상되는 염기 (SNP 포인트)를 중심으로 SNP 존재를 가정하여 NSTS/dsp 프로브의 쌍을 만들어 시험하였다.
① 프로브의 5'-말단 구조는 들뜸 구조가 없는 프로브(Mis+0)와 1개의 염기가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+1), ② 1개의 염기가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+1)와 2개의 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+2), ③ 5-말단의 2번째 염기 1개가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+2(1))와 2개의 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+2), ④ 5-말단의 3번째 염기 1개가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+3(2))와 5-말단의 2번째와 3번째 염기가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+3(1))를 사용하였다 (도 8).
* 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머 : 5'-TAMRA-gccgcgctggatgaactgatac-3'
후방 프라이머 : 5'-cggcctgaacagtgagcgaag-3'
① 프로브 세트
ⓐ Mis+0 : 5'-ccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
ⓑ Mis+1 : 5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
② 프로브 세트
ⓐ Mis+1 : 5'-tccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
ⓑ Mis+2 : 5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
③ 프로브 세트
ⓐ Mis+2(1) : 5'-ctccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
ⓑ Mis+2 : 5'-atccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
④ 프로브 세트
ⓐ Mis+3(2) : 5'-actccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
ⓑ Mis+3(1) : 5'-agaccggtatcagttcatccagcgc-FAM-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 - 60℃, 30초 - 72℃, 30초 (40회 반복)
* PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul (100 pg), 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(10 pmol/ul) 및 3.1x qPCRMix 6.45 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량이 20 ul가 되도록 하여 사용하였다.
프로브의 5-말단의 들뜸 구조에 따라서 나타나는 Taq DNA 폴리머레이즈의 5' FEN 활성차이를 이용해 SNP 타이핑 시에 나타날 수 있는 구조의 차이를 예상하여 상기의 4개의 프로브 쌍으로 구성할 수 있다. 이를 이용한 시험 결과, 각 세트의 ⓑ 프로브가 ⓐ 프로브와 비교하여 Ct값이 작거나 PCR 증폭곡선이 증가하지 않음을 확인할 수 있었다. 특히 ②, ③, ④와 같은 프로브 세트는 프로브에 따라 PCR 증폭 곡선이 온/오프로 구분되므로 SNP 타이핑에 적용하여 해당 대립유전자를 판독하는데 명확하게 이용될 수 있는 장점을 보인다.
실시예 6: NSTS / sybr - green 의 다양한 프로브 쌍을 이용한 SNP 타이핑 적용 검증
NSTS/sybr-green 프로브의 5'-말단 구조에 변화를 주어 SNP 타이핑에 SYBR Green을 사용하여 실질적인 적용 가능성 여부를 확인하였다. 람다 DNA를 주형으로 하여 임의의 SNP 포인트를 지정하고, 5'-말단 구조 변화에 따른 DSP 프로브 쌍을 정하였다. 사용한 DSP 프로브 쌍은 Mis+1와 Mis+2 (도 9a), Mis+3(2)와 Mis+3(1) (도 9b), Mis+2(1)와 Mis+2 (도 9c)이다.
* 시험용 프라이머와 프로브(도 9a)
전방 프라이머 : 5'-cgctgtggctgatttcgataacc-3'
후방 프라이머 : 5'-tggctgacgttcccatgtacc-3'
프로브 쌍
Mis+1 : 5'-taggttatcgaaatcagccac-3'
Mis+2 : 5'-tcggttatcgaaatcagccac-3'
* 시험용 프라이머와 프로브(도 9b)
전방 프라이머 : 5'-tctcggaatgcatcgctcagtg-3'
후방 프라이머 : 5'-atgctcaatggatacatagacgagg-3'
프로브 쌍
Mis+3(2) : 5'-agctcaacactgagcgatgcattc-3'
Mis+3(1) : 5'-aactcaacactgagcgatgcattc-3'
* 시험용 프라이머와 프로브(도 9c)
전방 프라이머 : 5'-ctgctgggtgtttatgcctactt-3'
후방 프라이머 : 5'-aagttctcggcatcaccatccg-3'
프로브 쌍
Mis+2(1) : 5'-cgataaagtaggcataaacaccca-3'
Mis+2 : 5'-tgataaagtaggcataaacaccca-3'
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 - 65℃, 30초 - 72℃, 30초 (40회 반복)
* PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul(100 pg), 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(5 pmol/ul), SYBR Green(10X)1 ul 및 3.1x qPCRMix 6.45 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량이 20 ul로 되도록 하여 사용하였다.
SYBR Green을 이용한 PCR 증폭 곡선 확인을 통해 임의로 정한 SNP 포인트가 프로브의 5'-말단과 일치 혹은 불일치로 인해 만들어지는 들뜸 구조에 따라 PCR 증폭 곡선의 증가와 증가하지 않음으로 구분되는 것을 확인하였다. SNP 포인트가 불일치하는 경우에는 PCR 증폭 곡선이 전혀 증가하지 않음으로써 SNP 타이핑을 명확히 구분할 수 있다. 이로써 본 발명의 방법을 이용하면 값비싼 안료 프로브를 사용하지 않고, 경제적으로 사용가능한 SYBR Green 등의 DNA 이중결합에 결합하는 삽입제 (intercalating agents) 혹은 표면결합제 (surface binding agents)를 사용하여 간편한 SNP 타이핑 적용이 가능함을 확인하였다.
실시예 7: 실시간 중합효소 연쇄반응시 어닐링 온도 차이에 영향을 받지 않는 NSTS 프로브 작용의 안정성 확인 시험
효소 작용의 반응 특이성에 의해 구분되는 NSTS 프로브가 실시간 중합효소 연쇄반응에서 어닐링 온도에 어떠한 영향을 받는지 확인하기 위한 시험이다. NSTS/sybr-green 프로브를 이용하여 나머지 PCR 조건은 동일하게 하고, 어닐링 온도만 변화를 주었으며, 프로브는 5-말단의 3번째 염기 1개가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+3(2))와 5-말단의 1번째와 3번째 염기가 들뜸 구조를 갖는 프로브(Mis+3(1))를 사용하였다
* DSP 프로브 시험용 프라이머와 프로브
전방 프라이머 1a : 5-TGATGGAGCAGATGAAGATGCTCG-3
후방 프라이머 1as: 5-TCCAGCTCACTCTCAATGGTGG-3
프로브 쌍
Mis+3(2)/1 : 5-GTCTCGAGCATCTTCATCTGCTC-3
Mis+3(1)/1 : 5-TTCTCGAGCATCTTCATCTGCTC-3
전방 프라이머 2a : 5-CGCTGTGGCTGATTTCGATAACC-3
후방 프라이머 2as: 5-TGGCTGACGTTCCCATGTACC-3
프로브 쌍
Mis+3(2)/2 : 5-GATCAGGTTATCGAAATCAGCCAC-3
Mis+3(1)/2 : 5-AATCAGGTTATCGAAATCAGCCAC-3
전방 프라이머 3a : 5-GTTCCTGACCGTGTGGCTTAC-3
후방 프라이머 3as: 5-ATCCCCATACGCGCATTTCGTAG-3
프로브 쌍
Mis+3(2)/3 : 5-GGACAGGTAAGCCACACGGTCAG-3
Mis+3(1)/3 : 5-TGACAGGTAAGCCACACGGTCAG-3
전방 프라이머 4a : 5-CTGCTGGGTGTTTATGCCTACTT-3
후방 프라이머 4as: 5-AAGTTCTCGGCATCACCATCCG-3
프로브 쌍
Mis+3(2)/4 : 5-TCGATAAAGTAGGCATAAACACCCA-3
Mis+3(1)/4 : 5-GCGATAAAGTAGGCATAAACACCC-3
전방 프라이머 5a : 5-CCACACGGCATTCGGCAGATAT-3
후방 프라이머 5as: 5-AGCGCCTGTTTCTTAATCACCATA-3
프로브 쌍
Mis+3(2)/5 : 5-GGTGGAATATCTGCCGAATGCCGTG-3
Mis+3(1)/5 : 5-CGTGGAATATCTGCCGAATGCCGT-3
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건 1
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 -65℃, 30초 - 72℃, 30초(40회 반복)
* 실시간 중합효소 연쇄반응 조건 2
95℃, 5분(1회)
95℃, 15초 -54℃, 30초 - 72℃, 30초(40회 반복)
* PCR 반응물 조성
람다 DNA 1 ul(100 pg), 2종류 프라이머와 프로브 각 1 ul(5 pmol/ul) 및 5x qPCRMix (50 mM Tris, pH 9.0, 7.5 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1 M 메틸 글루코스, 500 mM (NH4)2SO4, 5 mM dNTPs, 5 u Taq DNA 폴리머레이즈, (주)제노텍, 한국) 4 ul와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20 ul로 사용.
어닐링 온도에 10℃ 이상의 변화를 주어 PCR을 수행하였으나, 도 10에서 알 수 있듯이 Ct 값에서 큰 차이를 보이지 않았으며, 타겟-특이적 프로브의 PCR 증폭곡선이 온도변화에 상관없이 명확히 구분됨을 확인하였다. 효소에 의한 반응 특이성에 의해 구분성을 보이는 NSTS의 알릴-특이적 프로브의 작용이 PCR 온도에 민감하지 않음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 본 발명의 방법이 여러 종류의 SNP의 동시 분석에 효과적임을 말해준다.
<110> Genotech Corp. <120> Mutant Detection Method by Real-Time Polymerase Chain Reaction using DNA polymerase in which 5'-flap endonuclease activity is inhibited <130> Genotech-SNPtyping <160> 55 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gccgcgctgg atgaactgat ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 ccggtatcag ttcatccagc gc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggcctgaac agtgagcgaa g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 tccggtatca gttcatccag cgc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 atccggtatc agttcatcca gcgc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 catccggtat cagttcatcc agcgc 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 taccggggtt gctgagtgaa tata 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cggcctgaac agtgagcgaa g 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 cgatatattc actcagcaac cccg 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 10 acgatatatt cactcagcaa ccccg 25 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 11 cacgatatat tcactcagca accccg 26 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 ggtatcagtt catccagcgc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 atggtatcag ttcatccagc gc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcagccgcgc tggatgaact ga 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagcagccgc gctggatgaa ct 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 caaagcagcc gcgctggatg aa 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 actgataccg gggttgctga gt 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gaactgatac cggggttgct ga 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggatgaactg ataccggggt tg 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 tccggtatca gttcatccag cgc 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 ctccggtatc agttcatcca gcgc 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 actccggtat cagttcatcc agcgc 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 23 agaccggtat cagttcatcc agcgc 25 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgctgtggct gatttcgata acc 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tggctgacgt tcccatgtac c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 taggttatcg aaatcagcca c 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 tcggttatcg aaatcagcca c 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tctcggaatg catcgctcag tg 22 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atgctcaatg gatacataga cgagg 25 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 agctcaacac tgagcgatgc attc 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 31 aactcaacac tgagcgatgc attc 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctgctgggtg tttatgccta ctt 23 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aagttctcgg catcaccatc cg 22 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 34 cgataaagta ggcataaaca ccca 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> 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Claims (17)

  1. DNA 폴리머레이즈를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법에 있어서,
    중합효소 연쇄반응 산물과 짝을 이루는 프로브의 5'-말단이 유전자 변이에 의해 2 염기 이상의 연속적 또는 비연속적 들뜸 구조를 갖고, 상기 프로브의 5'-말단이 중합효소 연쇄반응 산물의 5'-말단으로부터 24-38 염기에 위치하도록 하여, 상기 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 작동하지 않도록 하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자를 검사하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 DNA 폴리머레이즈는 내열성 DNA 폴리머레이즈임을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    검사 대상 돌연변이 유전자는 단일염기다형성 (single point nucleotide polymorphisms), 1 염기 이상의 결실, 치환 및 유입 중 한 가지 이상을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  4. 주형 DNA, 전방 프라이머, 후방 프라이머, 프로브 및 내열성 DNA 폴리머레이즈를 포함하는 유전자 돌연변이 검사용 중합효소 연쇄반응 킷트에 있어서,
    상기 프로브는 5'-말단이 2 염기 이상의 연속적 또는 비연속적 들뜸 구조를 갖고, 상기 프로브의 5'-말단이 중합효소 연쇄반응 산물의 5'-말단으로부터 24-38 염기에 위치하도록 하여, 상기 내열성 DNA 폴리머레이즈의 5'-플랩 엔도뉴클레이즈 활성이 작동하지 않도록 함을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 프로브는 리포터 안료와 퀀처 안료가 동시에 수식되어 있는 듀얼 레이블 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 프로브의 3' 말단에는 리포터 안료가, 상기 전방 프라이머의 5' 말단에는 퀀처 안료가 각각 수식되어 있음을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 프로브는 비수식 프로브임을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 비수식 프로브를 사용하는 경우, DNA 이중결합에 결합하여 형광을 내는 삽입제 (intercalating agents) 또는 DNA 이중결합의 표면에 결합하여 형광을 내는 표면결합제 (surface binding agents)를 부가하는 것을 특징으로 하는 유전자 돌연변이 검사용 실시간 중합효소 연쇄반응 킷트.
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