JP2017501735A - ５’−フラップエンドヌクレアーゼ活性の抑制を用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＰＣＲ産物の末端にプローブを相補結合させる場合、ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性が抑制されるという特徴を用いて単一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出する方法に関する。より具体的には、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）に使用されるプローブをＰＣＲ産物末端部位に相補結合させる場合、プローブに対する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制されるという特徴を確認し、これを用いてプローブの５'−末端部位に検出しようとする単一塩基多型性（ＳＮＰ）部位が位置するようにデザインする場合、対立形質（ａｌｌｅｌｅ）によって５'−フラップ形成が誘導されることによって効果的な単一塩基多型性（ＳＮＰ）検出が可能な新たな方法に関する。
Description
本発明は、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ突然変異を検出する方法に関する。より詳細に説明すると、ＤＮＡポリメラーゼ、具体的にファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ、より具体的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'−ＦＥＮ（５'−ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；以下、「ＦＥＮ」と混用する）活性を抑制する方法、抑制されたＦＥＮ活性を用いて単一塩基多型性（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、以下、ＳＮＰという）などの遺伝子突然変異を検査する方法、遺伝子突然変異検査用プローブのデザイン方法及び多様なプローブ類型に対する適用方法などのように、効果的でかつ精巧に遺伝子突然変異を検査できる新たでかつ効果的な方法に関する。
遺伝子の突然変異分析は、人間遺伝疾患診断、薬物遺伝学、薬物開発及び微生物学などの多様な科学分野でその重要性が強調されながら迅速に成長している。遺伝学分野において、突然変異は、ＤＮＡを構成する塩基配列の変化をいい、転座、逆位を初めとして特定遺伝子の挿入／欠失と単一塩基多型性（ＳＮＰ）を含む。これらのうち、ＳＮＰは最も一般的な形態のＤＮＡ塩基配列の変化であり、ヒト遺伝体の場合、１，０００塩基当たり１個の頻度で表れている（Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：９２８−９３３）。ヒト遺伝体上で、ＳＮＰは暗号化部位（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）よりは非暗号化部位（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）でより頻繁に表れ（ＬＩ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｌ．Ａ．１９９１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２９：５１３−５２３）、非暗号化部位のＳＮＰは進化学的な研究において分子マーカーとして使用されており、暗号化部位のＳＮＰは、遺伝子の機能、タンパク質の構造又は発現に影響を与え得るので、遺伝疾患研究及び診断においてマーカーとして使用されている（Ｋｉｍ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｉｓｒａ，Ａ．２００７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，９：２８９−３２０）。このように、分子マーカーとしてのＳＮＰを高い信頼度と敏感度で、迅速かつ経済的に分析できる多様な方法が開発されている（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．Ｃ．２００１．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２：９３０−９４２；Ｋｉｒｋ，Ｂ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：３２９５−３３１１；Ｋｗｏｋ，Ｐ−Ｙ．，２００２．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，１９：３１５−３２３）。
ＲＴ−ＰＣＲを用いるＳＮＰ分析方法は、最も広範囲に使用される方法であって、利用可能な遺伝情報が豊かになると共に、その活用度はより大きくなっている。ＲＴ−ＰＣＲは、他のＳＮＰ分析法に比べて速く、敏感度と特異度が高く、分析費用が低く、また、容易に自動化できるという長所を有する。なお、ＲＴ−ＰＣＲは、既存の一般ＰＣＲ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ）と異なり、アガロースゲルを用いる電気泳動分析が必要でないので、汚染による分析の誤りを最小化できるという長所も有する。
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＮＰを分析するためには、オリゴヌクレオチド形態のプローブ又はプライマーを用いるようになり、主に混成化プローブ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）、加水分解プローブ（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ又はＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）及びスコーピオンプライマー（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ）方法などが使用されている。混成化プローブを用いる突然変異分析方法としては、蛍光共鳴エネルギー伝達（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を原理とするＲｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムを使用する方法が常用化されている（Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１７６−１８１）。分析には二つの種類のプローブが使用され、ＦＲＥＴは、二つのプローブが標的ＤＮＡに隣接して混成化結合される場合に蛍光が発生する原理を用いたものである。混成化プローブを用いた突然変異分析は、ＰＣＲの終了後、溶融曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析することによって可能である。すなわち、突然変異で標的配列の一部の配列がプローブ配列と不一致する場合は、完璧に一致する場合より溶融温度が低いので、溶融曲線の様相に差を示すようになる（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，４：２３−２８）。混成化プローブと溶融曲線とを用いて突然変異を分析する方法は非常に速い分析方法であり、プローブデザインも相対的に容易である。しかし、溶融曲線は、実質的に常に期待する程度の突然変異判読能力を示すことができない。
加水分解プローブ方法は、ＰＣＲ反応時、プライマーと共に両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたプローブを使用し、蛍光共鳴エネルギー伝達原理を用いる。すなわち、リポーターとクエンチャーとが隣接している場合、リポーターから放出されたエネルギーが隣接したクエンチャーに転移され、蛍光は検出されないが、その後、ＰＣＲ増幅産物の増加と共に、標的遺伝子に結合されたプローブがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３’ヌクレアーゼ活性によって分解されながらリポーターの蛍光が発散される原理である。加水分解プローブ分析方法（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）は、標的塩基配列へのプローブの結合につながるヌクレアーゼ活性によるプローブの分解が起こり得る最適な条件を探すことが非常に重要である。すなわち、ＰＣＲに使用されるプライマーとプローブとが標的配列に混成化結合されると同時に、プローブが分解され得るＰＣＲ条件（ｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ）が重要である。これら二つの要求条件を充足するために、一般に２段階ＰＣＲが適用される。すなわち、９５℃で変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）段階が行われ、プローブのＴｍより７℃〜１０℃低い６０℃でアニーリングと延長が同時に行われる。過度に高い温度で反応を行うと、プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって分解されるよりは、標的から分離（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅ）され、蛍光は増加しなくなる（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００９．Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、蛍光物質を多様に使用し、ＳＮＰ検出又は突然変異分析が可能であるという長所を有する。しかし、この方法は、プローブの特異度を付与するために短いプローブを使用しなければならなく、これによってＴｍ値が必然的に低くなり、安定したアニーリング状態維持が難しくなる。これを克服するために、高価のＭＧＢ（Ｍｉｎｅｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）プローブ又はＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）プローブを使用しなければならないという短所を有する（Ｌｅｔｅｒｔｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，１７：３０７−３１１）。ＭＧＢ ＴａｑＭａｎプローブは、一般的なＴａｑＭａｎプローブと類似するが、３'末端にマイナーグルーブ結合部分を加えることによって、プローブの長さが短くてもＴｍが高いので、ＰＣＲ条件で安定したアニーリング状態を維持できるようにする（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１）。ＭＧＢのように、別途の変形プローブを使用することなく、ＴａｑＭａｎプローブと共にＡＭＲＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣＲ原理を適用してＳＮＰを分析することもある（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２９：１３２）。しかし、ＡＲＭＳ ＰＣＲは、ＳＮＰを区分できる最適のＰＣＲ条件を探すことが非常に難しい（Ｐｕｎｉａ Ｐ．ａｎｄ ＳＡｕｎｄｅｒｓ．Ｎ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｒｉｚｏｎｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒｂｏｏｋｓ）。
分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）とスコーピオンプライマー（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）は、ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を含む構造化された探針（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｐｒｏｂｅｓ）であって、混成化プローブやＴａｑＭａｎプローブなどの線形プローブより相対的に高い特異度を示し、ミスマッチ識別能力に優れるので、類似する配列の区別又はＳＮＰと対立形質の区分に適している。しかし、ループ構造を有するプローブをデザインすることが非常に難しいので、一般に、多くの種類のプローブを製作して実験した後、目的とする結果を得ることができるプローブを確保しにくい（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１７１−６１７６；Ｂｒｏｕｄｅ，Ｎ．Ｅ．２００２．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０；２４９−２５６．；Ｔａｐｐ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８：７３２−７３８）。
最も代表的に使用されているリアルタイム重合酵素反応法は、加水分解プローブ方式であるＴａｑＭａｎ分析方法であり、これに適用された基本原理は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが保有している５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を用いるものである。１９９１年、Ｈｏｌｌａｎｄ等は、鋳型ＤＮＡと相補的塩基配列を有するプローブを使用する場合、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性によって特定ＰＣＲ反応をリアルタイムで確認できることを明らかにした。また、このときに使用されるプローブは、鋳型ＤＮＡと１００％相補性を有する場合のみならず、５'−末端の非相補的フラップ（ｆｌａｐ）部位を有するプローブも区分なしでＴａｑ ＤＮＡの５’→３'エキソヌクレアーゼ活性によって分解されることを確認した（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：７２７６−７２８０）。その後、この方法を基盤にして蛍光顔料で修飾されたプローブを活用した多様なＲＴ−ＰＣＲ技法が開発され、多くの分野で広範囲に活用されている（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６．９８６−９９４．；Ｌｉｖａｋ Ｋ．Ｊ．１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４：１４３−１４９）。
一般に、眞核生物（ｅｕｋａｒｙａ）と古細菌類（ａｒｃｈａｅａ）は、ＤＮＡポリメラーゼとＦＥＮ１ヌクレアーゼ（Ｌｉｅｂｅｒ，Ｍ．Ｒ．，１９９７．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：２３３−２４０）と呼ばれるＤＮＡエンドヌクレアーゼＩＶが区分されており、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）は、ＤＮＡの複製と修繕過程で生成される５'−フラップを除去する重要な役割をするものと知られている（Ｒｏｓｓｉ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０６，４５３−４７３，Ｋｉｍ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：８８４２−８８４８：Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．１９９７．ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３３４１−３３４８）。特に、眞核生物のＦＥＮは、癌、ウイルス性疾病の進行などと連関しており、新薬開発のためにＦＥＮ、特にＦＥＮ−１の活性阻害剤に対する関心が非常に大きくなっている（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｊ．ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１８：５６７−７５）。
その一方で、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）を含む原核生物ファミリーＡポリメラーゼの場合は、一つのタンパク質内に５'−ヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼが互いに異なるドメインに存在し、５'−ヌクレアーゼは一般的な５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の他に５’−フラップを除去するエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性を同時に有しているものと知られている（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：７７８−７８３）。
上述したＨｏｌｌａｎｄ等の実験結果は、使用されるプローブの５'−末端にフラップ部位が存在する場合は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３’エキソヌクレアーゼ活性でなくＦＥＮ活性によるものであることが分かる。しかし、ＴａｑＭａｎプローブを使用する既存の方法では、５'→３’エキソヌクレアーゼとＦＥＮ活性を区別することなく、総称して５'−ヌクレアーゼとして使用している。２００５年に発表されたインベーダーアッセイ（Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ）（Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｍ．，２００５．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５７３：１０３−１１０）は、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）ＦＥＮ酵素の特性を用いてＳＮＰを検出できる方法を提示したが、回転信号増幅でなく等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）反応に起因する低い敏感度のため幅広く活用されてはいない。
前記のように多様な分子診断技術などが開発されてきたが、依然として十分な敏感度と特異性を有する分子診断技術の開発が必要である。特に遺伝子変異を効果的に検査するための多くの方法が活用されているが、検査時間、費用、特異度、敏感度及び多種検査などの実際の臨床で必要とする問題をすべて満足させる検査法は存在していない。
ＴａｑＭａｎプローブなどの多くの方法は、ＳＮＰを区分するために特定温度でアレル特異的（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プローブの相補的結合を基本的原理として使用する。これらの方法は、単純に温度によるプローブの相補的結合力の差を用いるので、結合力の差を極大化するためにＭＧＢ変形、ＰＮＡ使用などの追加的な費用が発生する。また、温度による区分性は、多種のＳＮＰを同時に分析する場合、すべての種類のプローブの特異性を保証することができない。
本発明では、ＲＴ−ＰＣＲ基盤のアレル−特異的プローブを使用するが、追加変形がなく、温度による区分性でなく酵素の特異性を用いることによって追加費用なしで検査特異性及び多種分析に長所を有する新たな検査方法を提示しようとする。
そこで、本発明者等は、現在普遍的に活用されているＲＴ−ＰＣＲを基盤にして使用し、プローブの５'−末端部位に検出しようとする単一塩基多型性（ＳＮＰ）部位が位置するようにデザインし、対立形質によって形成される５’−末端の非相補的フラップを誘導し、原核生物のＤＮＡポリメラーゼ、代表的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが有している５'−末端の非相補的フラップを除去するＦＥＮ活性を抑制すると、効果的に単一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出できる新たな検査方法が可能であることを確認し、本発明を完成した。
本発明者等は、原核生物のＤＮＡポリメラーゼ、代表的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性を抑制できる新たな方法を導出し、この原理を適用することによってプローブの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）に対する特異結合と非特異的結合を特定温度でなくＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの特性で区分できる方法を提供する。
本発明は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを初めとする原核生物のＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ特異性に適したプローブのデザイン方法を提供する。
また、本発明は、ＴａｑＭａｎプローブなどの多様な蛍光プローブのみならず、ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）を用いた非蛍光プローブを使用して低廉にＳＮＰを検査できる方法を提供する。
本発明によると、迅速でかつ敏感度と特異度に優れた新たな原理が適用された経済的な遺伝子突然変異検出手段が提供される。
本発明の方法によると、混成化結合時、プローブの５'−フラップ構造の塩基がないか又は一つであるプローブを使用する場合はＰＣＲ増幅産物が生成される一方、５'−フラップ構造が２塩基以上である場合はＰＣＲ増幅産物が生成されない。
本発明のリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた遺伝子突然変異検査方法は、５'−末端にクエンチャー顔料、３'−末端にリポーター顔料が結合された二重鎖プライマーを使用したり、顔料をプライマーに結合させる代わりに二重鎖に挿入したり、二重鎖の表面に付着する表面結合剤を用いるなど、従来のリアルタイムＰＣＲに使用されていたプライマーとプローブにも適用可能である。
また、本発明の方法は、従来の最も広く用いられるＴａｑＭａｎプローブも、プローブをＰＣＲ増幅産物の５'末端部位に位置させる場合に効果的に適用可能である。
さらに、従来の方法は、同時に多くの種類のＤＮＡを分析するとき、プローブのアニーリング温度差を用いたが、本発明の方法は、酵素の反応特異性を用いるので、アニーリング温度に敏感でないように多種のＳＮＰをタイプすることができる。
本発明は、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性抑制を用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制又は除去されたＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
本発明で用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はないが、具体的な例としては、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１）、パイロコッカス・
ヴェッセイ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロロバス・フマリ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ）、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はウルトラ（Ｕｌｔｒａ）ＤＮＡポリメラーゼなどを含む野生型又はその由来の変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝工学的かつ人工的に合成された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包括する。
ヴェッセイ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロロバス・フマリ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ）、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はウルトラ（Ｕｌｔｒａ）ＤＮＡポリメラーゼなどを含む野生型又はその由来の変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝工学的かつ人工的に合成された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包括する。
本発明において、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性の抑制又は除去は、プローブ及びプライマーを適切に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去する方法、ＤＮＡポリメラーゼの変異を通じて５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去する方法、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を添加する方法、その他の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす反応条件、例えば、塩イオンの濃度を調節するなどの方法で達成することができる。
このような方法のうち、本発明の実施例では、具体的にプローブ及びプライマーを適切に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法で本発明の目的を達成できることを提示した。
また、本発明は、前記５'−フラップエンドヌクレアーゼが増幅用前方プライマー５'−末端と検出用プローブの５'−末端を２４塩基−３８塩基以内に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制させることを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記検出用プローブが５'−末端にフラップ部位を有するプローブであることを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記検出用プローブの５'−末端が１塩基以上の連続的なフラップ構造又は非連続的フラップ構造を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記突然変異遺伝子が単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上を示すことを特徴とする。
また、本発明は、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法において、ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記遺伝子突然変異部位がプローブの５'−末端に位置することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記突然変異遺伝子が単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上を示すことを特徴とする。
また、本発明は、前記プローブが、対立形質によってＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるものであることを特徴とする。
また、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるプローブが、５'−フラップ塩基が一つである構造、５'−フラップ塩基が二つである構造、又は非連続的フラップ構造であって、５'−フラップ塩基が二つであり、末端塩基の一つはマッチされる構造であるＭｉｓ＋３（１）であることを特徴とする。
また、本発明は、１塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上の突然変異部位が、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制されるプローブの５'−末端に位置することを特徴とする。
また、本発明は、遺伝子突然変異検査用重合酵素連鎖反応キットにおいて、試料ＤＮＡ、二重鎖前方プライマー、二重鎖後方プライマー、プローブ及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、前記プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性を抑制するものであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記プローブが、リポーター顔料とクエンチャー顔料とが同時に修飾されているデュアルラベルプローブ又は非修飾プローブであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記二重鎖前方プライマー及び二重鎖後方プライマーがそれぞれ相補結合配列を含み、プローブは、リポーター顔料とクエンチャー顔料とが同時に修飾されているデュアルラベルプローブであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記非修飾プローブを使用する場合は、ＳＹＢＲ−グリーンなどのＤＮＡ二重結合に結合する挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）又は表面結合剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を付加することを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
本発明は、ＳＮＰなどの突然変異ＤＮＡを効果的に検出できる方法を開発し、遺伝疾患検査、腫瘍関連遺伝子検査などに臨床的に用いるためのものである。
本発明は、リアルタイムＰＣＲのために必要な一対のプライマー、二つのプライマーのうち一つ及び一部分の相補的な塩基配列で構成されながら標的遺伝子塩基配列などのプローブ、及び５'−ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異を検出することを特徴とする。
本発明者等は、５'−フラップ構造を認識して分解するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（Ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＦＥＮ）活性能力がＰＣＲ時に混成化結合されるプローブの位置によって変わり得ることを発見した（図１ａ）。この発見を用いて、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を用いた新たな概念のＳＮＰ検出方法を発明することができた（図１ｂ）。
本発明において、「ＮＳＴＳ（Ｎｏｖｅｌ ＳＮＰ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性の特異度を用いた本発明の新たなＳＮＰ検出用システムを総括的に称する。具体的に説明すると、プローブが標的塩基配列と混成化結合された後で形成されるプローブの５'末端構造にしたがってＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が変わるが、この現象を用いてＳＮＰなどの遺伝子突然変異を区別できる新たな検査システムを意味する。
本発明において、「ＴａｑＭａｎプローブ」という用語は、両末端にリポーターとクエンチャー機能が可能な蛍光物質が結合された変形オリゴヌクレオチドをいう。具体的に、リポーターはＦＡＭ、クエンチャーはＴＡＭＲＡを用いることができるが、必ずしもこれに制限されることはない。
本発明において、「ＮＳＴＳ／ｄｓｐ」という用語は、ＮＳＴＳに二重鎖プライマーが適用されたプローブを使用した場合を総称し、「ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎ」は、ＮＳＴＳにＴａｑＭａｎプローブを使用した場合を総称する。また、「ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン」は、ＮＳＴＳにＳＹＢＲグリーンシステムを使用した場合を総称する。
本発明において、５'−フラップ構造を認識して加水分解するＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性は、ＰＣＲ時に混成化結合されるプローブの位置によって変わり得る（図１）。具体的に、混成化結合時、５'−フラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置すると、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が制限され、プローブは分解されない。より具体的には、混成化結合時、プローブの５'−フラップ塩基が０個である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋０）及び１塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋１）を使用する場合はＰＣＲ増幅産物が生じる一方、５'−フラップ塩基が２塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋２）及び３塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋３）を使用する場合はＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が制限され、ＰＣＲ増幅産物が生成されない（図３ａ〜図３ｄ）。
本発明で適用可能なプライマーとプローブ類型としては、プライマーの５’−末端にクエンチャー、プローブの３’−末端にリポーターの機能が可能な蛍光物質が結合された変形オリゴヌクレオチドを使用するＤＳＰ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）システムを用いたＮＳＴＳ／ｄｓｐ（図４ａ）があり、ＳＹＢＲグリーン原理を適用した非修飾プライマー及びプローブを用いるＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン（図４ｂ）などの既存のリアルタイムＰＣＲに使用されるプライマーとプローブも可能である。
また、既存に最も幅広く活用されているＴａｑＭａｎプローブシステムの場合は、プローブの５'−フラップ部位が２塩基以上である場合もＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制されないが（図５ｂ）、ＴａｑＭａｎプローブをＰＣＲ産物の末端位置に適用させたＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎの場合は、プローブの５−フラップ部位が２塩基以上である場合、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制され、ＰＣＲ増幅産物が生じないことを確認することができた（図５ａ）。したがって、ＴａｑＭａｎプローブも、プローブがＰＣＲ産物の末端部位に位置する場合に効果的に適用可能であることを確認することができる。
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制される条件であるプローブのＰＣＲ産物内の末端位置は、プローブの５'−フラップ部位からＰＣＲ産物の５’−末端位置まで２８塩基〜３４塩基内に限定して使用可能であるが（図６ａ〜図６ｄ、図７ａ〜図７ｄ）、必ずしもこれに限定されることはない。
また、本発明では、特定ＳＮＰポイントを検査するのに使用されるＮＳＴＳプローブペアの５'−末端部位の構造を提供する。
また、本発明では、多様なＳＮＰ部位とこれに適切なＮＳＴＳプローブペアに対する適用を、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンを活用して検証することによって、Ｍｉｓ＋１／Ｍｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）／Ｍｉｓ＋３（１）（図９ｂ）或いはＭｉｓ＋２（１）／Ｍｉｓ＋２（図９ｃ）ペアのプローブが効果的にＳＮＰタイピングに使用できることが分かる。しかし、プローブの使用がこれら５'−末端構造にのみ限定して制限されることはない。
本発明は、プローブの相補結合温度差によってプローブを区分することを特徴とする既存の方法が有している同時多種分析及び温度敏感性の限界点を克服できる新たなＳＮＰタイピング方法を提供する。
本発明では、任意に選択された８種のＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン用プローブペアに対して同時にＲＴ−ＰＣＲを行い、これらプローブペアが同時に効果的にＳＮＰタイピングに使用できることを確認することができた（図１０）。また、同一の８種のプローブペアに対して異なるアニーリング温度（１０℃差）で反復的に行ったＲＴ−ＰＣＲ結果（図１０）も同一の結果を示すことによって、本発明のＳＮＰタイピング方法が、アニーリング温度に敏感でなく、酵素の反応特異性を用いて多種のプローブペアを区分できるので、同時に効果的に多種ＳＮＰをタイプできることを確認した（図１１）。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
ＤＮＡ試料準備
ラムダＤＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｎ３０１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡとして使用した。ラムダＤＮＡは、滅菌蒸留水を用いて希釈して１００ｐｇ／ｕｌ準備した。このように準備されたＤＮＡは、実験に使用するまで冷凍保管した。
ラムダＤＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｎ３０１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡとして使用した。ラムダＤＮＡは、滅菌蒸留水を用いて希釈して１００ｐｇ／ｕｌ準備した。このように準備されたＤＮＡは、実験に使用するまで冷凍保管した。
プライマー及びプローブ製作
ラムダＤＮＡの特定遺伝子部位をＰＣＲ増幅できるようにプライマーをデザインし、プローブは、増幅産物への混成化結合が可能な塩基配列を有するようにデザインした。蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）原理を適用するために蛍光物質が結合されたプライマーとプローブを使用した。デザインされたプライマー及びプローブは、本出願人である（株）ゼノテックのオリゴヌクレオチド合成システムを用いて製作した。
ラムダＤＮＡの特定遺伝子部位をＰＣＲ増幅できるようにプライマーをデザインし、プローブは、増幅産物への混成化結合が可能な塩基配列を有するようにデザインした。蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）原理を適用するために蛍光物質が結合されたプライマーとプローブを使用した。デザインされたプライマー及びプローブは、本出願人である（株）ゼノテックのオリゴヌクレオチド合成システムを用いて製作した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応及び確認
前記準備したラムダＤＮＡ試料を鋳型とし、準備したプライマー及びプローブを用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。使用したプライマーとプローブは各実施例に記載した。本実施例に使用したポリメラーゼ及び反応組成物は、３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（３１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、４．６５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２４ｍＭ ＫＣｌ、６２０ｍＭメチルグルコース、３．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３．１ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム又はＣＦＸ９６００リアルタイムシステムを用いてリアルタイムで確認した。
前記準備したラムダＤＮＡ試料を鋳型とし、準備したプライマー及びプローブを用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。使用したプライマーとプローブは各実施例に記載した。本実施例に使用したポリメラーゼ及び反応組成物は、３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（３１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、４．６５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２４ｍＭ ＫＣｌ、６２０ｍＭメチルグルコース、３．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３．１ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム又はＣＦＸ９６００リアルタイムシステムを用いてリアルタイムで確認した。
実施例１：二重鎖プライマー（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｒｉｍｅｒ；ＤＳＰ）システムを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応の増幅曲線確認試験
二重鎖を形成するプライマー／プローブを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応を行い、ＰＣＲ増幅曲線を確認する試験である。前方プライマーの５'−末端で４番目の配列からプローブと混成化結合する二重鎖プライマー／プローブである。前方プライマーの５'−末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡが、プローブの３−末端にはリポーターとしてＦＡＭが結合されている。
＊ＤＳＰ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
プローブ：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件：
９５℃、５分（１回）、
９５℃、１５秒−６０℃、４０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終容量を２０ｕｌにする。
二重鎖を形成するプライマー／プローブを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応を行い、ＰＣＲ増幅曲線を確認する試験である。前方プライマーの５'−末端で４番目の配列からプローブと混成化結合する二重鎖プライマー／プローブである。前方プライマーの５'−末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡが、プローブの３−末端にはリポーターとしてＦＡＭが結合されている。
＊ＤＳＰ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
プローブ：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件：
９５℃、５分（１回）、
９５℃、１５秒−６０℃、４０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終容量を２０ｕｌにする。
ＰＣＲ増幅産物が生成されることによってＤＳＰプローブが加水分解され、ＦＡＭの信号が漸次増加する典型的なＲＴ−ＰＣＲ信号が観察された。これにより、二重鎖を形成するプライマー／プローブがＲＴ−ＰＣＲ連鎖反応を妨害しないことを確認することができた（図２）。
実施例２：ＤＳＰプローブの５'−末端構造の特性によるリアルタイム重合酵素連鎖反応
ＤＳＰプローブの５−末端構造に変化を与えて、５'ヌクレアーゼ活性化程度の差を確認しようとした。プローブの５−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）、１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、及び３個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３）を使用して試験した。
＊プライマー
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋３：５'−ｃａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌに合わせた。
ＤＳＰプローブの５−末端構造に変化を与えて、５'ヌクレアーゼ活性化程度の差を確認しようとした。プローブの５−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）、１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、及び３個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３）を使用して試験した。
＊プライマー
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋３：５'−ｃａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌに合わせた。
図３で確認されるように、プローブの５−末端のフラップ構造にしたがってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性に差が表れることを確認することができる。Ｍｉｓ＋０とＭｉｓ＋１プローブを使用した試験ではＰＣＲ増幅曲線が増加を示すが、１個のフラップ構造を有するＭｉｓ＋１プローブを使用した場合の増幅曲線のＣｔ値がより大きい。Ｍｉｓ＋２とＭｉｓ＋３プローブを使用した試験では信号が増幅されなかった。このような結果は、既存のＴａｑＭａｎプローブと異なり、ＤＳＰプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置する点と、プローブの５−末端フラップ構造の差を反映したものと見える。また、このような結果は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ作用による遊離ＦＡＭの生成を５−末端のフラップ構造が抑制して発生したと推論することができる。
実施例３：多様なプローブ形態による５−末端フラップ構造を有するプローブのリアルタイム重合酵素連鎖反応
実施例２で発生した５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性抑制作用をさらに具体的に確認するために、ＤＳＰプローブとＳＹＢＲグリーンプローブ及び外側（Ｅｘｔｅｒｎａｌ）ＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＰＣＲ増幅産物のプローブ結合位置とプローブの５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５ヌクレアーゼ活性の差を確認しようとした。
実施例のプライマーとプローブＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記の通りである。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマー（図４ａ）
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＳＹＢＲグリーンプローブ試験用プライマー（図４ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ａ）
前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（Ｔａｋａｒａ）１ｕｌ（１０Ｘ）及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌにして使用した。
実施例２で発生した５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性抑制作用をさらに具体的に確認するために、ＤＳＰプローブとＳＹＢＲグリーンプローブ及び外側（Ｅｘｔｅｒｎａｌ）ＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＰＣＲ増幅産物のプローブ結合位置とプローブの５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５ヌクレアーゼ活性の差を確認しようとした。
実施例のプライマーとプローブＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記の通りである。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマー（図４ａ）
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＳＹＢＲグリーンプローブ試験用プライマー（図４ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ａ）
前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（Ｔａｋａｒａ）１ｕｌ（１０Ｘ）及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌにして使用した。
図４及び図５から分かるように、プローブの形態によってＰＣＲ増幅曲線が異なる形態を示す。前方プライマーとプローブが混成化結合されているＳＹＢＲグリーン、外側ＴａｑＭａｎプローブの場合、ＤＳＰと同様に、プローブ末端のフラップ構造にしたがってＰＣＲ増幅曲線の差を示した。すなわち、フラップ構造がないＭｉｓ＋０とフラップ構造が１個であるＭｉｓ＋１プローブは加水分解され、フラップ構造が２個であるＭｉｓ＋２にはＰＣＲ増幅曲線の増加がなかった（図４ａ、図４ｂ、図５ａ）。しかし、ＴａｑＭａｎプローブシステムの場合、プローブの種類とは関係なく信号が増幅された（図５ｂ）。このような結果により、ＰＣＲ増幅産物の末端にプローブが位置すると、５'−末端構造の差によってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性による信号の増幅の差が発生することを確認することができた。しかし、プローブがＰＣＲ増幅産物の中間に位置するＴａｑＭａｎプローブは、５'−末端構造と関係なくすべて加水分解されることを確認することができた。
実施例４：５'−エンドヌクレアーゼ活性化程度に影響を与えるＰＣＲ増幅産物の末端からプローブの混成化結合位置までの距離確認試験
５−末端がフラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置するとき、末端で距離がＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５−ヌクレアーゼ活性に影響を与えるか否かを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブ及びＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブが試験に使用された。それぞれの後方プライマーとプローブは固定させ、前方プライマーをＰＣＲ増幅産物の３'−末端方向に移動させて試験した。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端フラップ構造までの距離を基準とし、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの場合は、２３塩基、２６塩基、２８塩基、３０塩基に該当する前方プライマー（図６）を使用し、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブは２７塩基、３２塩基、３４塩基、３８塩基である（図７）。Ｍｉｓ＋２プローブは、Ｍｉｓ＋０の５'−末端に任意の２塩基を追加して合成した。
５−末端がフラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置するとき、末端で距離がＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５−ヌクレアーゼ活性に影響を与えるか否かを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブ及びＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブが試験に使用された。それぞれの後方プライマーとプローブは固定させ、前方プライマーをＰＣＲ増幅産物の３'−末端方向に移動させて試験した。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端フラップ構造までの距離を基準とし、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの場合は、２３塩基、２６塩基、２８塩基、３０塩基に該当する前方プライマー（図６）を使用し、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブは２７塩基、３２塩基、３４塩基、３８塩基である（図７）。Ｍｉｓ＋２プローブは、Ｍｉｓ＋０の５'−末端に任意の２塩基を追加して合成した。
＊ＳＹＢＲグリーン試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
ｉ）２３塩基前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
ｉｉ）２６塩基前方プライマー：５'−ｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａ−３'
ｉｉｉ）２８塩基前方プライマー：５'−ａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔ−３'
ｉｖ）３０塩基前方プライマー：５'−ｃａａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
ｉ）２７塩基前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
ｉｉ）３２塩基前方プライマー：５'−ａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔ−３'
ｉｉｉ）３４塩基前方プライマー：５'−ｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａ−３'
ｉｖ）３８塩基前方プライマー：５'−ｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌに合わせて使用した。
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
ｉ）２３塩基前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
ｉｉ）２６塩基前方プライマー：５'−ｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａ−３'
ｉｉｉ）２８塩基前方プライマー：５'−ａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔ−３'
ｉｖ）３０塩基前方プライマー：５'−ｃａａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
ｉ）２７塩基前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
ｉｉ）３２塩基前方プライマー：５'−ａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔ−３'
ｉｉｉ）３４塩基前方プライマー：５'−ｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａ−３'
ｉｖ）３８塩基前方プライマー：５'−ｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌに合わせて使用した。
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブでは、前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端までの距離が３０塩基で、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブでは３４塩基からＭｉｓ＋２プローブのＰＣＲ増幅曲線が増加した（図６及び図７）。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端までの距離がＮＳＴＳプローブの５フラップ構造認識において重要な要素であることを確認することができた。これは、ポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性の５'フラップを認識して切断するＦＥＮ活性が、５'フラップの末端から一定の長さ（約２８塩基〜３４塩基）以上であることが要求され、それ以下である場合、ＦＥＮの作用が円滑でないためと推定される。また、ＮＳＴＳを用いたＳＮＰなどの突然変異部位を区別するための診断用プライマー／プローブの設計時、二つの５−末端で混成化結合されているプローブの５'−末端までの距離を適切に（約２８塩基〜３０塩基以内）維持すると、目的とする区別が可能であることが分かった。
実施例５：ＳＮＰタイピングのためのプローブペアテスト
ＮＳＴＳプローブに対するポリメラーゼのＦＥＮ活性差を用いてプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングに適用しようとした。変異が予想される塩基（ＳＮＰポイント）を中心にＳＮＰの存在を仮定し、ＮＳＴＳ／ｄｓｐプローブのペアを作って試験した。
ｉ）プローブの５'−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）と１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、ｉｉ）１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｉｉ）５−末端の２番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２（１））と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｖ）５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の２番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した（図８）。
ＮＳＴＳプローブに対するポリメラーゼのＦＥＮ活性差を用いてプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングに適用しようとした。変異が予想される塩基（ＳＮＰポイント）を中心にＳＮＰの存在を仮定し、ＮＳＴＳ／ｄｓｐプローブのペアを作って試験した。
ｉ）プローブの５'−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）と１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、ｉｉ）１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｉｉ）５−末端の２番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２（１））と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｖ）５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の２番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した（図８）。
＊試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
ｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｖ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａｇａｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
ｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｖ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａｇａｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
プローブの５−末端のフラップ構造によって表れるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ＦＥＮ活性差を用いてＳＮＰタイプ時に表れ得る構造の差を予想し、前記４個のプローブペアで構成することができる。これを用いた試験結果、各セットのｂ）プローブがａ）プローブに比べてＣｔ値が小さいか、ＰＣＲ増幅曲線が増加しないことを確認することができた。特にｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）などのプローブセットは、プローブによってＰＣＲ増幅曲線がオン／オフに区分されるので、ＳＮＰタイピングに適用し、該当の対立遺伝子を判読するのに明確に用いることができるという長所を示す。
実施例６：ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンの多様なプローブペアを用いたＳＮＰタイピング適用検証
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングにＳＹＢＲグリーンを使用して実質的な適用可能性の有無を確認した。ラムダＤＮＡを鋳型として任意のＳＮＰポイントを指定し、５'−末端構造の変化によるＤＳＰプローブペアを定めた。使用したＤＳＰプローブペアは、Ｍｉｓ＋１とＭｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）とＭｉｓ＋３（１）（図９ｂ）、Ｍｉｓ＋２（１）とＭｉｓ＋２（図９ｃ）であった。
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングにＳＹＢＲグリーンを使用して実質的な適用可能性の有無を確認した。ラムダＤＮＡを鋳型として任意のＳＮＰポイントを指定し、５'−末端構造の変化によるＤＳＰプローブペアを定めた。使用したＤＳＰプローブペアは、Ｍｉｓ＋１とＭｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）とＭｉｓ＋３（１）（図９ｂ）、Ｍｉｓ＋２（１）とＭｉｓ＋２（図９ｃ）であった。
＊試験用プライマーとプローブ（図９ａ）
前方プライマー：５'−ｃｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔａａｃｃ−３'
後方プライマー：５'−ｔｇｇｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｃａｔｇｔａｃｃ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔａｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｃｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｂ）
前方プライマー：５'−ｔｃｔｃｇｇａａｔｇｃａｔｃｇｃｔｃａｇｔｇ−３'
後方プライマー：５'−ａｔｇｃｔｃａａｔｇｇａｔａｃａｔａｇａｃｇａｇｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｇｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａａｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｃ）
前方プライマー：５'−ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｔｔ−３'
後方プライマー：５'−ａａｇｔｔｃｔｃｇｇｃａｔｃａｃｃａｔｃｃｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
前方プライマー：５'−ｃｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔａａｃｃ−３'
後方プライマー：５'−ｔｇｇｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｃａｔｇｔａｃｃ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔａｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｃｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｂ）
前方プライマー：５'−ｔｃｔｃｇｇａａｔｇｃａｔｃｇｃｔｃａｇｔｇ−３'
後方プライマー：５'−ａｔｇｃｔｃａａｔｇｇａｔａｃａｔａｇａｃｇａｇｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｇｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａａｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｃ）
前方プライマー：５'−ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｔｔ−３'
後方プライマー：５'−ａａｇｔｔｃｔｃｇｇｃａｔｃａｃｃａｔｃｃｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
ＳＹＢＲグリーンを用いたＰＣＲ増幅曲線確認を通じて、任意に定めたＳＮＰポイントがプローブの５'−末端と一致或いは不一致することによって作られるフラップ構造によってＰＣＲ増幅曲線の増加と非増加とに区分されることを確認した。ＳＮＰポイントが不一致する場合は、ＰＣＲ増幅曲線が全く増加しないことによってＳＮＰタイピングを明確に区分することができる。これによって、本発明の方法を用いると、価格の高い顔料プローブを使用することなく、経済的に使用可能なＳＹＢＲグリーンなどのＤＮＡ二重結合に結合する挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）或いは表面結合剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を使用して簡便なＳＮＰタイピング適用が可能であることを確認した。
実施例７：リアルタイム重合酵素連鎖反応時にアニーリング温度差に影響を受けないＮＳＴＳプローブ作用の安定性確認試験
酵素作用の反応特異性によって区分されるＮＳＴＳプローブがリアルタイム重合酵素連鎖反応でアニーリング温度にどのような影響を受けるのかを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブを用いて残りのＰＣＲ条件は同一にし、アニーリング温度のみに変化を与えた。また、プローブは、５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の１番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー１ａ：５−ＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＧ−３
後方プライマー１ａｓ：５−ＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／１：５−ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／１：５−ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
酵素作用の反応特異性によって区分されるＮＳＴＳプローブがリアルタイム重合酵素連鎖反応でアニーリング温度にどのような影響を受けるのかを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブを用いて残りのＰＣＲ条件は同一にし、アニーリング温度のみに変化を与えた。また、プローブは、５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の１番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー１ａ：５−ＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＧ−３
後方プライマー１ａｓ：５−ＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／１：５−ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／１：５−ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
前方プライマー２ａ：５−ＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＣＣ−３
後方プライマー２ａｓ：５−ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／２：５−ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／２：５−ＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
後方プライマー２ａｓ：５−ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／２：５−ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／２：５−ＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
前方プライマー３ａ：５−ＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＣＴＴＡＣ−３
後方プライマー３ａｓ：５−ＡＴＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／３：５−ＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／３：５−ＴＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
前方プライマー４ａ：５−ＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＴ−３
後方プライマー３ａｓ：５−ＡＴＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／３：５−ＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／３：５−ＴＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
前方プライマー４ａ：５−ＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＴ−３
後方プライマー４ａｓ：５−ＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／４：５−ＴＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／４：５−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／４：５−ＴＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／４：５−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣ−３
前方プライマー５ａ：５−ＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴ−３
後方プライマー５ａｓ：５−ＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／５：５−ＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／５：５−ＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴ−３
後方プライマー５ａｓ：５−ＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／５：５−ＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／５：５−ＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴ−３
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件１
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件２
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−５４℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び５ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍメチルグルコース、５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）４ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的に総容量を２０ｕｌにして使用した。
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件２
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−５４℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び５ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍメチルグルコース、５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）４ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的に総容量を２０ｕｌにして使用した。
アニーリング温度に１０℃以上の変化を与えてＰＣＲを行ったが、図１０から分かるように、Ｃｔ値で大きな差を示しておらず、ターゲット−特異的プローブのＰＣＲ増幅曲線が温度変化と関係なく明確に区分されることを確認した。酵素による反応特異性によって区分性を示すＮＳＴＳのアレル−特異的プローブの作用がＰＣＲ温度に敏感でないことを確認することができ、このような結果は、本発明の方法が多くの種類のＳＮＰの同時分析に効果的であることを示している。
本発明によると、迅速でかつ敏感度と特異度に優れた新たな原理が適用された経済的な遺伝子突然変異検出手段が提供されるので、本発明の方法は、農、水、畜産物などの遺伝子突然変異検査や医学分野の診断などに幅広く用いることができる。
配列表の各配列は、突然変異遺伝子を検査する方法に関する本発明の構成を説明するために任意に製作されたプライマーとプローブなどである。
本出願は、中小企業庁がサポートする２０１４年度中小企業技術革新開発事業課題である「効率的でかつ経済的な遺伝子変異検査用分子診断プラットフォーム開発及び製品化」（課題番号Ｓ２１６６２５７）によって行われたものであることを明らかにする。
本発明は、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ突然変異を検出する方法に関する。より詳細に説明すると、ＤＮＡポリメラーゼ、具体的にファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ、より具体的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'−ＦＥＮ（５'−ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；以下、「ＦＥＮ」、「フラップエンドヌクレアーゼ」と混用する）活性を抑制する方法、抑制されたＦＥＮ活性を用いて単一塩基多型性（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、以下、ＳＮＰという）などの遺伝子突然変異を検査する方法、遺伝子突然変異検査用プローブのデザイン方法及び多様なプローブ類型に対する適用方法などのように、効果的でかつ精巧に遺伝子突然変異を検査できる新たでかつ効果的な方法に関する。
遺伝子の突然変異分析は、人間遺伝疾患診断、薬物遺伝学、薬物開発及び微生物学などの多様な科学分野でその重要性が強調されながら迅速に成長している。遺伝学分野において、突然変異は、ＤＮＡを構成する塩基配列の変化をいい、転座、逆位を初めとして特定遺伝子の挿入／欠失と単一塩基多型性（ＳＮＰ）を含む。これらのうち、ＳＮＰは最も一般的な形態のＤＮＡ塩基配列の変化であり、ヒト遺伝体の場合、１，０００塩基当たり１個の頻度で表れている（Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：９２８−９３３）。ヒト遺伝体上で、ＳＮＰは暗号化部位（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）よりは非暗号化部位（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）でより頻繁に表れ（ＬＩ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｌ．Ａ．１９９１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２９：５１３−５２３）、非暗号化部位のＳＮＰは進化学的な研究において分子マーカーとして使用されており、暗号化部位のＳＮＰは、遺伝子の機能、タンパク質の構造又は発現に影響を与え得るので、遺伝疾患研究及び診断においてマーカーとして使用されている（Ｋｉｍ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｉｓｒａ，Ａ．２００７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，９：２８９−３２０）。このように、分子マーカーとしてのＳＮＰを高い信頼度と敏感度で、迅速かつ経済的に分析できる多様な方法が開発されている（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．Ｃ．２００１．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２：９３０−９４２；Ｋｉｒｋ，Ｂ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：３２９５−３３１１；Ｋｗｏｋ，Ｐ−Ｙ．，２００２．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，１９：３１５−３２３）。
ＲＴ−ＰＣＲを用いるＳＮＰ分析方法は、最も広範囲に使用される方法であって、利用可能な遺伝情報が豊かになると共に、その活用度はより大きくなっている。ＲＴ−ＰＣＲは、他のＳＮＰ分析法に比べて速く、敏感度と特異度が高く、分析費用が低く、また、容易に自動化できるという長所を有する。なお、ＲＴ−ＰＣＲは、既存の一般ＰＣＲ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ）と異なり、アガロースゲルを用いる電気泳動分析が必要でないので、汚染による分析の誤りを最小化できるという長所も有する。
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＮＰを分析するためには、オリゴヌクレオチド形態のプローブ又はプライマーを用いるようになり、主に混成化プローブ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）、加水分解プローブ（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ又はＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）及びスコーピオンプライマー（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ）方法などが使用されている。混成化プローブを用いる突然変異分析方法としては、蛍光共鳴エネルギー伝達（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を原理とするＲｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムを使用する方法が常用化されている（Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１７６−１８１）。分析には二つの種類のプローブが使用され、ＦＲＥＴは、二つのプローブが標的ＤＮＡに隣接して混成化結合される場合に蛍光が発生する原理を用いたものである。混成化プローブを用いた突然変異分析は、ＰＣＲの終了後、溶融曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析することによって可能である。すなわち、突然変異で標的配列の一部の配列がプローブ配列と不一致する場合は、完璧に一致する場合より溶融温度が低いので、溶融曲線の様相に差を示すようになる（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，４：２３−２８）。混成化プローブと溶融曲線とを用いて突然変異を分析する方法は非常に速い分析方法であり、プローブデザインも相対的に容易である。しかし、溶融曲線は、実質的に常に期待する程度の突然変異判読能力を示すことができない。
加水分解プローブ方法は、ＰＣＲ反応時、プライマーと共に両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合されたプローブを使用し、蛍光共鳴エネルギー伝達原理を用いる。すなわち、リポーターとクエンチャーとが隣接している場合、リポーターから放出されたエネルギーが隣接したクエンチャーに転移され、蛍光は検出されないが、その後、ＰＣＲ増幅産物の増加と共に、標的遺伝子に結合されたプローブがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３’ヌクレアーゼ活性によって分解されながらリポーターの蛍光が発散される原理である。加水分解プローブ分析方法（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）は、標的塩基配列へのプローブの結合につながるヌクレアーゼ活性によるプローブの分解が起こり得る最適な条件を探すことが非常に重要である。すなわち、ＰＣＲに使用されるプライマーとプローブとが標的配列に混成化結合されると同時に、プローブが分解され得るＰＣＲ条件（ｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ）が重要である。これら二つの要求条件を充足するために、一般に２段階ＰＣＲが適用される。すなわち、９５℃で変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）段階が行われ、プローブのＴｍより７℃〜１０℃低い６０℃でアニーリングと延長が同時に行われる。過度に高い温度で反応を行うと、プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって分解されるよりは、標的から分離（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅ）され、蛍光は増加しなくなる（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００９．Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、蛍光物質を多様に使用し、ＳＮＰ検出又は突然変異分析が可能であるという長所を有する。しかし、この方法は、プローブの特異度を付与するために短いプローブを使用しなければならなく、これによってＴｍ値が必然的に低くなり、安定したアニーリング状態維持が難しくなる。これを克服するために、高価のＭＧＢ（Ｍｉｎｅｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）プローブ又はＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）プローブを使用しなければならないという短所を有する（Ｌｅｔｅｒｔｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，１７：３０７−３１１）。ＭＧＢ ＴａｑＭａｎプローブは、一般的なＴａｑＭａｎプローブと類似するが、３'末端にマイナーグルーブ結合部分を加えることによって、プローブの長さが短くてもＴｍが高いので、ＰＣＲ条件で安定したアニーリング状態を維持できるようにする（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：６５５−６６１）。ＭＧＢのように、別途の変形プローブを使用することなく、ＴａｑＭａｎプローブと共にＡＭＲＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣＲ原理を適用してＳＮＰを分析することもある（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２９：１３２）。しかし、ＡＲＭＳ ＰＣＲは、ＳＮＰを区分できる最適のＰＣＲ条件を探すことが非常に難しい（Ｐｕｎｉａ Ｐ．ａｎｄ ＳＡｕｎｄｅｒｓ．Ｎ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｒｉｚｏｎｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒｂｏｏｋｓ）。
分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）とスコーピオンプライマー（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）は、ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を含む構造化された探針（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｐｒｏｂｅｓ）であって、混成化プローブやＴａｑＭａｎプローブなどの線形プローブより相対的に高い特異度を示し、ミスマッチ識別能力に優れるので、類似する配列の区別又はＳＮＰと対立形質の区分に適している。しかし、ループ構造を有するプローブをデザインすることが非常に難しいので、一般に、多くの種類のプローブを製作して実験した後、目的とする結果を得ることができるプローブを確保しにくい（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１７１−６１７６；Ｂｒｏｕｄｅ，Ｎ．Ｅ．２００２．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０；２４９−２５６．；Ｔａｐｐ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８：７３２−７３８）。
最も代表的に使用されているリアルタイム重合酵素反応法は、加水分解プローブ方式であるＴａｑＭａｎ分析方法であり、これに適用された基本原理は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが保有している５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を用いるものである。１９９１年、Ｈｏｌｌａｎｄ等は、鋳型ＤＮＡと相補的塩基配列を有するプローブを使用する場合、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性によって特定ＰＣＲ反応をリアルタイムで確認できることを明らかにした。また、このときに使用されるプローブは、鋳型ＤＮＡと１００％相補性を有する場合のみならず、５'−末端の非相補的フラップ（ｆｌａｐ）部位を有するプローブも区分なしでＴａｑ ＤＮＡの５’→３'エキソヌクレアーゼ活性によって分解されることを確認した（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：７２７６−７２８０）。その後、この方法を基盤にして蛍光顔料で修飾されたプローブを活用した多様なＲＴ−ＰＣＲ技法が開発され、多くの分野で広範囲に活用されている（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６．９８６−９９４．；Ｌｉｖａｋ Ｋ．Ｊ．１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４：１４３−１４９）。
一般に、眞核生物（ｅｕｋａｒｙａ）と古細菌類（ａｒｃｈａｅａ）は、ＤＮＡポリメラーゼとＦＥＮ１ヌクレアーゼ（Ｌｉｅｂｅｒ，Ｍ．Ｒ．，１９９７．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：２３３−２４０）と呼ばれるＤＮＡエンドヌクレアーゼＩＶが区分されており、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ１）は、ＤＮＡの複製と修繕過程で生成される５'−フラップを除去する重要な役割をするものと知られている（Ｒｏｓｓｉ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０６，４５３−４７３，Ｋｉｍ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：８８４２−８８４８：Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｔ．１９９７．ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３３４１−３３４８）。特に、眞核生物のＦＥＮは、癌、ウイルス性疾病の進行などと連関しており、新薬開発のためにＦＥＮ、特にＦＥＮ−１の活性阻害剤に対する関心が非常に大きくなっている（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｊ．ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１８：５６７−７５）。
その一方で、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）を含む原核生物ファミリーＡポリメラーゼの場合は、一つのタンパク質内に５'−ヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼが互いに異なるドメインに存在し、５'−ヌクレアーゼは一般的な５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の他に５’−フラップを除去するエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性を同時に有しているものと知られている（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：７７８−７８３）。
上述したＨｏｌｌａｎｄ等の実験結果は、使用されるプローブの５'−末端にフラップ部位が存在する場合は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３’エキソヌクレアーゼ活性でなくＦＥＮ活性によるものであることが分かる。しかし、ＴａｑＭａｎプローブを使用する既存の方法では、５'→３’エキソヌクレアーゼとＦＥＮ活性を区別することなく、総称して５'−ヌクレアーゼとして使用している。２００５年に発表されたインベーダーアッセイ（Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ）（Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｍ．，２００５．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，５７３：１０３−１１０）は、熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）ＦＥＮ酵素の特性を用いてＳＮＰを検出できる方法を提示したが、回転信号増幅でなく等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）反応に起因する低い敏感度のため幅広く活用されてはいない。
前記のように多様な分子診断技術などが開発されてきたが、依然として十分な敏感度と特異性を有する分子診断技術の開発が必要である。特に遺伝子変異を効果的に検査するための多くの方法が活用されているが、検査時間、費用、特異度、敏感度及び多種検査などの実際の臨床で必要とする問題をすべて満足させる検査法は存在していない。
ＴａｑＭａｎプローブなどの多くの方法は、ＳＮＰを区分するために特定温度でアレル特異的（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プローブの相補的結合を基本的原理として使用する。これらの方法は、単純に温度によるプローブの相補的結合力の差を用いるので、結合力の差を極大化するためにＭＧＢ変形、ＰＮＡ使用などの追加的な費用が発生する。また、温度による区分性は、多種のＳＮＰを同時に分析する場合、すべての種類のプローブの特異性を保証することができない。
本発明では、ＲＴ−ＰＣＲ基盤のアレル−特異的プローブを使用するが、追加変形がなく、温度による区分性でなく酵素の特異性を用いることによって追加費用なしで検査特異性及び多種分析に長所を有する新たな検査方法を提示しようとする。
そこで、本発明者等は、現在普遍的に活用されているＲＴ−ＰＣＲを基盤にして使用し、プローブの５'−末端部位に検出しようとする単一塩基多型性（ＳＮＰ）部位が位置するようにデザインし、対立形質によって形成される５’−末端の非相補的フラップを誘導し、原核生物のＤＮＡポリメラーゼ、代表的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが有している５'−末端の非相補的フラップを除去するＦＥＮ活性を抑制すると、効果的に単一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出できる新たな検査方法が可能であることを確認し、本発明を完成した。
本発明者等は、原核生物のＤＮＡポリメラーゼ、代表的にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性を抑制できる新たな方法を導出し、この原理を適用することによってプローブの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）に対する特異結合と非特異的結合を特定温度でなくＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの特性で区分できる方法を提供する。
本発明は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを初めとする原核生物のＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ特異性に適したプローブのデザイン方法を提供する。
また、本発明は、ＴａｑＭａｎプローブなどの多様な蛍光プローブのみならず、ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）を用いた非蛍光プローブを使用して低廉にＳＮＰを検査できる方法を提供する。
本発明において、「ＮＳＴＳ（Ｎｏｖｅｌ ＳＮＰ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性の特異度を用いた本発明の新たなＳＮＰ検出用システムを総括的に称し、「ＮＳＴプローブシステム」と混用する。具体的に説明すると、プローブが標的塩基配列と混成化結合された後で形成されるプローブの５'末端構造にしたがってＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が変わるが、この現象を用いてＳＮＰなどの遺伝子突然変異を区別できる新たな検査システムを意味する。
本発明において、「ＴａｑＭａｎプローブ」という用語は、両末端にリポーターとクエンチャー機能が可能な蛍光物質が結合された変形オリゴヌクレオチドをいう。具体的に、リポーターはＦＡＭ、クエンチャーはＴＡＭＲＡを用いることができるが、必ずしもこれに制限されることはない。
本発明において、「ＮＳＴＳ／ｄｓｐ」という用語は、ＮＳＴＳに二重鎖プライマーが適用されたプローブを使用した場合を総称し、「ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎ」は、ＮＳＴＳにＴａｑＭａｎプローブを使用した場合を総称する。また、「ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン」は、ＮＳＴＳにＳＹＢＲグリーンシステムを使用した場合を総称する。
本発明によると、迅速でかつ敏感度と特異度に優れた新たな原理が適用された経済的な遺伝子突然変異検出手段が提供される。
本発明の方法によると、混成化結合時、プローブの５'−フラップ構造の塩基がないか又は一つであるプローブを使用する場合はＰＣＲ増幅産物が生成される一方、５'−フラップ構造が２塩基以上である場合はＰＣＲ増幅産物が生成されない。
本発明のリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた遺伝子突然変異検査方法は、５'−末端にクエンチャー顔料、３'−末端にリポーター顔料が結合された二重鎖プライマーを使用したり、顔料をプライマーに結合させる代わりに二重鎖に挿入したり、二重鎖の表面に付着する表面結合剤を用いるなど、従来のリアルタイムＰＣＲに使用されていたプライマーとプローブにも適用可能である。
また、本発明の方法は、従来の最も広く用いられるＴａｑＭａｎプローブも、プローブをＰＣＲ増幅産物の５'末端部位に位置させる場合に効果的に適用可能である。
さらに、従来の方法は、同時に多くの種類のＤＮＡを分析するとき、プローブのアニーリング温度差を用いたが、本発明の方法は、酵素の反応特異性を用いるので、アニーリング温度に敏感でないように多種のＳＮＰをタイプすることができる。
本発明は、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性抑制を用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制又は除去されたＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
本発明で用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はないが、具体的な例としては、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１）、パイロコッカス・
ヴェッセイ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロロバス・フマリ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ）、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はウルトラ（Ｕｌｔｒａ）ＤＮＡポリメラーゼなどを含む野生型又はその由来の変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝工学的かつ人工的に合成された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包括する。
ヴェッセイ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロロバス・フマリ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ）、メタノピュルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はウルトラ（Ｕｌｔｒａ）ＤＮＡポリメラーゼなどを含む野生型又はその由来の変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、遺伝工学的かつ人工的に合成された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを包括する。
本発明において、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性の抑制は、プローブ及びプライマーを適切に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法、ＤＮＡポリメラーゼの変異を通じて５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を添加する方法、その他の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす反応条件、例えば、塩イオンの濃度を調節するなどの方法で達成することができる。
このような方法のうち、本発明の実施例では、具体的に、重合酵素連鎖反応産物と対をなすプローブを適切に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制する方法で本発明の目的を達成できることを提示した。
また、本発明は、ＰＣＲ産物と対をなす検出用プローブの５'−末端をＰＣＲ産物の５'−末端から２４塩基−３８塩基以内に位置させることによって５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制させることを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記検出用プローブが５'−末端にフラップ部位を有するプローブであることを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記検出用プローブの５'−末端が２塩基以上の連続的なフラップ構造又は非連続的フラップ構造を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記突然変異遺伝子が単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び挿入のうち一つ以上を示すことを特徴とする。
また、本発明は、５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法において、ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記遺伝子突然変異部位がＰＣＲ産物と対をなすプローブの５'−末端に位置することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法に関する。
また、本発明は、前記突然変異遺伝子が単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び挿入のうち一つ以上を示すことを特徴とする。
また、本発明は、前記プローブが、対立形質によってＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるものであることを特徴とする。
また、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるプローブが、５'−フラップ塩基が一つである構造、５'−フラップ塩基が二つである構造、又は非連続的フラップ構造であって、５'−フラップ塩基が二つであり、末端塩基の一つはマッチされる構造であるＭｉｓ＋３（１）であることを特徴とする。
また、本発明は、１塩基以上の欠失、置換及び挿入のうち一つ以上の突然変異部位が、ＰＣＲ産物と対をなすプローブの５'−末端に位置することを特徴とする。
また、本発明は、遺伝子突然変異検査用重合酵素連鎖反応キットにおいて、試料ＤＮＡ、前方プライマー、後方プライマー、プローブ及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、前記プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性を抑制するものであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記プローブが、リポーター顔料とクエンチャー顔料とが同時に修飾されているデュアルラベルプローブ又は非修飾プローブであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記前方プライマー及び後方プライマーがそれぞれ相補結合配列を含み、プローブは、リポーター顔料とクエンチャー顔料とが同時に修飾されているデュアルラベルプローブであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
また、本発明は、前記非修飾プローブを使用する場合は、ＳＹＢＲ−グリーンなどのＤＮＡ二重結合に結合する挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）又は表面結合剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を付加することを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キットに関する。
本発明は、ＳＮＰなどの突然変異ＤＮＡを効果的に検出できる方法を開発し、遺伝疾患検査、腫瘍関連遺伝子検査などに臨床的に用いるためのものである。
本発明は、リアルタイムＰＣＲのために必要な一対のプライマー、二つのプライマーのうち一つ及び一部分の相補的な塩基配列で構成されながら標的遺伝子塩基配列などのプローブ、及び５'−ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて突然変異を検出することを特徴とする。
本発明者等は、５'−フラップ構造を認識して分解するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（Ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；ＦＥＮ）活性能力がＰＣＲ時に混成化結合されるプローブの位置によって変わり得ることを発見した（図１ａ）。この発見を用いて、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を用いた新たな概念のＳＮＰ検出方法を発明することができた（図１ｂ）。
本発明において、５'−フラップ構造を認識して加水分解するＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性は、ＰＣＲ時に混成化結合されるプローブの位置によって変わり得る（図１）。具体的に、混成化結合時、５'−フラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置すると、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が制限され、プローブは分解されない。より具体的には、混成化結合時、プローブの５'−フラップ塩基が０個である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋０）及び１塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋１）を使用する場合はＰＣＲ増幅産物が生じる一方、５'−フラップ塩基が２塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋２）及び３塩基である構造を有するプローブ（以下、Ｍｉｓ＋３）を使用する場合はＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が制限され、ＰＣＲ増幅産物が生成されない（図３ａ〜図３ｄ）。
本発明で適用可能なプライマーとプローブ類型としては、プライマーの５’−末端にクエンチャー、プローブの３’−末端にリポーターの機能が可能な蛍光物質が結合された変形オリゴヌクレオチドを使用するＤＳＰ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）システムを用いたＮＳＴＳ／ｄｓｐ（図４ａ）があり、ＳＹＢＲグリーン原理を適用した非修飾プライマー及びプローブを用いるＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン（図４ｂ）などの既存のリアルタイムＰＣＲに使用されるプライマーとプローブも可能である。
また、既存に最も幅広く活用されているＴａｑＭａｎプローブシステムの場合は、プローブの５'−フラップ部位が２塩基以上である場合もＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制されないが（図５ｂ）、ＴａｑＭａｎプローブをＰＣＲ産物の末端位置に適用させたＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎの場合は、プローブの５−フラップ部位が２塩基以上である場合、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制され、ＰＣＲ増幅産物が生じないことを確認することができた（図５ａ）。したがって、ＴａｑＭａｎプローブも、ＰＣＲ産物の末端部位に位置させる場合、本発明の方法を効果的に適用可能であることを確認することができる。
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制される条件であるプローブのＰＣＲ産物内の末端位置は、プローブの５'−フラップ部位からＰＣＲ産物の５’−末端位置まで２８塩基〜３４塩基内に限定して使用可能であるが（図６ａ〜図６ｄ、図７ａ〜図７ｄ）、必ずしもこれに限定されることはない。
また、本発明では、特定ＳＮＰポイントを検査するのに使用されるＮＳＴＳプローブペアの５'−末端部位の構造を提供する。
また、本発明では、多様なＳＮＰ部位とこれに適切なＮＳＴＳプローブペアに対する適用を、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンを活用して検証することによって、Ｍｉｓ＋１／Ｍｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）／Ｍｉｓ＋３（１）（図９ｂ）或いはＭｉｓ＋２（１）／Ｍｉｓ＋２（図９ｃ）ペアのプローブが効果的にＳＮＰタイピングに使用できることが分かる。しかし、プローブの使用がこれら５'−末端構造にのみ限定して制限されることはない。
本発明は、プローブの相補結合温度差によってプローブを区分することを特徴とする既存の方法が有している同時多種分析及び温度敏感性の限界点を克服できる新たなＳＮＰタイピング方法を提供する。
本発明では、任意に選択された８種のＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーン用プローブペアに対して同時にＲＴ−ＰＣＲを行い、これらプローブペアが同時に効果的にＳＮＰタイピングに使用できることを確認することができた（図１０）。また、同一の８種のプローブペアに対して異なるアニーリング温度（１０℃差）で反復的に行ったＲＴ−ＰＣＲ結果（図１０）も同一の結果を示すことによって、本発明のＳＮＰタイピング方法が、アニーリング温度に敏感でなく、酵素の反応特異性を用いて多種のプローブペアを区分できるので、同時に効果的に多種ＳＮＰをタイプできることを確認した（図１１）。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
ＤＮＡ試料準備
ラムダＤＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｎ３０１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡとして使用した。ラムダＤＮＡは、滅菌蒸留水を用いて希釈して１００ｐｇ／ｕｌ準備した。このように準備されたＤＮＡは、実験に使用するまで冷凍保管した。
ラムダＤＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｎ３０１１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）をＰＣＲ用鋳型ＤＮＡとして使用した。ラムダＤＮＡは、滅菌蒸留水を用いて希釈して１００ｐｇ／ｕｌ準備した。このように準備されたＤＮＡは、実験に使用するまで冷凍保管した。
プライマー及びプローブ製作
ラムダＤＮＡの特定遺伝子部位をＰＣＲ増幅できるようにプライマーをデザインし、プローブは、増幅産物への混成化結合が可能な塩基配列を有するようにデザインした。蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）原理を適用するために蛍光物質が結合されたプライマーとプローブを使用した。デザインされたプライマー及びプローブは、本出願人である（株）ゼノテックのオリゴヌクレオチド合成システムを用いて製作した。
ラムダＤＮＡの特定遺伝子部位をＰＣＲ増幅できるようにプライマーをデザインし、プローブは、増幅産物への混成化結合が可能な塩基配列を有するようにデザインした。蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）原理を適用するために蛍光物質が結合されたプライマーとプローブを使用した。デザインされたプライマー及びプローブは、本出願人である（株）ゼノテックのオリゴヌクレオチド合成システムを用いて製作した。
ＲＴ−ＰＣＲ反応及び確認
前記準備したラムダＤＮＡ試料を鋳型とし、準備したプライマー及びプローブを用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。使用したプライマーとプローブは各実施例に記載した。本実施例に使用したポリメラーゼ及び反応組成物は、３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（３１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、４．６５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２４ｍＭ ＫＣｌ、６２０ｍＭメチルグルコース、３．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３．１ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム又はＣＦＸ９６００リアルタイムシステムを用いてリアルタイムで確認した。
前記準備したラムダＤＮＡ試料を鋳型とし、準備したプライマー及びプローブを用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。使用したプライマーとプローブは各実施例に記載した。本実施例に使用したポリメラーゼ及び反応組成物は、３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（３１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、４．６５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２４ｍＭ ＫＣｌ、６２０ｍＭメチルグルコース、３．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、３．１ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物は、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステム又はＣＦＸ９６００リアルタイムシステムを用いてリアルタイムで確認した。
実施例１：二重鎖プライマー（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｒｉｍｅｒ；ＤＳＰ）システムを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応の増幅曲線確認試験
二重鎖を形成するプライマー／プローブを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応を行い、ＰＣＲ増幅曲線を確認する試験である。前方プライマーの５'−末端で４番目の配列からプローブと混成化結合する二重鎖プライマー／プローブである。前方プライマーの５'−末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡが、プローブの３−末端にはリポーターとしてＦＡＭが結合されている。
＊ＤＳＰ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
プローブ：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件：
９５℃、５分（１回）、
９５℃、１５秒−６０℃、４０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終容量を２０ｕｌにする。
二重鎖を形成するプライマー／プローブを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応を行い、ＰＣＲ増幅曲線を確認する試験である。前方プライマーの５'−末端で４番目の配列からプローブと混成化結合する二重鎖プライマー／プローブである。前方プライマーの５'−末端にはクエンチャーとしてＴＡＭＲＡが、プローブの３−末端にはリポーターとしてＦＡＭが結合されている。
＊ＤＳＰ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
プローブ：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件：
９５℃、５分（１回）、
９５℃、１５秒−６０℃、４０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終容量を２０ｕｌにする。
ＰＣＲ増幅産物が生成されることによってＤＳＰプローブが加水分解され、ＦＡＭの信号が漸次増加する典型的なＲＴ−ＰＣＲ信号が観察された。これにより、二重鎖を形成するプライマー／プローブがＲＴ−ＰＣＲ連鎖反応を妨害しないことを確認することができた（図２）。
実施例２：ＤＳＰプローブの５'−末端構造の特性によるリアルタイム重合酵素連鎖反応
ＤＳＰプローブの５−末端構造に変化を与えて、５'ヌクレアーゼ活性化程度の差を確認しようとした。プローブの５−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）、１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、及び３個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３）を使用して試験した。
＊プライマー
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋３：５'−ｃａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌに合わせた。
ＤＳＰプローブの５−末端構造に変化を与えて、５'ヌクレアーゼ活性化程度の差を確認しようとした。プローブの５−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）、１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、及び３個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３）を使用して試験した。
＊プライマー
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋３：５'−ｃａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＲＴ−ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、前記２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどのリアルタイムＰＣＲに必要な反応組成物があらかじめ混合された３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌに合わせた。
図３で確認されるように、プローブの５−末端のフラップ構造にしたがってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性に差が表れることを確認することができる。Ｍｉｓ＋０とＭｉｓ＋１プローブを使用した試験ではＰＣＲ増幅曲線が増加を示すが、１個のフラップ構造を有するＭｉｓ＋１プローブを使用した場合の増幅曲線のＣｔ値がより大きい。Ｍｉｓ＋２とＭｉｓ＋３プローブを使用した試験では信号が増幅されなかった。このような結果は、既存のＴａｑＭａｎプローブと異なり、ＤＳＰプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置する点と、プローブの５−末端フラップ構造の差を反映したものと見える。また、このような結果は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ作用による遊離ＦＡＭの生成を５−末端のフラップ構造が抑制して発生したと推論することができる。
実施例３：多様なプローブ形態による５−末端フラップ構造を有するプローブのリアルタイム重合酵素連鎖反応
実施例２で発生した５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性抑制作用をさらに具体的に確認するために、ＤＳＰプローブとＳＹＢＲグリーンプローブ及び外側（Ｅｘｔｅｒｎａｌ）ＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＰＣＲ増幅産物のプローブ結合位置とプローブの５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５ヌクレアーゼ活性の差を確認しようとした。
実施例のプライマーとプローブＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記の通りである。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマー（図４ａ）
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＳＹＢＲグリーンプローブ試験用プライマー（図４ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ａ）
前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（Ｔａｋａｒａ）１ｕｌ（１０Ｘ）及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌにして使用した。
実施例２で発生した５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）活性抑制作用をさらに具体的に確認するために、ＤＳＰプローブとＳＹＢＲグリーンプローブ及び外側（Ｅｘｔｅｒｎａｌ）ＴａｑＭａｎプローブとＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＰＣＲ増幅産物のプローブ結合位置とプローブの５'−末端構造によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５ヌクレアーゼ活性の差を確認しようとした。
実施例のプライマーとプローブＲＴ−ＰＣＲ条件は、下記の通りである。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマー（図４ａ）
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊ＳＹＢＲグリーンプローブ試験用プライマー（図４ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
＊プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ａ）
前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ（図５ｂ）
前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋１：５'−ＦＡＭ−ａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（Ｔａｋａｒａ）１ｕｌ（１０Ｘ）及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌにして使用した。
図４及び図５から分かるように、プローブの形態によってＰＣＲ増幅曲線が異なる形態を示す。前方プライマーとプローブが混成化結合されているＳＹＢＲグリーン、外側ＴａｑＭａｎプローブの場合、ＤＳＰと同様に、プローブ末端のフラップ構造にしたがってＰＣＲ増幅曲線の差を示した。すなわち、フラップ構造がないＭｉｓ＋０とフラップ構造が１個であるＭｉｓ＋１プローブは加水分解され、フラップ構造が２個であるＭｉｓ＋２にはＰＣＲ増幅曲線の増加がなかった（図４ａ、図４ｂ、図５ａ）。しかし、ＴａｑＭａｎプローブシステムの場合、プローブの種類とは関係なく信号が増幅された（図５ｂ）。このような結果により、ＰＣＲ増幅産物の末端にプローブが位置すると、５'−末端構造の差によってＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性による信号の増幅の差が発生することを確認することができた。しかし、プローブがＰＣＲ増幅産物の中間に位置するＴａｑＭａｎプローブは、５'−末端構造と関係なくすべて加水分解されることを確認することができた。
実施例４：５'−エンドヌクレアーゼ活性化程度に影響を与えるＰＣＲ増幅産物の末端からプローブの混成化結合位置までの距離確認試験
５−末端がフラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置するとき、末端で距離がＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５−ヌクレアーゼ活性に影響を与えるか否かを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブ及びＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブが試験に使用された。それぞれの後方プライマーとプローブは固定させ、前方プライマーをＰＣＲ増幅産物の３'−末端方向に移動させて試験した。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端フラップ構造までの距離を基準とし、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの場合は、２３塩基、２６塩基、２８塩基、３０塩基に該当する前方プライマー（図６）を使用し、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブは２７塩基、３２塩基、３４塩基、３８塩基である（図７）。Ｍｉｓ＋２プローブは、Ｍｉｓ＋０の５'−末端に任意の２塩基を追加して合成した。
５−末端がフラップ構造を有するプローブがＰＣＲ増幅産物の末端に位置するとき、末端で距離がＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５−ヌクレアーゼ活性に影響を与えるか否かを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブ及びＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブが試験に使用された。それぞれの後方プライマーとプローブは固定させ、前方プライマーをＰＣＲ増幅産物の３'−末端方向に移動させて試験した。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端フラップ構造までの距離を基準とし、ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの場合は、２３塩基、２６塩基、２８塩基、３０塩基に該当する前方プライマー（図６）を使用し、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブは２７塩基、３２塩基、３４塩基、３８塩基である（図７）。Ｍｉｓ＋２プローブは、Ｍｉｓ＋０の５'−末端に任意の２塩基を追加して合成した。
＊ＳＹＢＲグリーン試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
ｉ）２３塩基前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
ｉｉ）２６塩基前方プライマー：５'−ｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａ−３'
ｉｉｉ）２８塩基前方プライマー：５'−ａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔ−３'
ｉｖ）３０塩基前方プライマー：５'−ｃａａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
ｉ）２７塩基前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
ｉｉ）３２塩基前方プライマー：５'−ａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔ−３'
ｉｉｉ）３４塩基前方プライマー：５'−ｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａ−３'
ｉｖ）３８塩基前方プライマー：５'−ｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌに合わせて使用した。
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−３'
ｉ）２３塩基前方プライマー：５'−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
ｉｉ）２６塩基前方プライマー：５'−ｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａ−３'
ｉｉｉ）２８塩基前方プライマー：５'−ａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔ−３'
ｉｖ）３０塩基前方プライマー：５'−ｃａａａｇｃａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａ−３'
＊外側ＴａｑＭａｎプローブ試験用プライマーとプローブ
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
プローブ
Ｍｉｓ＋０：５'−ＦＡＭ−ｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ＦＡＭ−ｃａｃｇａｔａｔａｔｔｃａｃｔｃａｇｃａａｃｃｃｃｇ−ＴＡＭＲＡ−３'
ｉ）２７塩基前方プライマー：５'−ｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔｇａａｔａｔａ−３'
ｉｉ）３２塩基前方プライマー：５'−ａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａｇｔ−３'
ｉｉｉ）３４塩基前方プライマー：５'−ｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇｃｔｇａ−３'
ｉｖ）３８塩基前方プライマー：５'−ｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃｃｇｇｇｇｔｔｇ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（３５回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１Ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量２０ｕｌに合わせて使用した。
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブでは、前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端までの距離が３０塩基で、ＮＳＴＳ／ｔａｑｍａｎプローブでは３４塩基からＭｉｓ＋２プローブのＰＣＲ増幅曲線が増加した（図６及び図７）。前方プライマー５−末端で混成化結合されているプローブの５−末端までの距離がＮＳＴＳプローブの５フラップ構造認識において重要な要素であることを確認することができた。これは、ポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性の５'フラップを認識して切断するＦＥＮ活性が、５'フラップの末端から一定の長さ（約２８塩基〜３４塩基）以上であることが要求され、それ以下である場合、ＦＥＮの作用が円滑でないためと推定される。また、ＮＳＴＳを用いたＳＮＰなどの突然変異部位を区別するための診断用プライマー／プローブの設計時、二つの５−末端で混成化結合されているプローブの５'−末端までの距離を適切に（約２８塩基〜３０塩基以内）維持すると、目的とする区別が可能であることが分かった。
実施例５：ＳＮＰタイピングのためのプローブペアテスト
ＮＳＴＳプローブに対するポリメラーゼのＦＥＮ活性差を用いてプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングに適用しようとした。変異が予想される塩基（ＳＮＰポイント）を中心にＳＮＰの存在を仮定し、ＮＳＴＳ／ｄｓｐプローブのペアを作って試験した。
ｉ）プローブの５'−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）と１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、ｉｉ）１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｉｉ）５−末端の２番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２（１））と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｖ）５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の２番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した（図８）。
ＮＳＴＳプローブに対するポリメラーゼのＦＥＮ活性差を用いてプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングに適用しようとした。変異が予想される塩基（ＳＮＰポイント）を中心にＳＮＰの存在を仮定し、ＮＳＴＳ／ｄｓｐプローブのペアを作って試験した。
ｉ）プローブの５'−末端構造は、フラップ構造がないプローブ（Ｍｉｓ＋０）と１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）、ｉｉ）１個の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋１）と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｉｉ）５−末端の２番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２（１））と２個のフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋２）、ｉｖ）５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の２番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した（図８）。
＊試験用プライマーとプローブ
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
ｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｖ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａｇａｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
前方プライマー：５'−ＴＡＭＲＡ−ｇｃｃｇｃｇｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇａｔａｃ−３'
後方プライマー：５'−ｃｇｇｃｃｔｇａａｃａｇｔｇａｇｃｇａａｇ−３'
ｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋０：５'−ｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋１：５'−ｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｉｉ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋２：５'−ａｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｉｖ）プローブセット
ａ）Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｃｔｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
ｂ）Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａｇａｃｃｇｇｔａｔｃａｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｇｃ−ＦＡＭ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６０℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
プローブの５−末端のフラップ構造によって表れるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'ＦＥＮ活性差を用いてＳＮＰタイプ時に表れ得る構造の差を予想し、前記４個のプローブペアで構成することができる。これを用いた試験結果、各セットのｂ）プローブがａ）プローブに比べてＣｔ値が小さいか、ＰＣＲ増幅曲線が増加しないことを確認することができた。特にｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）などのプローブセットは、プローブによってＰＣＲ増幅曲線がオン／オフに区分されるので、ＳＮＰタイピングに適用し、該当の対立遺伝子を判読するのに明確に用いることができるという長所を示す。
実施例６：ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンの多様なプローブペアを用いたＳＮＰタイピング適用検証
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングにＳＹＢＲグリーンを使用して実質的な適用可能性の有無を確認した。ラムダＤＮＡを鋳型として任意のＳＮＰポイントを指定し、５'−末端構造の変化によるＤＳＰプローブペアを定めた。使用したＤＳＰプローブペアは、Ｍｉｓ＋１とＭｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）とＭｉｓ＋３（１）（図９ｂ）、Ｍｉｓ＋２（１）とＭｉｓ＋２（図９ｃ）であった。
ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブの５'−末端構造に変化を与えて、ＳＮＰタイピングにＳＹＢＲグリーンを使用して実質的な適用可能性の有無を確認した。ラムダＤＮＡを鋳型として任意のＳＮＰポイントを指定し、５'−末端構造の変化によるＤＳＰプローブペアを定めた。使用したＤＳＰプローブペアは、Ｍｉｓ＋１とＭｉｓ＋２（図９ａ）、Ｍｉｓ＋３（２）とＭｉｓ＋３（１）（図９ｂ）、Ｍｉｓ＋２（１）とＭｉｓ＋２（図９ｃ）であった。
＊試験用プライマーとプローブ（図９ａ）
前方プライマー：５'−ｃｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔａａｃｃ−３'
後方プライマー：５'−ｔｇｇｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｃａｔｇｔａｃｃ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔａｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｃｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｂ）
前方プライマー：５'−ｔｃｔｃｇｇａａｔｇｃａｔｃｇｃｔｃａｇｔｇ−３'
後方プライマー：５'−ａｔｇｃｔｃａａｔｇｇａｔａｃａｔａｇａｃｇａｇｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｇｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａａｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｃ）
前方プライマー：５'−ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｔｔ−３'
後方プライマー：５'−ａａｇｔｔｃｔｃｇｇｃａｔｃａｃｃａｔｃｃｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
前方プライマー：５'−ｃｇｃｔｇｔｇｇｃｔｇａｔｔｔｃｇａｔａａｃｃ−３'
後方プライマー：５'−ｔｇｇｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｃａｔｇｔａｃｃ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋１：５'−ｔａｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｃｇｇｔｔａｔｃｇａａａｔｃａｇｃｃａｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｂ）
前方プライマー：５'−ｔｃｔｃｇｇａａｔｇｃａｔｃｇｃｔｃａｇｔｇ−３'
後方プライマー：５'−ａｔｇｃｔｃａａｔｇｇａｔａｃａｔａｇａｃｇａｇｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）：５'−ａｇｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
Ｍｉｓ＋３（１）：５'−ａａｃｔｃａａｃａｃｔｇａｇｃｇａｔｇｃａｔｔｃ−３'
＊試験用プライマーとプローブ（図９ｃ）
前方プライマー：５'−ｃｔｇｃｔｇｇｇｔｇｔｔｔａｔｇｃｃｔａｃｔｔ−３'
後方プライマー：５'−ａａｇｔｔｃｔｃｇｇｃａｔｃａｃｃａｔｃｃｇ−３'
プローブペア
Ｍｉｓ＋２（１）：５'−ｃｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
Ｍｉｓ＋２：５'−ｔｇａｔａａａｇｔａｇｇｃａｔａａａｃａｃｃｃａ−３'
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）、ＳＹＢＲグリーン（１０Ｘ）１ｕｌ及び３．１ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ ６．４５ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的な総容量を２０ｕｌにして使用した。
ＳＹＢＲグリーンを用いたＰＣＲ増幅曲線確認を通じて、任意に定めたＳＮＰポイントがプローブの５'−末端と一致或いは不一致することによって作られるフラップ構造によってＰＣＲ増幅曲線の増加と非増加とに区分されることを確認した。ＳＮＰポイントが不一致する場合は、ＰＣＲ増幅曲線が全く増加しないことによってＳＮＰタイピングを明確に区分することができる。これによって、本発明の方法を用いると、価格の高い顔料プローブを使用することなく、経済的に使用可能なＳＹＢＲグリーンなどのＤＮＡ二重結合に結合する挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）或いは表面結合剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を使用して簡便なＳＮＰタイピング適用が可能であることを確認した。
実施例７：リアルタイム重合酵素連鎖反応時にアニーリング温度差に影響を受けないＮＳＴＳプローブ作用の安定性確認試験
酵素作用の反応特異性によって区分されるＮＳＴＳプローブがリアルタイム重合酵素連鎖反応でアニーリング温度にどのような影響を受けるのかを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブを用いて残りのＰＣＲ条件は同一にし、アニーリング温度のみに変化を与えた。また、プローブは、５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の１番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー１ａ：５−ＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＧ−３
後方プライマー１ａｓ：５−ＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／１：５−ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／１：５−ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
酵素作用の反応特異性によって区分されるＮＳＴＳプローブがリアルタイム重合酵素連鎖反応でアニーリング温度にどのような影響を受けるのかを確認するための試験である。ＮＳＴＳ／ｓｙｂｒ−グリーンプローブを用いて残りのＰＣＲ条件は同一にし、アニーリング温度のみに変化を与えた。また、プローブは、５−末端の３番目の塩基１個がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（２））と５−末端の１番目と３番目の塩基がフラップ構造を有するプローブ（Ｍｉｓ＋３（１））を使用した。
＊ＤＳＰプローブ試験用プライマーとプローブ
前方プライマー１ａ：５−ＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＣＧ−３
後方プライマー１ａｓ：５−ＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／１：５−ＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／１：５−ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣ−３
前方プライマー２ａ：５−ＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＣＣ−３
後方プライマー２ａｓ：５−ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／２：５−ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／２：５−ＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
後方プライマー２ａｓ：５−ＴＧＧＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／２：５−ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／２：５−ＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣ−３
前方プライマー３ａ：５−ＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＣＴＴＡＣ−３
後方プライマー３ａｓ：５−ＡＴＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／３：５−ＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／３：５−ＴＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
前方プライマー４ａ：５−ＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＴ−３
後方プライマー３ａｓ：５−ＡＴＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＧＣＡＴＴＴＣＧＴＡＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／３：５−ＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／３：５−ＴＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＡＧ−３
前方プライマー４ａ：５−ＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＴＴ−３
後方プライマー４ａｓ：５−ＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＧ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／４：５−ＴＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／４：５−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／４：５−ＴＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／４：５−ＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＣ−３
前方プライマー５ａ：５−ＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＡＴ−３
後方プライマー５ａｓ：５−ＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／５：５−ＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／５：５−ＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴ−３
後方プライマー５ａｓ：５−ＡＧＣＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡ−３
プローブペア
Ｍｉｓ＋３（２）／５：５−ＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧ−３
Ｍｉｓ＋３（１）／５：５−ＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴ−３
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件１
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件２
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−５４℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び５ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍメチルグルコース、５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）４ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的に総容量を２０ｕｌにして使用した。
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−６５℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊リアルタイム重合酵素連鎖反応条件２
９５℃、５分（１回）
９５℃、１５秒−５４℃、３０秒−７２℃、３０秒（４０回反復）
＊ＰＣＲ反応物組成
ラムダＤＮＡ １ｕｌ（１００ｐｇ）、２種類のプライマーとプローブの各１ｕｌ（５ｐｍｏｌ／ｕｌ）及び５ｘ ｑＰＣＲＭｉｘ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍメチルグルコース、５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、（株）ゼノテック、韓国）４ｕｌと滅菌水とを混合し、最終的に総容量を２０ｕｌにして使用した。
アニーリング温度に１０℃以上の変化を与えてＰＣＲを行ったが、図１０から分かるように、Ｃｔ値で大きな差を示しておらず、ターゲット−特異的プローブのＰＣＲ増幅曲線が温度変化と関係なく明確に区分されることを確認した。酵素による反応特異性によって区分性を示すＮＳＴＳのアレル−特異的プローブの作用がＰＣＲ温度に敏感でないことを確認することができ、このような結果は、本発明の方法が多くの種類のＳＮＰの同時分析に効果的であることを示している。
本発明によると、迅速でかつ敏感度と特異度に優れた新たな原理が適用された経済的な遺伝子突然変異検出手段が提供されるので、本発明の方法は、農、水、畜産物などの遺伝子突然変異検査や医学分野の診断などに幅広く用いることができる。
配列表の各配列は、突然変異遺伝子を検査する方法に関する本発明の構成を説明するために任意に製作されたプライマーとプローブなどである。
本出願は、中小企業庁がサポートする２０１４年度中小企業技術革新開発事業課題である「効率的でかつ経済的な遺伝子変異検査用分子診断プラットフォーム開発及び製品化」（課題番号Ｓ２１６６２５７）によって行われたものであることを明らかにする。
Claims (17)
- ５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。
- ５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性の抑制又は除去は、
ａ）酵素反応条件を調節する方法、
ｂ）５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制又は除去された組換えＤＮＡポリメラーゼを用いる方法、
ｃ）５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性阻害剤を加える方法、及び
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ上でプライマー及びプローブのうち一つ以上の結合位置を調節する方法から選ばれた一つ以上の方法で行うことを特徴とする、請求項１に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。 - 前記ｄ）方法は、
増幅用前方プライマー５'−末端とプローブの５'−末端をＤＮＡポリメラーゼ２４−３８塩基以内に位置させることによって活性を抑制させることを特徴とする、請求項３に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。 - プローブは５'−末端にフラップ部位を有するプローブであることを特徴とする、請求項３に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。
- プローブの５'−末端は、１塩基以上の連続的なフラップ構造又は非連続的なフラップ構造を有することを特徴とする、請求項３に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。
- 検査対象突然変異遺伝子は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上を示すことを特徴とする、請求項１に記載の５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制又は除去することによってリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法。
- ５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応で突然変異遺伝子を検査する方法において、
ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。 - 前記プローブは、遺伝子突然変異部位がプローブの５'−末端に位置することを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。
- 突然変異遺伝子は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）、１塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上を示すことを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。
- 前記プローブは、対立形質によってＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるものであることを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。
- ＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性が抑制される５'−末端フラップ構造が誘導されるプローブは、５'−フラップ塩基が一つである構造、５'−フラップ塩基が二つである構造、又は非連続的フラップ構造であって、５'−フラップ塩基が二つであり、末端塩基の一つはマッチされる構造であるＭｉｓ＋３（１）であることを特徴とする、請求項１１に記載のＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。
- １塩基以上の欠失、置換及び流入のうち一つ以上の突然変異部位が、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性が抑制されるプローブの５'−末端に位置することを特徴とする、請求項１０に記載のＤＮＡポリメラーゼの５'−フラップエンドヌクレアーゼ活性を抑制するプローブを用いて突然変異遺伝子を検査する方法。
- 遺伝子突然変異検査用重合酵素連鎖反応キットにおいて、
試料ＤＮＡ、二重鎖前方プライマー、二重鎖後方プライマー、プローブ及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、前記プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのＦＥＮ活性を抑制するものであることを特徴とする遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キット。 - 前記プローブは、リポーター顔料とクエンチャー顔料が同時に修飾されているデュアルラベルプローブ又は非修飾プローブであることを特徴とする、請求項１４に記載の遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キット。
- 前記二重鎖前方プライマー及び二重鎖後方プライマーは、それぞれ相補結合配列を含み、プローブは、リポーター顔料とクエンチャー顔料が同時に修飾されているデュアルラベルプローブであることを特徴とする、請求項１４に記載の遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キット。
- 前記非修飾プローブを使用する場合は、ＤＮＡ二重結合に結合する挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）又は表面結合剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を付加することを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子突然変異検査用リアルタイム重合酵素連鎖反応キット。
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