KR101164172B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 아만타딘 내성 인플루엔자 ａ 바이러스 변이체의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다. 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응에서 인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질 인코딩 염기서열 중 아만타딘 내성을 나타내는 단일염기 변이를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 사용한다. 따라서 본 발명은 아만타딘 내성을 나타내는 인플루엔자 A 바이러스의 변이체를 높은 정확도와 민감도를 가지고 신속하고 대규모로 검출할 수 있는 분자생물학적 기법을 제공한다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 아만타딘 내성 인플루엔자 Ａ 바이러스 변이체의 검출 방법{Method for Detecting Amantadine Resistant Influenza A Virus Using Real-Time Polymerase Chain Reaction}

본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스의 검출 방법 및 이 방법에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다.

인플루엔자(influenza) A 바이러스는 인간에 있어서 심각한 사망 및 사상자를 발생시키는 급성 호흡기 감염질환 주요 원인이 된다. 이로 인한 연간 사망률은 매 30-40년 마다 발생하는 주요한 전 세계적인 유행병의 것 보다 높게 나타나, 주로 온대성 또는 냉대성 기후 지역에서 겨울철 유행병을 일으킨다. 인플루엔자 시즌은 북반구에서는 12월에서 3월까지 지속되며 남반구에서는 6월에서 9월까지 지속되고, 우리나라 경우 대부분 겨울철, 즉 11월에서 이듬해 3월까지이다. 인플루엔자 유행병은 모든 연령 그룹에 영향을 미친다. 유행병의 경우에서 질병 발생율은 약 10-20％이어서, 미국에서는 매년 5천 만명 정도가 질환에 걸리고, 47,200명의 사망자가 발생하며, 유럽에서도 이와 비슷한 수준이다(Cox et al., 1983; Monto, 1999; Strikas et al., 2002). 인플루엔자 감염율은 어린이에게서 가장 높지만, 합병증 발생 및 사망률은 65세 이상의 성인과 만성 질환을 갖고 있는 환자에게서 대부분 발생한다(Barker, 1986; Monto and Kioumehr, 1975).

인플루엔자 A 바이러스는 오르토믹소비리데(Orthomyxoviridae) 패밀리에 속하는 네가티브 센스 단일쇄 RNA 바이러스로서, 8개의 단일쇄 세그먼트로 이루어진 지놈을 갖고 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 표면 당단백질인 히마글루티닌(haemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 항원 특성에 기초하여 그 서브타입이 분류된다. 인플루엔자 A/H3N2 및 A/H1N1 서브타입은 현재 인간에게 감염을 일으키고 있는 주요한 서브타입이다(Nelson and Holmes, 2007; Webster et al., 1992). 인플루엔자 A H1N1 및 H2N2의 인간 서브타입은 급성 호흡기 질환을 일으키고 가장 최근을 제외한 현 세기에서의 모든 인플루엔자 유행병 및 대유행에 관련되어 있다. 그러나, 1968년에 H3 서브타입이 발생된 이후로, H3N2 바이러스의 전세계적 유행은 가장 심각한 바이러스 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다.

아만타딘(amantadine)은 인플루엔자 A 감염의 예방 및 치료에 사용되어 왔다(Harper et al., 2004). 아만타딘은 가격이 싸고 쉽게 얻을 수 있어서 오랜 기간 동안 인플루엔자 A 감염 치료제로 사용되어 왔으며 분리된 바이러스 중에서 아만타딘 내성의 발생 빈도도 수 십년전 까지는 그리 높지 않았다. 아만타딘은 아다만탄(adamantane)의 화학적 유도체이고, 인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질의 이온 채널 활성을 블로킹함으로써 바이러스 언코팅(uncoating)을 차단하는 기작을 통해 인플루엔자 A 바이러스의 복제(replication)를 억제한다고 알려져왔다(Holsinger et al., 1994; Pinto et al., 1992). M2 단백질은 RNA 지놈 세그먼트 7로부터 유래된 스플라이싱된 mRNA에 의해 코딩된다. 항바이러스 약물 아만타딘의 타겟인 인플루엔자 바이러스 M2 단백질은 언코팅(uncoating) 및 바이러스 성숙 동안에 트랜스-골지체 뿐만 아니라 비리온(virion)내에서 pH를 변화시키는 역할을 하는 산(acid)-활성화 프로톤-전도성 이온 채널을 형성한다. M2 단백질의 채널 활성은 아만타딘에 의해 차단된다. M2 단백질의 트랜스막(transmembrane) 도메인을 구성하는 5개의 아미노산 잔기 중에서 하나를 치환시키는 변이(26, 27, 30, 31 또는 34번째 위치 아미노산 변이)를 일으키면 아다만틴에 대한 내성이 발생되는 것으로 보고되어 있다(Boivin et al., 2002; Bright et al., 2006; Hay et al., 1986; Shiraishi et al., 2003). 아만타딘-내성은 몇몇 국가에서 거의 100％ 내성에 다다른 A/H3 바이러스에 대해서 특히 확실하게 나타나 있고, A/H1 바이러스에 대한 내성도 최근 증가 추세에 있다(Barr et al., 2007a, b; Bright et al., 2006; Deyde et al., 2007).

가장 최근에, 아만타딘에 대한 내성은 미국내에서 A/H3N2 바이러스의 대부분에서 전개되어, 2008년 내지 2009년의 인플루엔자 발생 시즌에서 특성이 분석된 거의 모든 A/H3N2 바이러스가 아만타딘에 대한 내성을 가졌다(CDC 2009 flu view 2008??2009). 태국에서 아만타딘-내성의 비율은 낮다. 아만타딘 내성 H1N1 변이체의 비율은 매우 낮았지만, 중국에서의 심도 있는 분석에 의하면 아만타딘-내성 H1N1 바이러스의 발생빈도는 2004-2005년 시즌의 28％에서 2550-2006 시즌의 72％로 매우 크게 증가하였다. 아만타딘-내성에 대한 특정 변이는 H3N2 타입에서 31번 위치가 다수를 차지하며, H1N1 타입의 경우 27번 위치에서의 변이가 발생 빈도가 높았다(Saito et al., 2003). 아만타딘-내성 변이체는 인플루엔자 바이러스에서 교차-내성(cross-resistant)를 가지며 손상에 대한 증거를 보이지 않는다. 또한, 내성은 약물-투여된 환자에게서 더 용이하게 발생하며 내성 변이체는 전염성이 있다.

여러 선행 문헌들에서 인플루엔자 바이러스 A/H3N2 및 A/H1N1에서의 아만타딘 내성의 변이 위치를 분석하는 다양한 방법들이 보고되어 있다. 많이 이용되는 방법으로는 젤-기초(gel-based) RFLP(restriction fragment length polymorphism) 방법 (Saito et al., 2002), plaque reduction assay (Hall et al., 1987), DNA 시퀀싱 (Masuda et al., 2000), 아만타딘의 존재 또는 부존재하에서 50％ 조직 배양 감염 투여량을 비교하는 바이러스 적정법(Masuda et al., 2000) 등이 있다. 그러나, 아직까지 인플루엔자 바이러스 A/H3N2 및 A/H1N1에서 저비용으로 신속하면서 정확하게 아만타딘 내성 변이체를 검출하는 분자생물학적 방법은 개발되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스에서 치료 약물인 아만타딘(amantadine)에 대한 내성을 갖는 변이체의 신속 정확한 검출 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 아만타딘 내성을 일으킨다고 알려진 M2 단백질 코딩 염기서열 중의 단일염기다형성(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)을 특이적으로 검출할 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응용 프라이머 및 프로브를 디자인하고, 이를 이용하여 변이체 바이러스를 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다: (a) 인플루엔자 A 바이러스의 지놈 RNA를 추출하여 cDNA를 제조하는 단계; (b) 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 서열목록 제 7 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 8 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍과, 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브 및 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및 (c) 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하여 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질 코딩 염기서열의 단일염기변이를 확인하는 단계.

이하에서, 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.

단계 (a): 인플루엔자 A 바이러스의 지놈 RNA를 추출하여 cDNA를 제조하는 단계

본 발명의 방법에서 아만타딘 내성 변이를 확인하고자 하는 인플루엔자 A 바이러스로부터 지놈 RNA (genome RNA)를 추출한다. 바이러스로부터 지놈 핵산의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 행할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 내용은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 바이러스의 지놈 RNA를 분리할 수 있다.

이어서, 분리한 지놈 RNA로부터 cDNA를 제조한다. 지놈 RNA로부터 cDNA의 제조는 당업계에 공지된 역전사(reverse transcription) 방법을 통해 행할 수 있다. 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 인플루엔자 A 바이러스 지놈 RNA로부터 M2 단백질 코딩 염기서열 부위를 cDNA로 역전사 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 인플루엔자 A 바이러스 지놈 RNA로부터 M2 단백질 코딩 염기서열 부위를 cDNA로 역전사하는 반응시에 사용되는 프라이머쌍은 서열목록 제 1 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 2 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍이다.

단계 (b) : 제조한 cDNA 를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계

상기 제조한 cDNA를 주형으로 하고, 인플루엔자 A 바이러스의 아만타딘 내성을 일으키는 단일염기변이 포함 부위를 증폭할 수 있도록 디자인된 프라이머쌍(primer pair)과, 아만타딘 내성 단일염기변이를 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인된 프로브(probe)를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5'말단 서열 또는 3'말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 PCR 방법에서 사용되는 프라이머쌍은 서열목록 제 7 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 8 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍이다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위내에서 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter) 형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging) 될 수 있다.

본 발명의 실시간 PCR 방법에서 프로브는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 사용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 실시간 PCR 방법에서 사용되는 프로브는 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브 및 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브이다.

본 발명의 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브는 아만타딘 내성을 갖지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스의 염기서열에 특이적으로 결합하며, 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브는 아만타딘 내성을 갖는 변이형 인플루엔자 A 바이러스의 염기서열에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 PCR에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅(tagging)되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질과 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질은 서로 다른 파장의 범위를 갖는 물질이다.

본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어, 리포터 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 또는 VIC를 사용할 수 있으며, 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 또는 ROX를 사용할 수 있다.

본 발명의 프로브는 인플루엔자 A 바이러스의 아만타딘 내성 관련 M2 단백질 코딩 염기서열 중의 단일염기변이에 따라 타겟 서열에 특이적으로 혼성화되지만, 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광을 방출한다.

본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

한편, 유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.

단계 (c) : 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하는 단계

상기 단계 (b)에서 행한 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 방출을 분석하여 인플루엔자 A의 아만타닌 내성 변이체 여부를 판단한다. 이러한 분석 및 판단은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 야생형 인플루엔자 A 바이러스를 검출하도록 디자인된 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 야생형 인플루엔자 A 바이러스로 판단하고, 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 아만타딘 내성 변이형 인플루엔자 A 바이러스로 판단한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제 7 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 8 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및 (b) 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브 및 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브를 포함하는 아만타딘(amantadine) 내성 인플루엔자 A 바이러스 검출용 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 키트는 (a) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (b) DNA 중합효소; 및 (c) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.

본 발명의 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

이상에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다. 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응에서 인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질 인코딩 염기서열 중 아만타딘 내성을 나타내는 단일염기 변이를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 사용한다. 따라서 본 발명은 아만타딘 내성을 나타내는 인플루엔자 A 바이러스의 변이체를 높은 정확도와 민감도를 가지고 신속하고 대규모로 검출할 수 있는 분자생물학적 기법을 제공한다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 프로브를 이용한 SNP 검출방법(대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응)의 원리를 보여준다.
도 1a는 가수분해 프로브를 이용한 SNP 검출의 원리를 보여준다. 프로브가 온전한 상태로 존재하면, 켄쳐(quencher)는 리포터의 형광 시그널을 켄칭(quenching) 한다. A/G SNP: G 염기가 존재하는 경우, 즉 상보적 주형내에서 C 염기가 존재하는 경우, C 염기에 상보적인 VIC 프로브가 Taq 중합효소에 의한 PCR 동안에 가수분해된다. VIC 리포터는 근접한 위치의 켄쳐에 의해 더 이상 켄칭되지 않게 되고 측정 가능한 시그널을 방출한다. A 염기가 존재하는 경우, 즉 상보적 주형내에서 T 염기가 존재하는 경우, VIC 프로브는 가수분해되는 일 없이 DNA 가닥으로부터 제거된다. 반면 FAM 프로브는 T 염기에 상보적이므로, 앞서 설명된 방식과 동일한 방식으로 주형에 상보적인 T 염기가 존재하는 경우에만 형광 시그널을 방출한다.
도 1b에서 형광이 상이한 대립유전자형에 따라 다른 시그널을 방출하는 것을 보여준다.
도 2는 TaqMan MGB 프로브를 사용하여 M2 단백질 변이의 유전자형을 분석한 대립유전자 구별 실시간 PCR에 결과를 보여준다. 플롯은 주형 없는 대조군(NTC, squares), 대립유전자 A (diamonds) 및 대립유전자 G (circle)을 각각 포함한다.
도 3는 인플루엔자 A/H3N2/Ser31Asn에 대한 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응(real time-PCR) 분석방법의 검출한계를 결정하는 표준곡선을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

1. 바이러스

159주의 인플루엔자 A/H3N2 및 A/H1N1 바이러스를 서울시의 보건환경연구원으로부터 분양받았고, 이 바이러스들을 MDCK 세포내에서 증식시키면서 2 또는 3 계대(passage) 후에 CPE(cytopathic effect)를 관찰하여 증식 양상을 관찰하였다.

2. RNA 추출

250 ㎕의 바이러스 배양 상등액을 0.7㎖의 TRI 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)과 0.2㎖의 클로로포름/이소아밀알코올(24:1)과 혼합하였다. 혼합물을 14,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상층의 수성상으로부터 RNA를 분리하였다. RNA는 동등한 부피의 100％의 이소프로판올을 사용하여 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전시켰다. 침전물은 70％ 에탄올로 세정하고 최종적으로 20 ㎕의 RNase-제거된 증류수에 용해시켰다.

3. cDNA의 제조

cDNA는 AMV 역전사 효소(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 바이러스 RNA로부터 제조하였다. 20 ㎕ 혼합물은 4 ㎕ AMV 역전사효소 5X 반응완충액, 5 U/㎕의 10 mM dNTP, 5 ㎕의 RNA 역전사효소(RNA precipitant reverse transcriptase), 10 pM의 각 프라이머(역방향 프라이머 M2R 및 전방향 프라이머 M2F 서열은 표 1에 표시함)를 포함하도록 제조하였다. 반응을 42℃에서 60분간 수행하였고 생성물은 -20℃에서 다음 실험을 수행하기 전까지 보관하였다.

4. 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)

5 ㎕의 cDNA를 사용하여, 총 20 ㎕의 PCR 용액을 제조하였고, 반응혼합액은 10 mM dNTP, 10 pM의 각각의 프라이머, 10X 반응 완충액 및 5U/㎕ Taq DNA 중합효소(Beams, Seoul, Korea)를 포함하도록 하였다. PCR은 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여, 94℃에서 3분간 인큐베이션하여 개시하였고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 35 사이클 수행한 후, 72℃에서 7분간의 최종 연장 반응을 수행하였다. 증폭완료 후에, PCR 산물을 에티듐브로마이드(ethidium bromide) 염색한 후 1.2％ 아가로오스 젤 전기영동하고, GelDoc XR image-analysis system (BioRad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 분석하였다. 인플루엔자의 M2 단백질 유전자를 검출하기 위해 사용한 프라이머는 아래 표 1 [M2 단백질 유전자에서 RT-PCR에 사용된 프라이머 서열]에 나타내었다.

프라이머	서열 (5' → 3')	증폭산물 크기
M2F	GCT AGT CAG GCC AGG CAA ATG (서열목록 제 1 서열)	340 bp
M2R	ACT GTC GTC AGC ATC CAC AG (서열목록 제 2 서열)

5. 서열분석

분석한 유전자 서열과 참조 M2 단백질 서열을 조합하고, EditSeq, SeqMan 3 in Lasergene software (DNASTAR, Madison, WI, USA)를 사용하여 편집한 후, CLUSTAL X ver. 1.81 (Thompson et al., 1997)를 사용하여 정렬하였다. 내성을 부여하는 것으로 알려진 변이가 존재하는 지를 결정하기 위해 서열을 분석하였다. 하기 표 2 [M2 단백질 유전자 변이부분 뉴클레오타이드의 비교 정렬의 예] 참조.

6. 인플루엔자 A/H3N1 및 A/H1N1 바이러스에서 아만타딘 내성 점 돌연변이 검출을 위한 대립유전자형 분석

6.1. 타이핑(Typing)

포지티브 샘플은 서브타입 H3 및 H1에 대한 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 RT-PCR에 의해 서브 타이핑을 수행하였다(표 3; 타이핑용 프라이머 서열). 증폭 조건은 다음과 같았다: 42℃에서 60분; 95℃에서 3분; (95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 연장)의 35 사이클. 증폭된 DNA 단편을 GelDoc XR image-analysis system (BioRad)를 사용하여 1.2％ 아가로즈젤상에서 분석하였다.

프라이머	서열 (5' → 3')	증폭산물크기
AH1-F	ACA GTG ACA CAC TCT GTC AA (서열목록 제 3 서열)	800 bp
AH1-R	ACA CTC TCC TAT TGT GAC TGG G (서열목록 제 4 서열)
AH3-F	TGG GAG ACC CTC ATT GTG ATG (서열목록 제 5 서열)	600 bp
AH3-R	TTG GGA ATG CTT CCA TTT GG (서열목록 제 6 서열)

6.2. 프라이머 및 프로브 (primer and probe)

159주의 인플루엔자 바이러스 A/H3N2 및 A/H1N1으로부터의 M2 단백질 유전자 서열과 NCBI GenBank의 참조 M2 단백질 유전자 서열에 대해 뉴클레오타이드 정렬을 수행하여 야생형(G)과 변이형(A)을 구분할 수 있는 대립유전자(allele)를 확인할 수 있었다. 대립유전자의 위치는 M2 단백질 유전자 서열의 보존된 부위내에서 존재하고 있었기 때문에, TaqMan 프로브 및 프라이머를 디자인하기가 용이하였다. Primer express software를 이용하여 2개의 프라이머 및 2개의 형광염료-표지된 프로브를 디자인한 후 제조하였다. 전방향 프라이머 SNP-IV-F 및 역방향 프라이머 SNP-IV-R는 변형을 가하지 않은 PCR 프라이머 원래 형태로 제조하여 사용하였다(표 4; 대립유전자 구별 실시간 PCR의 증폭용 프라이머 및 프로브 서열).

프로브는 다음과 같이 2가지 종류를 사용하였다; PROBE 1은 대립유전자 G 개체를 검출하기 위해 5'말단에 VIC 리포터 염료로 표지된 것으로서 야생형 프로브(wild type probe)로 작용하고, PROBE 2는 대립유전자 A 개체를 특이적으로 검출하기 위해 5'말단에서 FAM으로 표지한 것으로서, 아만타딘 내성 프로브(amantadine resistance probe)이었다. 2가지 종류의 프로브 모두 NFQ(non-fluorescent quencher dye)와 MGB(minor groove binding) 그룹을 프로브 3'-말단에 포함하였다. NFQ 염료는 프로브가 PCR 동안에 Taq 중합효소의 exonuclease 활성에 의해 파괴되기까지 VIC 또는 FAM 형광의 발생을 억제하는 반면, MGBNF 그룹은 매칭된 이중쇄의 안정성을 증가시시킴으로써, 더욱 정확하게 대립유전자를 구분할 수 있게 한다.

프라이머	서열 (5' → 3')	증폭산물 크기
SNP-IV-F	GCAGATGCAACGATTCAAGTGA (서열목록 제 7 서열)	71 bp
SNP-IV-R	CAATATCARGTGCAMRATCCCAA (서열목록 제 8 서열)
PROBE 1(VIC)	CCGCRA G TATMATT (서열목록 제 9 서열)
PROBE 2(FAM)	CCGCRA A TATMATTG (서열목록 제 10 서열)

6.3. 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)

각 PCR 반응은 cDNA (1 ㎕), MasterMix DNA 키트, 200 nM의 각각의 프라이머 및 500 nM의 각각의 프로브를 포함하고, 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수로 총 부피 20 ㎕로 맞추어 제조한 반응용액에서 행하였다. 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수 1 ㎕는 블랭크 음성 대조군으로 사용하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)은 DNA thermal cycler (7300 Real Time PCR system-Applied Biosystems)를 사용하여 95℃에서 10분; 95℃에서 10초 및 60℃에서 45초의 40 사이클의 온도 사이클로 행하였다. 각각 대립유전자 G 및 A를 나타내는 VIC 및 FAM 리포터 시그널의 증가 여부는 7300 System software를 사용하여 실시간으로 모니터링하였다. 각각의 분석결과에 대해, 음성 대조군의 형광값을 평균화하고 이를 기초 자료(raw data)로부터 차감하여 백그라운드 형광에 대해 보정하였다. 각각의 염료에 대한 형광의 말단 값을 2원 분산 플롯에서 각각에 대해 플롯팅하였다. 플롯팅 결과 측정 샘플들이 명확하게 구분되는 군집을 이루고 있있고, 대립유전자 A 및 G를 쉽게 스코어링할 수 있음을 확인하였다.

6.4. 표준곡선( standard curve )

실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 분석을 이용하여 대립유전자 구별의 검출 한계를 조사하기 위해, H3N2 바이러스 cDNA의 10배 희석의 연속물(2.87 - 2.87 X 10^-4 ng)을 제조하였다. 프라이머쌍(SNP-IV-F 및 SNP-IV-R)으로 행하는 증폭에서의 표준곡선은 샘플내에서 Ser31Asn 대립유전자의 양을 측정하는데 사용하였고, 실험은 3회 반복 수행하였다. 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응당 분석 선형성 및 분석 감도는 각각의 타겟에 대해 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응을 3회 행하여 결정하였다.

실험결과

1. M2 단백질 유전자내에서 변이의 확인

127주의 H3N2 서브타입 및 32주의 H1N1 서브타입으로 이루어진 총 159주의 인플루엔자 A 바이러스에 대해 M2 단백질 유전자의 아만타딘 내성 변이를 조사하였다. 그 결과는 표 5 (인플루엔자 A(H3/N2 및 H1N1)에서 대립유전자 A(아만타딘 내성형) 및 대립유전자 G(야생형)의 분포)에 나타내었다.

유전자형	H3N2	H1N1	총합
M2 대립유전자 G	94(74.0)	14(43.7)	108(67.9)
M2 대립유전자 A	33(26.0)	18(56.3)	51(32.1)
총 합	127(100)	32(100)	159(100)

2. 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응

도 1a 및 도 1b에는 본 발명의 프로브를 이용한 SNP 검출방법, 즉 대립유전자 구별 실시간 중합효소연쇄반응의 원리를 설명해주는 도면이 도시되어 있다. 구체적으로 설명하면, 도 1a는 가수분해 프로브를 이용한 SNP 검출의 원리를 보여주는 바, 프로브가 온전한 상태로 존재하면, 켄쳐(quencher)는 리포터의 형광 시그널을 켄칭(quenching) 한다. A/G SNP: G 염기가 존재하는 경우, 즉 상보적 주형내에서 C 염기가 존재하는 경우, C 염기에 상보적인 VIC 프로브가 Taq 중합효소에 의한 PCR 동안에 가수분해된다. VIC 리포터는 근접한 위치의 켄쳐에 의해 더 이상 켄칭되지 않게 되고 측정 가능한 시그널을 방출한다. A 염기가 존재하는 경우, 즉 상보적 주형내에서 T 염기가 존재하는 경우, VIC 프로브는 가수분해되는 일 없이 DNA 가닥으로부터 제거된다. 반면 FAM 프로브는 T 염기에 상보적이므로, 앞서 설명된 방식과 동일한 방식으로 주형에 상보적인 T 염기가 존재하는 경우에만 형광 시그널을 방출한다. 도 1b는 형광은 상이한 대립유전자형에 따라 다른 시그널을 방출하는 것을 보여준다.

TaqMan 분석은 어떠한 대립유전자가 존재하는지를 결정하기 위해 형광 염료-표지된 프로브를 사용하는 대립유전자 구별 PCR 방법이다(Livak, 1999). A 변이로부터 얻어진 cDNA를 테스트하는 경우, FAM-표지된 대립유전자 A 선택적 프로브만이 어닐링되고, 어닐링된 프로브는 Taq 중합효소의 핵산분해 활성에 의해 분해되고 FAM 형광이 증가되는 결과를 발생시킨다. 유사한 작용을 통해, G 변이로부터 얻어지는 cDNA를 테스트하는 경우 VIC-표지된 대립유전자 G 선택적 프로브에 의해 VIC 형광이 증가된다. 이들 2개의 염료들로부터 생성되는 상대적 형광을 PCR 반응 동안 백그라운드에 대해 보정된 말단 값(endpoint value)으로 실시간 측정하고, 2원 변이 분산 플롯에서 각 값들에 대해 플롯팅하였다.

PCR 산물은 7300 real time PCR system (Applied Biosystems)에 의해 검출하였다. PCR 동안 형광 Taqman 프로브는 주형 cDNA상의 전방향 및 역방향 프라이머 자리 사이의 상보적 서열에 특이적으로 어닐링되고, cDNA 중합효소의 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해 분해된다. 일단 켄쳐(quencher)로부터 분리되면, 리포터 염료는 형광을 방출하고, 이는 ABI 7300 system에 의해 기록된다. 형광 시그날을 정량하고 비교하여, 기계의 소프트웨어가 플레이트상의 각 샘플의 대립유전자 함유 여부를 결정하게 된다. 즉, 소프트웨어는 대립유전자 A 형광 및 대립유전자 G 형광 자료에 기초하여 분산 플롯상에 대립유전자 구별 결과를 그래프로 나타내었다(도 2 참조). 즉, M2 야생형 및 ΔM2 (M2의 트랜스-막 도메인내에서의 변이)의 인플루엔자 바이러스 샘플의 분석 결과를 도 2에 나타내었다. M2 야생형 및 변이형 ΔM2 그룹이 2개의 명확한 군집으로 분리되어 있어 분석이 매우 잘 작동한다는 것을 보여준다. 대립유전자 A(다이아몬드), 대립유전자 G(원) 및 결정되지 않은 대립유전자에 대응하는 점들이 구성하는 3개의 각 군집은 플롯내에서 각각의 염료로부터 발생되는 형광을 나타낸다. VIC 샘플로부터의 형광 중의 대부분에서 M2 단백질 유전자는 공통 대립유전자-대립유전자 G를 가질 것으로 예상되었다(108 샘플). FAM 샘플로부터의 형광 중의 대부분에서, M2 단백질 유전자는 한정된 대립유전자-대립유전자 A인 것으로 간주되었다(51 샘플). 양쪽 염료로부터의 비교적 약한 형광이 발생하는 경우(X), 샘플 분석은 실패한 것으로 간주하였다. 모든 대립유전자는 아미노산 치환에 따라 대응하는 한 가지 종류의 변이에 포함되었다.

3. 실시간 중합효소연쇄반응 표준 곡선

인플루엔자 A/H3의 M2 단백질 유전자내에서 세린 → 아스파라진으로의 치환변이(참조 H3N2 인플루엔자 A 바이러스내에서 31번 아미노산 위치의 뉴클레오타이드)를 통해 발생되는 아만타딘 내성 변이는 이러한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 가로지르는 표지된 프로브를 사용한 대립유전자 구별 분석방법에 의해 검출할 수 있었다. 이 분석 방법은 타겟에 대해 0.99 이상의 상관계수(R²-value)를 갖는 -3.49의 기울기를 가져서 분석방법 및 효율적인 증폭을 위한 광범위한 동적 검출 범위를 입증하였다. 인플루엔자 A (H3N2) 서열은 FAM 필터내에서 검출 가능한 형광을 방출하는 아만타딘 내성 표본을 확인하였다. 본 발명의 실험에서 Ct (threshold cycle) 값은 37 보다 작았다(도 3).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 다음의 단계를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 아만타딘 내성 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법:
   (a) 인플루엔자 A 바이러스의 지놈 RNA를 추출하여 M2 단백질 코딩 부위를 포함하는 cDNA를 제조하는 단계,
   (b) 제조한 cDNA를 주형으로 하여, 서열목록 제 7 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 8 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍과, 5'- 말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브 및 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계, 및
   (c) 실시간 중합효소연쇄반응으로부터 발생되는 형광 시그널을 분석하여 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질 코딩 염기서열의 단일염기변이를 확인하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 cDNA의 제조는 인플루엔자 A 바이러스 지놈 RNA의 M2 단백질 코딩 염기서열 부위를 서열목록 제 1 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 2 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 역전사(reverse transcription)하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 및 VIC로 이루어지는 군에서 선택되는 1종의 형광물질인것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 및 ROX로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. (a) 서열목록 제 7 서열을 갖는 프라이머 및 서열목록 제 8 서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및
   (b) 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'- 말단에 형광억제물질이 표지된 서열목록 제 9 서열을 갖는 프로브 및 서열목록 제 10 서열을 갖는 프로브를 포함하는 아만타딘(amantadine) 내성 인플루엔자 A 바이러스 검출용 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 키트.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, Cy5 및 VIC로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 키트.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 댑실 다크 형광억제물질 및 ROX로 이루어지는 군에서 선택되는 물질인 것을 특징으로 하는 키트.
   
8. 제 5 항에 있어서, 상기 키트는 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   

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