KR100993349B1

KR100993349B1 - 지지체에 고정된 ｐｎａ 프로브와 표적핵산의 혼성화 효율또는 특이도를 증가시키기 위한 방법, 조성물 및 키트

Info

Publication number: KR100993349B1
Application number: KR1020080016532A
Authority: KR
Inventors: 박희경; 최재진
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2010-11-10
Also published as: EP2115160A4; WO2008103015A1; KR20080078615A; US20100184030A1; EP2115160B1; JP2010520747A; EP2115160A1; US8252533B2

Abstract

본 발명은 지지체에 고정된 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브와 표적핵산의 혼성화 반응에서 핵산가수분해효소(nuclease)를 이용하여 표적핵산을 단편화하여 표적핵산의 크기를 감소시키거나, PNA 프로브와 미스매치(mismatch)되는 표적핵산을 선별적으로 분해하는 단계를 포함하는, 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 PNA 칩에서 혼성화 반응의 민감도 및 특이도를 증가시켜 단일염기다형성(SNP)을 용이하게 구별할 수 있고, 복잡한 증폭방법 및 전처리 과정을 거치지 않고도 길이가 긴 표적핵산의 분석이 가능하며, 긴 표적핵산에 포함된 여러 개의 SNP나 돌연변이를 한 번의 표적핵산 증폭으로 검출할 수 있다.

PNA, PNA 칩, 마이크로어레이, 핵산가수분해효소, S1 뉴클레아제, 단일염기다형성, 돌연변이

Description

지지체에 고정된 ＰＮＡ 프로브와 표적핵산의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 방법, 조성물 및 키트{Methods, compositions and kits for increasing efficiency or specificity of hybridization between PNA probes immobilized on support and target nucleic acids}

본 발명은 지지체에 고정된(immobilized) 펩티드핵산(peptide nucleic acid, PNA) 프로브의 표적핵산과의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키는 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산의 혼성화 반응에서 핵산가수분해효소(nuclease)를 이용하여 표적핵산을 단편화(fragmentation)하여 표적핵산의 크기를 감소시키거나, PNA 프로브와 미스매치(mismatch)되는 표적핵산을 선별적으로 분해하여, PNA 프로브의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키는 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.

유전자 발현의 차이, 단일염기다형성(SNPs; single nucleotide polymorphisms), 돌연변이 및 병원성 박테리아나 바이러스 등의 질병과 연관된 유전정보들이 밝혀지고 있다.　 이러한 유전정보의 차이나 변이에 의해 개체 간의 차이가 나타나며 유전성 질환의 발병 여부 및 질병에 대한 감수성이 결정된다.　 흔히 사용되는 변이나 유전자 발현 분석방법에는 DNA 서열분석, RFLP(restriction fragment length polymorphism), 대립형질 특이적 PCR(allele specific polymerase chain reaction), 서던 블랏(southern blot) 또는 노던 블랏(northern blot) 방법들이 있다(문헌 [Present and future of rapid and/or highthroughput methods for nucleic acid testing, Gyorgy csako, 2005, Clinica Chimica Acta 1-25]).　 그러나 이들 방법은 많은 시간과 노력, 비용 및 숙련된 기술 등을 필요로 하며, 한 번에 하나의 유전자나 변이 분석만 가능하고 번거로운 젤 전기영동 분석이 수반되어야 하는 한계가 있다.

이에 기존에 사용되던 유전자 분석방법의 단점을 극복할 수 있는 새로운 분석 시스템으로 DNA 칩(chip) 또는 DNA 마이크로어레이 기술이 대두되었다(문헌 [Single nucleotide polymorphism discrimination assisted by improved base stacking hybridization using oligonucleotide microarrays, Wang D et al., 2003, Biotechniques, 35(2), 300-306]).　 DNA 칩은 고체 표면 위에 기지(旣知)의 유전정보를 기반으로 설계된 DNA 프로브들을 고밀도로 고정시킨 칩으로서, 칩 상에서 분석하고자 하는 표적핵산과의 혼성화 반응을 형광을 이용하여 검출하는 방법이다.　 DNA 칩을 이용하면 1회의 실험으로 다양한 유전정보를 분석할 수 있으므로 질병 진단에 매우 유용하다(문헌 [Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip, Kim K et al., 2006, Gynecologic Oncology 100, 38-43]).　 이러한 DNA 칩은 현재까지의 기술수준에서 가장 효율적인 분석 및 진단 방법으로 알려져 있으나, 여전히 아래와 같은 기술적 문제점을 안고 있다:

첫째, DNA 프로브가 생물학적(핵산가수분해효소 등) 및 화학적(산, 염기 등) 안정성이 낮아 DNA 칩 제품의 안정성이 낮다.

둘째, SNP나 돌연변이 등 한 개의 염기서열 차이를 정확하게 구별하기 어려운 경우가 많다.

셋째, 올리고뉴클레오타이드 프로브(oligonucleotide probe)로 제작된 칩의　혼성화 반응에서 표적핵산의 길이에 제한이 있다.

DNA 칩에서처럼 지지체에 고정된 프로브를 사용하는 경우 표적핵산의 크기가 클수록 프로브로의 접근이 어려워 혼성화 반응 효율이 떨어지게 되므로, 너무 길지 않은 표적핵산을 혼성화 반응에 적용해야 한다.　 표적핵산의 길이가 200 염기쌍(bp) 이상이 되면 혼성화 효율이 급속하게 감소하여 특이신호가 감소하여 배경신호와의 구별이 용이하지 않으며, 400 bp 초과의 표적핵산은 특이신호가 거의 발생하지 않아 분석이 불가능하다(문헌 [Optimization of fragmentation conditions for microarray anaylsis of viral RNA, Martin et al., 2005, Analytical biochemistry, 347, 316-323] 및 [Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid, Regis et al., 2005, BioTechniques, 39, 89-96]).　 상기한 문제점을 해결하기 위해 표적이 산재해있는 경우 각각의 짧은 단편으로 증폭시키는 방법, 길게 증폭시킨 후 제한효소로 단편화하는 방법 및 유전체 증폭 후 다시 각각의 특이적 프라이머로 작게 증폭하는 방법 등이 사용되어 왔다(문헌 [Toward genome-wide SNP genotyping, Ann-Christine Syvanen, 2005, Nature genetics, 37, S5-S10] 및 [Assessing Genetic Variation: Genotyping Single Nucleotide Polymorphism, Ann-Christine Syvanen, Nature, 2001, 2, 930-942]).　 그러나 이러한 방법은 표적핵산을 혼성화 반응이 가능한 작은 단편으로 제작하는데 있어서 많은 시간과 고도의 노력 및 비용이 소모되는 번거롭고 비효율적인 방법이다.　 또한 반응하지 않는 잔여의 표적핵산들의 반응에 의해 비특이 신호가 증가할 가능성도 배제할 수 없다.

또한 DNA 자체의 불안정성을 해결하기 위해서는, 다양한 DNA 유사체들(analogues)이 개발되고 있으며, 그 중 PNA(peptide nucleic acids)는 1991년 넬슨(Nielson)에 의해 개발되었다(문헌 [Peptide nucleic acid, PNA, sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, P.E. Neilson et al., 1991, Science, 254, 1497-1500]).　 도 1에 나타낸 바와 같이, PNA는 DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, DNA와 같은 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응을 일으킬 수 있다.　 특히, 음전하를 띠는 인산 결합의 골격 때문에 서로 전기적으로 반발하는 천연 핵산과 달리 펩타이드 결합으로 이루어진 골격은 전하를 띠지 않기 때문에 혼성화 반응에서 PNA는 DNA보다 천연 핵산에 더 강하게 결합하고 이 결합은 염 농도(salt concentration)에 영향을 받지 않는다.　 또한 PNA는 핵산가수분해효소, 단백질분해효소와 같은 생 분해효소에 분해되지 않기 때문에 DNA나 RNA보다 안정성이 매우 높다.　 이와 같이 천연 핵산을 상보적으로 인식할 수 있고 혼성화 결합력과 안정성이 우수한 PNA는 유전자 분석 또는 진단 등에 이용된다(문헌 [PNA for rapid microbiology, Stender H et al., 2002, Journal of Microbiological Methods, 48, 1-17], [Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Brandt O et al ., 2004, Trends in Biotechnology, 22, 617-622] 및 [Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, Frdric R Raymond et al ., 2005, BMC technology, 5, 1-5]).

PNA의 생물학적 안정성을 이용한 연구들로는 예를 들면, 형광 표지된 PNA 프로브를 표적핵산과 반응시키고, PNA와 DNA의 혼성화 반응이 이루어지면 DNA의 음이온에 양이온의 폴리머가 결합되고, PNA와 DNA 사이에 미스매치된 부분이 존재하면 핵산가수분해효소인 S1 뉴클레아제에 의해 미스매치된 부분이 제거되어 FRET(fluorescence resonance energy transfer)로 SNP를 구별하는 방법이 보고되어 있다(문헌 [SNP detection using peptide nucleic acid probes and conjugated polymers: Applications in neurodegenerative disease identification, Brent S et al., 2005, Proceedings of the National Academy of Sciences 102, 34-39]).　 또한, 마이크로튜브 내에서 한 개 또는 두 개의 PNA 프로브와 표적핵산의 혼성화 반응 후 핵산가수분해효소로 처리하여 PNA 프로브와 염기서열이 미스매치된 표적핵산들을 제거하는 방법을 통해 PNA 프로브와 완전하게 혼성화된 것에 형광물질을 부착하여 육안 또는 질량분석기로 확인하는 방법이 보고되었다(문헌 [Detection of single nucleotide polymorphisms by the combination of nuclease S1 and PNA. Sheng Ye et al., 2002, Nucleic acid research No. 2, 235-236] 및 [PNA for one base differentiating protection of DNA from nuclease and its use for SNP detection. Makoto K et al., 2002, Journal of American Chemical Society 2003 125, 3758-3762]).　 그러나 상기 방법에서는 모두 PNA 프로브를 균질한(homogeneous) 용액 상태에서 혼성화시키므로 표적핵산의 크기에 상관없이 혼성화 반응이 일어난다. 이 방법들은 단지 혼성화 반응 후에 핵산가수분해효소를 첨가함으로써 표적핵산과 PNA 프로브의 미스매치 부분을 제거하여 특이도를 증가시킨 것이다.　 또한, 이 방법들에서는 한 번에 하나 또는 두 개의 PNA 프로브를 사용하여 한 번에 하나의 유전자 변이를 분석하였으므로 길이가 긴 표적핵산을 사용하지 않았다.

한편, 한국등록특허 제436554호(2004. 6. 8. 등록)는 기존의 DNA 칩에 핵산가수분해효소를 적용하여 혼성화된 핵산의 검출감도를 증가시키는 방법을 개시한 바 있다. 이 방법은 핵산가수분해효소를 이용하여 고정화된 DNA 프로브 중 혼성화하지 않은 단일가닥의 DNA 프로브를 제거하는 것으로서, 구체적으로는, 이중가닥 DNA의 말단은 인식하지 못하고 단일가닥 DNA의 3'-말단만을 인식하며, 특히 단일가닥의 3'-말단이 OH기를 가지는 상태로 존재하여야 DNA를 가수분해하는 특성을 갖는 엑소뉴클레이즈 Ⅰ(exonuclease Ⅰ)을 이용하여 DNA의 5'-말단이 기판에 고정되고 3'-말단의 OH기가 노출된 비혼성화된 DNA프로브를 제거하는 방법이다. 따라서, 이 방법은 핵산가수분해효소를 가하여 표적핵산을 단편화하거나 선별적으로 분해하는 것과는 전혀 상이한 것이다. 이 방법은 배경신호에 의한 비특이 신호를 감소시킬 수는 있지만 한 개의 염기가 불일치되어 일어나는 비특이 신호를 감소시킬 수 없기 때문에 SNP나 돌연변이 검출에 사용하기 어렵다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 핵산가수분해효소에 안정한 PNA를 프로브로 이용하여, 지지체에 고정된 PNA 프로브는 분해되지 않고 PNA 프로브와 혼성화되지 않는 표적핵산의 부분을 핵산가수분해효소를 이용하여 제거함으로써 기존의 DNA 칩보다 높은 신뢰도와 특이도로 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있음을 확인하였다.　 또한 다양한 길이의 표적핵산과 PNA 프로브의 혼성화 반응에 핵산가수분해효소를 첨가하면, 크기가 큰 표적핵산의 경우에도 혼성화 효율이 높아져서 복잡한 증폭방법 및 전처리 과정을 거치지 않고도 칩에 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 강한 특이신호와 뛰어난 특이도로 원하는 부위의 변이를 선별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 방법을 제공하기 위한 것이다.　 본 발명에 따른 방법은 다양한 크기의 표적핵산에 대하여 돌연변이, SNP, 유전형, 유전자 발현, 스플라이스-변이체 또는 후생학적(epigenetic) 분석, 또는 재서열분석(resequencing) 등에 널리 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산의 혼성화 반응에서 핵산가수분해효소를 이용하여 표적핵산을 단편화하여 표적핵산의 크기를 감소시키거나, PNA 프로브와 미스매치되는 표적핵산을 선별적으로 분해하는 단계를 포함하는, 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은 활성성분으로서 핵산가수분해효소를 포함하는, 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은

ⅰ) 지지체에 고정된 복수의 PNA 프로브; 및

ⅱ) 핵산가수분해효소:

를 포함하는, 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 지지체에 고정한 PNA 프로브를 사용하는 경우 표적핵산의 혼성화 반응과 동시에 또는 혼성화 반응 후에 핵산가수분해효소를 처리하여 비혼성화된 표적핵산을 선별적으로 제거함으로써, 혼성화 반응의 민감도 및 특이도를 증가시켜 한 개의 염기 미스매치(single mismatch)를 용이하게 구별할 수 있다.　 또 한 표적핵산의 혼성화 반응 시에 핵산가수분해효소를 처리함으로써, 크기가 큰 표적핵산의 혼성화 반응의 효율을 증가시켜 복잡한 증폭방법 및 전처리 과정을 거치지 않고도 길이가 긴 표적핵산의 분석이 가능하고 긴 표적핵산에 포함된 여러 개의 SNP나 여러 개의 돌연변이를 한 번의 표적핵산 증폭으로 검출할 수 있다.　 따라서 여러 질병에 관여하는 유전자나 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 검출할 수 있고, 구별이 어려웠던 SNP를 우수한 민감도 및 특이도로 검출하여 다양한 유전자를 폭넓게 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 지지체에 고정된 PNA 프로브의 표적핵산과의 혼성화 반응 효율 또는 특이도를 향상시키고 염기서열이 일치하지 않는 표적핵산의 비특이적 결합을 감소시키는 기술에 관한 것이다.　 본 발명에서는, 지지체에 고정시킨 PNA 프로브를 사용하는 경우, 다양한 길이의 표적핵산에 대해 PNA 프로브와 혼성화되지 않은 표적핵산의 단일 가닥 영역과 PNA 프로브와 완벽하게 상보적이 아니어서 표적핵산에서 PNA 프로브와 미스매치된 부분을 핵산가수분해효소로 가수분해하는 방법을 사용한다.　 혼성화 반응과 동시에 핵산가수분해효소를 가할 수도 있고, 혼성화 반응이 완료된 뒤에 핵산가수분해효소를 가할 수도 있다. 즉 표적핵산을 PNA 프로브와 혼성화 반응시키는 동시에 핵산가수분해효소를 가하면 표적핵산의 길이가 짧아지면서 혼성화 효율이 높아진다.　 또한 표적핵산 중 PNA 프로브와 혼성화된 영역 이외의 부분은 가수분해되어 특이도가 증가된다.　 그 결과, 기존 방법에서는 적용할 수 없 었던 긴 길이의 표적핵산을 지지체에 고정한 PNA 프로브로 검출할 수 있으며, 길이가 긴 표적핵산에 포함된 여러 개의 단일염기다형성과 돌연변이를 검출할 수 있게 된다.　 혼성화 효율 증가 없이 특이도를 증가시키는 효과만을 얻기 위해서라면 표적핵산의 혼성화 반응 후에 핵산가수분해효소를 가할 수도 있다.　 표적핵산의 혼성화 반응 후에 핵산가수분해효소를 가하는 경우에는 표적핵산의 길이가 너무 길면 혼성화 효율이 감소하므로 이 경우 표적핵산의 길이는 400 bp 이하, 예를 들어 20 내지 400 bp인 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 표적핵산과 핵산가수분해효소의 반응을 PNA 프로브가 고정화되어 있는 PNA 칩에 적용하고자, 서열번호 10 내지 15의 PNA 올리고머를 유리 슬라이드 표면에 고정하여 PNA 칩을 제작하고, 핵산가수분해효소를 첨가하여 그 특성을 살펴보았다.　 서열번호 10의 PNA 올리고머는 E. coli의 16S rDNA의 표적핵산과 완전하게 결합할 수 있는 프로브이며, 서열번호 11 내지 13의 PNA 올리고머는 서열번호 10과 하나의 염기가 다르게 설계된 프로브이다.　 서열번호 14의 PNA 올리고머는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)의 라미부딘 내성(lamivudine resistant) 유전자의 표적핵산과 완전하게 결합할 수 있는 프로브(180w)이며, 서열번호 15는 서열번호 14와 하나의 염기가 다르게 설계된 프로브(180t)이다.　 서열번호 14와 15는 기존 칩에서 비특이 신호가 매우 강하여 표적핵산을 특이적으로 검출할 수 없었던 서열이다.

서열번호	명칭	서열(5'→3')	설명
10	E. coli W	GCCCACTCATTACAG	E. coli 16S rDNA의 프로브
11	E. coli M1	GCCCACTGATTACAG	8번 염기가 미스매치(C→G)
12	E. coli M2	GCCCACTAATTACAG	8번 염기가 미스매치(C→A)
13	E. coli M3	GCCCACTTATTACAG	8번 염기가 미스매치(C→T)
14	HBV W	GAGCCAGGTAAAC	HBV 라미부딘 내성 유전자의 프로브
15	HBV M	GAGCCAAGATAAC	7번 염기가 미스매치(G→A)

에폭시(epoxy) 작용기가 노출된 유리 슬라이드에 상기 PNA 올리고머를 고정하여 PNA 칩을 제작하였다.

본 발명에서는, 핵산가수분해효소의 작용을 규명하기 위하여, 아래와 같이 표적핵산을 사용하였다:

1) 기존의 DNA 칩에서 분석이 곤란한 길이의 표적핵산도 분석이 가능한지를 조사하기 위하여, E. coli의 16S rDNA를 130, 280, 450, 759, 1000 bp로 5 가지 길이의 표적핵산을 증폭시켜 사용하였다.

2) 점 돌연변이(mutation)의 분별력을 조사하기 위하여 한 개의 염기서열이 상이한 라미부딘 내성 HBV 돌연변이형과 야생형의 표적핵산을 증폭하여 사용하였다.

본 발명에서는, 칩의 혼성화 반응에 사용하는 표적핵산을

1) 프라이머(하기 표 2 참조)의 5' 말단을 검출가능한 표지물질로 표지하여 증폭시킨 후, 핵산가수분해효소 첨가 또는 비첨가 하에 혼성화 반응을 수행하고 검출하는 방법;

2) 중합효소연쇄반응(PCR) 시 검출가능한 표지물질로 표지된 dNTP를 첨가하여 증폭반응 중에 표지되도록 한 후, 핵산가수분해효소 비첨가 하에 혼성화 반응을 수행하고 검출하는 방법; 및

3) PCR 시 검출가능한 표지물질로 표지된 dNTP를 첨가하여 증폭반응 중에 표지되도록 한 후, 핵산가수분해효소 첨가 하에 혼성화 반응을 수행하고 검출하는 방법:

을 이용하여, 지지체에 고정된PNA 프로브의 혼성화의 특이 신호와 신호분리능을 비교하였다.

상기 1) 내지 3)의 방법은 크게

a) 표적 DNA를 제조하는 단계;

b) 프로브 PNA와 표적 DNA의 혼성화 반응을 수행하는 단계;

c) 혼성화 반응 후 잔여 반응물을 제거하기 위해 세척하는 단계;

d) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는 단계:

를 포함한다.

혼성화를 형광검출법에 의해 검출하고자 하는 경우에는, 단계 a)에서, 프라이머를 말단 표지하는 것(방법 1))은 핵산가수분해효소 처리 시 가수분해되어 형광물질의 발색여부를 확인하기가 어려우므로 바람직하지 않으며(도 7 및 8 참조), PCR에 사용하는 dNTP(즉 dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 예를 들어 dCTP에 형광물질을 직접 부착하거나 바이오틴과 같이 형광물질과 반응할 수 있는 물질을 부착하는 것이 바람직하다(방법 3)).　 사용가능한 표지물질에는 특별한 제한이 없다. 예를 들면 바이오틴, 로다민, 사이아닌(Cyanine) 3, 사이아닌 5, 피렌(pyrene), 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa) 488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2′,4′,5′,7′-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2′,7′-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(calcium Green), 6-카르복시-4′,5′-디클로로-2′,7′-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red) 및 티아디카르보시아닌(Thiadicarbocyanine) 등을 사용할 수 있다.　 형광검출법 이외의 다른 방법(하기 단계 d)에 대한 기재 참조)에 의해 혼성화를 검출하고자 하는 경우에는, 이러한 표지 과정은 생략할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 표적핵산의 증폭방법에는 특별한 제한이 없다. 예를 들어 분지 DNA(bDNA; branched DNA) 증폭, 하이브리드 캡쳐(hybrid capture),　 리가제연쇄반응(LCR; ligase chain reaction), 중합효소연쇄반응(PCR), 핵산서열 기초 증폭(NASBA; nucleic acid sequence based amplification), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR; reverse transcription-PCR), 쇄 치환 증폭(SDA; stand displacement amplification), 전사-매개 증폭(TMA; transcription mediated amplification) 또는 롤링 서클 증폭(RCA; rolling circle amplification) 등의 방법을 사용할 수 있다.

단계 b)는 일반적인 혼성화 반응으로서, 혼성화 완충액에 핵산가수분해효소를 첨가하면 길이가 긴(예를 들어, 200~20,000 bp, 특히 200~5,000 bp 길이의) 표적핵산의 경우 핵산가수분해효소에 의해 표적핵산이 잘려지면서 프로브에 접근이 용이해져 혼성화 효율을 증가시킨다(도 3 참조).

단계 c)는 일반적인 세척방법과 동일한 방법으로 수행되는 바, 단계 c)에서 핵산가수분해효소를 첨가하는 경우, 혼성화 반응의 특이도를 증가시키는 작용을 나타낸다(도 2 참조).　 구체적으로는, 정확하게 상보적인 서열을 가진 표적핵산은 PNA 프로브와 완전한 이중가닥을 형성하는데 비해, 염기서열 하나가 불일치하는 표적핵산은 상보적인 서열 부분에서만 혼성화되어 이중가닥을 형성하고, 염기가 상보적이지 않은 부분에서는 단일가닥으로 존재하는 부분적 혼성화 상태에 있게 된다.　 여기에 단일가닥에 특이적인 DNA 분해효소를 처리하면 완전하게 혼성화된 이중가닥 부분은 분해되지 않고, 불완전하게 혼성화된 표적핵산은 가수분해되어 완전하게 혼성화된 표적핵산만을 선별할 수 있게 된다.　 DNA가 고정된 DNA 칩은 DNA 프로브 자체가 핵산가수분해효소에 의해 분해될 수 있기 때문에 이 방법을 사용하기 어렵다.　 따라서 본 발명에서는 핵산가수분해효소에 안정한 PNA을 이용하며, 도 1에서 나타낸 바와 같이 PNA의 핵산가수분해효소에 매우 안정한 성질은 PNA와 DNA가 완전하게 결합한 부위는 핵산가수분해효소가 인지할 수 없어 강한 결합을 그대로 유지하는 반면, 하나의 염기서열이 미스매치되어 있는 PNA와 DNA의 결합은 불안정한 결합이므로 핵산가수분해효소에 의해 표적 DNA가 분해되게 된다.　 그 결과, PNA 칩에는 PNA와 DNA가 완전하게 상보적으로 결합되어 있는 부분만이 남게 된다.

본 발명에서 사용가능한 핵산가수분해효소에는 특별한 제한이 있는 것은 아니며, DNase 1, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 또는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.　 엑소뉴클레아제나 엔도뉴클레아제의 구체적인 예로서는 엑소뉴클레아제 1(exonuclease 1), S1 뉴클레아제(S1 nuclease), 멍빈 뉴클레아제(Mung bean nuclease), 리보뉴클레아제 A(ribonuclease A), 리보뉴클레아제 T1(rionuclease T1) 또는 뉴클레아제 P1(nuclease P1) 등을 들 수 있다.　 핵산의 특정 염기 서열을 끊는 제한 효소도 이러한 목적으로 사용할 수 있다. 특히 S1 뉴클레아제는 다양하게 이용되고 있는 핵산가수분해효소로서, 단일가닥의 핵산과 닉(nick)이 형성된 이중가닥 핵산을 분해하고, 루프(loop)나 갭(gap)이 형성된 헤테로이합체 핵산(heteroduplex DNA)도 분해할 수 있다 (문헌 [Purification and Properties of S1 Nuclease from Aspergillus, Vogt VM, 1980, Methods in Enzymology, 65, 248-255]).　 이러한 특성을 이용하여 하나의 염기가 미스매치되어 닉을 형성하고 있는 표적핵산을 제거하여, 하나의 염기차이의 변이도 정확하게 구별할 수 있게 된다.

단계 d)는 일반적인 혼성화 검출방법을 이용하여 수행될 수 있는 바, 형광검출법, 전기적 방법, 전기화학적 방법, 질량변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법을 이용할 수 있다(문헌 [DNA biosensors based on Peptide Nucleic Acid (PNA) recognition layers, Wang J, 1998, Biosensors and Bioelectronics, 13, 757-762], [Labelfree fully electronic nucleic acid detection system based on a field-effect transistor device, Uslu F et al., 2004, Biosensors and Bioelectronics, 19, 1723-1731], [Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors, Hahm J and Lieber CM, 2004, Nano Letters, 4, 51-54], [Impedance-based detection of DNA sequences using a silicon transducer with PNA as the probe layer, A. Macanovic et al. 2004, Nucleic Acids Research, 32, e20], [S. Manalis and T. Burg, US Patent 7,282,329 "Suspended microchannel detectors"] 및 [P. Warthoe and S. Iben, US Patent Application Publication 2004/0072208 A1 "Surface acoustic wave sensors and method for detecting target analytes"]).

본 발명에 따른 방법(예: 상기 방법 3))을 이용하면, 구별이 용이하지 않았던 하나의 염기차이도 정확하게 구별할 수 있게 되어, 진단용 칩에서 위 음성 및 위 양성의 결과를 줄일 수 있어 신뢰도를 크게 높일 수 있다.　 또한 기존의 올리고칩에서 사용에 제한이 있었던 크기가 큰 표적핵산을 이용할 수 있게 되어, 다양한 크기의 표적핵산을 제한 없이 사용할 수 있다.　 또한 표적핵산을 여러 가지 검출표지로 표지하여 사용할 수 있어, 핵산의 혼성화에 의해 단일가닥과 이중가닥을 구별하는 모든 방법에 적용될 수 있을 것이다.

활성성분으로서 핵산가수분해효소를 포함하는 본 발명의 조성물은 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

지지체에 고정된 복수의 PNA 프로브와 핵산가수분해효소를 포함하는 본 발명의 핵산 검출용 키트는 표적핵산에 포함된 복수의 SNP와 돌연변이를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 3개 이상의 PNA 프로브를 포함할 수 있다. 전체 게놈의 SNP와 돌연변이를 검출하기 위한 키트에는 수만 또는 수십만개의 PNA 프로브를 포함할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

제조예 1: 표적핵산 제조를 위한 프라이머의 합성

본 발명에 따른 표적핵산의 제조를 위해 먼저 PCR에 사용하기 위한 프라이머를 합성하였다.　 프라이머 서열은 표 2에 나타낸 바와 같이 5개의 크기가 다른 E. coli의 16S rDNA의 유전자 부위에서 선택하였다.　 또한 표 3에 나타낸 바와 같이, B형 간염 바이러스의 라미부딘 내성 유전자에 반응할 수 있는 부위에서 선택하였다.　 PCR에 사용하기 위한 프라이머는 바이오틴이 부착되지 않은 프라이머와 5' 말단에 바이오틴이 부착되어 있는 프라이머의 두 가지 종류를 바이오니아(Bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.

명칭	프라이머 염기서열(5'→3')		PCR 산물 크기(bp)
Hbv-F	센스(서열번호 8)	CCA TCA TCT TGG GCT TTC GC	200
Hbv-R	안티센스(서열번호 9)	CAA AAG AAA ATT GGT AAC AGC GGT A	200

제조예 2: 바이오틴화 프라이머를 이용한 PCR 에 의한 표적핵산의 제조　

주형 DNA로는 한국유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받은 E. coli KCTC 1112에서 추출한 DNA를 사용하였다.　 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭시켰다:

주형 DNA 용액 (50 ng/㎕) 2 ㎕ , 표 2에 나타낸 5개의 바이오틴화 센스 프라이머(20 pmol/㎕) 1 ㎕ 및 바이오틴화 안티센스 프라이머(20 pmol/㎕) 1 ㎕, dNTP(25 mM) 3 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl₂ 포함) 5 ㎕, 0.2 % BSA(bovine serum albumin) 5 ㎕, Taq(5 U/㎕, 솔젠트(Solgent), 한국) 0.2 ㎕, 증류수 36.8 ㎕의 조성으로 94 ℃에서 5 분간 처리한 후 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃ 1 분을 30회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 더 반응시켰다.

반응이 끝난 PCR 산물(130 bp, 280 bp, 450 bp, 759　 bp, 1000 bp) 5 ㎕에 젤 로딩 완충액(썬바이오, 한국) 1 ㎕를 넣고 1.5% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후 1 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV-transilluminator)에서 산물을 확인하였다.　 각 크기별 표적핵산의 염기서열 및 프로브와 프라이머의 위치를 도 4에 나타내었으며, 전기영동한 결과를 도 5에 나타내었다.

제조예 3: 바이오틴 - dCTP 를 이용한 PCR 에 의한 표적핵산의 제조

주형 DNA로는 한국유전자은행에서 분양받은 E. coli KCTC 1112에서 추출한 DNA를 사용하였다.　 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭시켰다:

주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 2 ㎕,　 표 1에 나타낸 5 개의 센스 프라이머(20 pmol/㎕) 1 ㎕ 및 안티센스 프라이머(20 pmol/㎕) 1 ㎕, dNTP(2.5 mM) 2.45 ㎕, 11-바이오틴-dCTP(1 mM) 4 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl₂ 포함) 5 ㎕, 0.2% BSA 5 ㎕, Taq(5 U/㎕, 솔젠트) 0.2 ㎕, 증류수 32.8 ㎕의 조성으로 94 ℃에서 5 분간 처리한 후 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분을 30회 반복한 후 72 ℃에서 5 분 더 반응시켰다.

반응이 끝난 PCR 산물(130 bp, 280 bp, 450 bp, 759 bp, 1000 bp) 5 ㎕에 젤 로딩 완충액(썬바이오, 한국) 1 ㎕를 넣고 1.5% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후 1 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색한 후 UV 트랜스일루미네이터에서 산물을 확인하였다.　 각 크기별 표적핵산의 염기서열 및 프로브와 프라이머의 위치를 도 4에 나타내었으며, 전기영동한 결과를 도 5에 나타내었다.

제조예 4: PNA 칩의 제작

상기 표 1에 나타낸 서열번호 10 내지 13의 정제된 PNA 올리고머를 PANArray™ 스팟팅 완충액(파나진, 한국)에 50 mM로 희석하여 에폭시기가 코팅된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 75% 습도가 유지되는 상온에서 4 시간 동안 정치하였다.　 이후 디메틸포름아미드(DMF)에 넣고 15 분간 초음파 세척하고, 0.1 M 무수숙신산를 첨가한 DMF에 넣고 40 ℃에서 2 시간 동안 반응시켜 잔여 아민기를 제거하였다.　 DMF로 15 분간 세척하고, 3차 증류수로 15 분간 초음파 세척하였다.　 이후 0.1 M 에탄올아민이 들어있는 100 mM 트리스 완충액(Tris-HCl)을 넣고 40 ℃에서 2 시간 반응하여 고체 표면의 잔여 에폭시기를 불활성화하였다.　 3차 증류수를 이용하여 5 분간 세척한 후 건조하였다.

비교예 1: 바이오틴 표지 프라이머를 이용하여 증폭된 표적핵산의 혼성화 반응

말단에 바이오틴이 결합된 PCR 산물을 PANArray™ 혼성화 완충액(파나진, 한국) 100 ㎕에 5 ㎕ 첨가하여 사용하고, 이때 형광반응을 일으키기 위하여 스트렙타비딘-Cy5를 첨가하였다.　 유리 슬라이드에 100 ㎕의 혼성화 완충액을 분주하고 40 ℃에서 2 시간 반응시켰다.　 반응 후에 PANArray™ 세척 완충액(파나진, 한국)으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다(핵산가수분해효소 비첨가군).　 핵산가수분해효소 첨가군의 경우, 건조된 슬라이드에 반응 완충액 100 ㎕ 중 S1 뉴클레아제 0.5 ㎕(1 U/㎕)(아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences), 미국)를 분주하고 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 상기 세척 및 건조과정을 반복하였다.　 형광 스캐너(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국)를 이용하여 슬라이드의 이미지를 분석하였다.　 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 130 bp의 표적핵산에서는 양호한 특이 신호 크기 및 특이 신호와 비특이 신호 분리능(perfect match/mismatch ratio, P/M비)을 나타내었으나, 280 bp, 450 bp, 759 bp, 1000 bp로 표적핵산의 크기가 커짐에 따라 특이 신호가 감소하는 것을 볼 수 있었다.　 특히 1000 bp의 표적핵산에서는 매우 낮은 특이신호가 발생되어 특이신호와 비특이 신호의 구별이 어려웠다(P/M비가 2 미만).

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 핵산가수분해효소를 첨가한 경우 표적핵산의 잔여부분이 제거되므로 신호가 전혀 발생하지 않았다.　 상기 결과로부터, 칩에서 핵산가수분해효소가 표적핵산을 가수분해하는 것을 확인할 수 있었다.

비교예 2: 바이오틴 - dCTP 를 이용하여 증폭된 표적핵산의 혼성화 반응

바이오틴-dCTP가 결합된 PCR 산물을 PANArray™ 혼성화 완충액(파나진, 한국) 100 ㎕에 5 ㎕ 첨가하여 사용하였다.　 슬라이드에 100 ㎕의 혼성화 완충액을 분주하고 40 ℃에서 2 시간 반응시켰다.　 반응 후에 PANArray™ 세척 완충액(파나진, 한국)으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다.　 건조된 슬라이드에 형광반응을 일으키기 위해 혼성화 완충액 100 ㎕와 스트렙타비딘-Cy5를 혼합하여 사용하였다.　 슬라이드에 100 ㎕의 혼성화 혼합액을 채우고 40 ℃에서 30 분 반응시켰다.　 반응 후에 PANArray™ 세척 완충액(파나진, 한국)으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다.　 형광 스캐너(진픽스 4000B, 엑손, 미국)를 이용하여 유리 슬라이드의 이미지를 분석하였다.　 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 비교적 크기가 작은 130 내지 450 bp의 표적핵산의 경우 핵산가수분해를 첨가하지 않은 경우에도 비교적 높은 특이 신호를 얻을 수 있으나, 특이 신호와 비특이 신호의 분리능은 다소 떨어지며, 크기가 큰 759 내지 1000 bp의 표적핵산의 경우 특이 신호가 감소하고 특이 신호와 비특이 신호의 분리능이 현격히 떨어짐을 확인할 수 있었다(1000 bp 표적핵산의 경우 P/M비가 2.3~3.5).

실시예 1: 바이오틴 - dCTP 를 이용하여 증폭된 표적핵산의 혼성화 반응 및 핵산가수분해효소의 처리

바이오틴-dCTP가 결합된 PCR 산물을 PANArray™ 혼성화 완충액(파나진, 한국) 100 ㎕에 5 ㎕ 첨가하여 사용하였다.　 슬라이드에 100 ㎕의 혼성화 완충액을 분주하고 40 ℃에서 2 시간 반응시켰다.　 반응 후에 PANArray™ 세척 완충액(파나진, 한국)으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다.　 건조된 슬라이드에 반응 완충액 100 ㎕ 중 S1 뉴클레아제(아머샴 바이오사이언스, 미국) 0.5 ㎕(1 U/㎕)를 첨가하여 분주하고 37 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다.　 반응 후 상기 세척 및 건조 과정을 반복하였다.　 건조된 슬라이드에 형광반응을 일으키기 위해 혼성화 완충액 100 ㎕와 스트렙타비딘-Cy5를 혼합하여 사용하였다.　 40 ℃에서 30 분간 혼성화 반응시켰다.　 반응 후에 PNAArray™ 세척 완충액(파나진, 한국)으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다.　 형광 스캐너(Genepix 4000B, 엑손, 미국)를 이용하여 유리 슬라이드의 이미지를 분석하였다.　 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 핵산가수분해효소로 처리한 경우 표적핵산의 크기에 크게 영향을 받지 않고, 759 bp까지는 130 bp와 비교하여 전혀 차이가 없을 정도로 신호강도 50000~60000의 높은 특이 신호를 나타내었으며, 특이 신호와 비특이 신호의 분리능을 나타내는 P/M비가 8.3~11로 말단 표지된 표적핵산을 이용한 비교예 1에 비해 약 10배 높은 결과를 나타내었다.　 또한, 크기가 큰 759 내지 1000 bp의 표적핵산의 경우 핵산가수분해효소를 첨가한 본 발명의 방법이 핵산가수분해효소를 첨가하지 않은 방법보다 특이 신호가 더 크고, 특이 신호와 비특이 신호의 분리능도 3배 이상 큰 것을 확인할 수 있었다.

비교예 3 및 실시예 2: B형 간염 바이러스 PNA 칩에서의 혼성화 반응

본 실시예에서는, 기존의 방법으로는 특이 신호와 비특이 신호를 구분하기 어려웠던 180t 프로브에 대한 본 발명의 효과를 살펴보고자 하였다.

제조예 1에서 제조된 표 3의 프라이머(Hbv-F 및 Hbv-R)와 주형 DNA로서 진인(Genine, 한국)에서 입수한 HBV DNA를 사용하여, 제조예 3과 실질적으로 동일한 방법에 따라 표적 DNA를 증폭시키고, 표 1에 나타낸 HBV 프로브(서열번호 14 및 15)를 이용하여 제조예 4와 실질적으로 동일한 방법에 따라 PNA 칩을 제작한 후, 비교예 2 및 실시예 1과 실질적으로 동일한 반응으로 혼성화 반응, 또는 혼성화 반응 및 핵산가수분해효소 처리를 수행하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 핵산가수분해효소를 첨가하지 않은 경우에는 특이신호의 크기와 비특이신호의 크기가 거의 같아서 PNA 칩으로 HBV야생형과 돌연변이형을 구분할 수 없었으나 핵산가수분해효소를 처리한 경우 비특이 신호가 크게 감소하여 HBV야생형과 돌연변이형을 구분할 수 있었다(P/M비 = 2.5).

도 1은 DNA와 PNA의 기본구조의 차이를 나타낸 도면이고;

도 2는 본 발명의 일례에 따른 PNA 올리고칩 상에서 핵산가수분해효소를 이용하여 혼성화 특이도를 증가시키는 원리를 나타낸 도면이며;

도 3은 본 발명의 일례에 따른 PNA 올리고칩 상에서 핵산가수분해효소를 이용하여 길이가 긴 표적핵산의 혼성화 효율을 증가시키는 원리를 나타낸 도면이고;

도 4는 본 발명에서 사용한 각 크기별 표적핵산(E. coli 16S rDNA)의 염기서열, 및 프로브 및 프라이머의 위치를 보여주는 도면이며;

도 5는 각 크기별 표적핵산(E. coli 16S rDNA)을 증폭한 후 1.5% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 결과를 보여주는 도면이고;

도 6은 PNA 올리고칩 상에서 형광 이미지의 스팟 배치도이며;

도 7a 내지 7e는 표적핵산(E. coli 16S rDNA)을 말단 표지(end labeling), 바이오틴-dCTP 표지, 및 바이오틴-dCTP 표지 및 핵산가수분해효소 처리 시 PNA 올리고칩의 혼성화 결과를 보여주는 형광 이미지 및 정량분석 데이터를 나타낸 도면이고(a: 130 bp, b: 280 bp, c: 450 bp, d: 759 bp, e: 1000 bp);

도 8은 핵산가수분해효소 비첨가 및 첨가 시 말단 표지된 표적핵산(E. coli 16S rDNA, 130 bp 및 450 bp)의 검출신호를 정량분석한 결과를 나타낸 도면이며;

도 9는 핵산가수분해효소 비첨가 및 첨가 시 바이오틴-dCTP 표지된 표적핵산(HBV 라미부딘 내성 유전자)의 검출신호를 정량분석한 결과를 나타낸 도면이다.

<110> Panagene Inc. <120> Methods, compositions and kits for increasing efficiency or specificity of hybridization between PNA probes immobilized on support and target nucleic acids <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 1 tgcaagtcga acggtaacag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 2 tgcgacgtta tgcggtatta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 3 gtgcaatatt ccccactgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 4 gttagccggt gcttcttctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 5 cggttcggtt gaagagaaaa 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 6 aaggtataaa gcggggtttt g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 7 cggggatttc acatctgact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 8 ccatcatctt gggctttcgc 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer of PCR for amplification of target nucleic acid <400> 9 caaaagaaaa ttggtaacag cggta 25 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for E. coli 16S rDNA <400> 10 gcccactcat tacag 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for E. coli 16S rDNA <400> 11 gcccactgat tacag 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for E. coli 16S rDNA <400> 12 gcccactaat tacag 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for E. coli 16S rDNA <400> 13 gcccacttat tacag 15 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HBV lamivudine resistant gene <400> 14 gagccaggta aac 13 <210> 15 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HBV lamivudine resistant gene <400> 15 gagccaagat aac 13

Claims

지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산의 혼성화 반응에서 핵산가수분해효소(nuclease)를 첨가함으로써, 표적핵산을 단편화하여 표적핵산의 크기를 감소시키거나, PNA 프로브와 미스매치(mismatch)되는 표적핵산만을 선별적으로 분해하는 단계를 포함하는, 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 효율 또는 특이도를 증가시키는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 혼성화 반응 후 핵산가수분해효소를 첨가하는 방법.
제3항에 있어서, 표적핵산의 크기가 20 bp 내지 400 bp인 방법.
제1항에 있어서, 혼성화 반응과 동시에 핵산가수분해효소를 첨가하는 방법.
제5항에 있어서, 표적핵산의 크기가 200 bp 내지 20,000 bp인 방법.
제6항에 있어서, 표적핵산의 크기가 200 bp 내지 5,000 bp인 방법.
제1항에 있어서, 표적핵산의 PNA 프로브와 결합하는 부분이 검출가능한 표지로 표지된 것인 방법.
제8항에 있어서, 검출가능한 표지가 바이오틴, 로다민, 사이아닌 3, 사이아닌 5, 피렌, 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP), 칼세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사 488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2′,4′,5′,7′-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2′,7′-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐, 플루오레세인, 오레건 그린, 마그네슘 그린, 칼슘 그린, 6-카르복시-4′,5′-디클로로-2′,7′-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민, 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민팔로이딘, 피로닌 Y, 리싸민, X-로다민(ROX), 칼슘 크림선, 텍사스 레드, 나일 레드 및 티아디카르보시아닌으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표적핵산이 분지 DNA(bDNA) 증폭, 하이브리드 캡쳐,　 리가제연쇄반응(LCR), 중합효소연쇄반응(PCR), 핵산서열 기초 증폭(NASBA), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 쇄 치환 증폭(SDA), 전사-매개 증폭(TMA) 및 롤링 서클 증폭(RCA)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법에 의해 증폭된 것인 방법.
제1항에 있어서, 핵산가수분해효소는 DNase 1, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 핵산가수분해효소는 엑소뉴클레아제 1, S1 뉴클레아제, 멍빈 뉴클레아제, 리보뉴클레아제 A, 리보뉴클레아제 T1, 리보뉴클레아제 P1, 제한 효소 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 돌연변이, 단일염기다형성(SNP), 유전형, 유전자 발현, 스플라이스-변이체 또는 후생학적(epigenetic) 분석, 또는 재서열분석(resequencing)에 사용되는 방법.
제1항에 있어서, 혼성화를 형광검출법, 전기적 방법, 전기화학적 방법, 질량변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법에 의해 검출하는 방법.
활성성분으로서 핵산가수분해효소를 포함하는, 200 bp 내지 20,000 bp 길이의 표적 핵산에 대해 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 반응과 동시에 첨가하여 혼성화 효율을 증가시키기 위한 조성물.
제15항에 있어서, 핵산가수분해효소는 DNase 1, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 핵산가수분해효소는 엑소뉴클레아제 1, S1 뉴클레아제, 멍빈 뉴클레아제, 리보뉴클레아제 A, 리보뉴클레아제 T1, 리보뉴클레아제 P1, 제한 효소 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
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활성성분으로서 핵산가수분해효소를 포함하는, 20 bp 내지 400 bp 길이의 표적 핵산에 대해 지지체에 고정된 PNA 프로브와 표적핵산 간의 혼성화 반응 후에 첨가하여 혼성화 특이도를 증가시키기 위한 조성물.
제21항에 있어서, 핵산가수분해효소는 DNase 1, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
제22항에 있어서, 핵산가수분해효소는 엑소뉴클레아제 1, S1 뉴클레아제, 멍빈 뉴클레아제, 리보뉴클레아제 A, 리보뉴클레아제 T1, 리보뉴클레아제 P1, 제한 효소 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.