KR101768948B1 - 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제를 이용한 fret 기반의 핵산검출 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 표적 핵산, 상기 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 프라이머 및 프로브, 데옥시뉴클레오타이드 5‘-트리포스페이트, 및 효소로서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 표적 핵산을 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계를 포함하는, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소를 이용해서도 편리하게 FRET 기반의 핵산 검출 또는 증폭이 가능한 방법을 개시한다.

Description

엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제를 이용한 FRET 기반의 핵산검출 방법 {Method for detecting nucleic acid based on FRET assay using polymerase lacking exonuclease activity}

본원은 핵산분자 증폭 및 검출과 관련된 기술 분야이다.

분자생물학의 발전과 더불어 검체에 존재하는 특정 표적 핵산을 검출하여 질환의 진단에 사용하는 방법이 널리 사용되고 있다. 이를 위해서는 검체에 소량 존재하는 핵산의 증폭이 요구되며, 가장 널리 사용되는 방법이 PCR (Polymerase Chain Reaction)이다.

하지만 PCR은 판독시간이외에 반응에만 통상 2-5시간이 시간이 소요되는 상대적으로 긴 반응시간으로 인해 긴급한 상황에서 질환의 진단 등과 같이 신속한 검출이 필요한 분야에서는 많은 불편이 따른다. 따라서 폴리머라제의 개선을 통해 반응시간을 줄이기 위한 여러 가지 방법이 시도되었다.

미국 공개특허공보 제2004/0081963호는 Sso-7 폴리머라제 컨쥬게이트 단백질에 관한 것으로 DNA 결합영역인 Sso7d 단백질을 N 말단부위가 제거된 Taq 폴리머라제에 융합시켜, 진행속도 (processivity)를 개선시킨 단백질을 개시한다.

미국 공개특허공보 제2011/0027833호는 증가된 합성력 및 억제제에 대한 저항성을 갖는 열안정성 타입-A DNA 폴리머라제에 관한 것으로 야생형 Taq 폴리머라제의 특정 서열의 변이를 통해 개선된 폴리머라제를 개시하고 있다.

하지만 상기와 같은 융합 또는 돌연변이가 도입된 Taq 폴리머라제의 경우 DNA 증폭 속도나 효율이 향상되었으나, 5’->3’ 엑소/엔도뉴클레아제 활성을 모두 보유하고 있는지에 대한 여부는 검증되지 않았다.

하지만 3‘ ->5’ DNA 폴리머라제 활성은 있지만 5’->3’ 엑소/엔도뉴클레아제 활성을 보유하지 않는 경우, 가장 일반적으로 사용되는 TaqMan 프로브와 같은 FRET 방식을 이용하여 핵산을 검출할 수 없다는 문제점이 있다.

따라서 3‘->5’DNA 폴리머라제 활성을 갖는 폴리머라제를 이용하여 FRET 방식을 이용한 핵산검출 방법의 개발이 필요하다.

본원은 5‘->3’엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 폴리머라제를 이용하여 FRET 기반의 핵산검출 및/또는 증폭이 가능한 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 표적 핵산, 상기 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 프라이머 및 프로브, 데옥시뉴클레오타이드 5‘-트리포스페이트, 및 효소로서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소를 이용한 FRET 기반의 핵산 검출 및/또는 증폭 방법을 제공한다. 상기 증폭하는 단계는 상기 표적핵산 및 사용하는 프로브, 및 프라이머의 길이, 서열구성, 교잡정도, 사용하는 완충액의 조성 등에 따라 상기 표적핵산이 증폭가능한 조건에서 수행된다.

본원에 따른 방법에 사용되는 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소는 원래 상기 활성이 없는 효소 예를 들면 Pyrococcus furiosus 유래의 pfu 또는 상기 활성을 갖지 않도록 돌연변이가 유발된 효소 예를 들면 Taq (Thermus aquaticus)의 N 말단이 결실(deletion) 등의 돌연변이를 통해 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 없도록 변형된 것이다. 이러한 DNA 중합효소는 예를 들면 Methanococcus jannaschii, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 또는 Aquifex aeolieus 유래일 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 감소된 핵산 중합효소는 N 말단이 결여되거나 또는 N 말단의 엑소뉴클라아제 도메인에 돌연변이가 도입된 폴리머라제, 또는 N 또는 C 말단에 DNA 결합 활성을 가지는 폴리펩타이드가 연결(fusion) 된 폴리머라제로, 상기 폴리머라제는 변형된 또는 야생형 Taq (Thermus aquaticus), Pfu (Pyrococcus furiosus) 폴리머라제, Tth (Thermus thermophilus) 폴리머라제, 또는 Tf1 (Thermus flavus) 폴리머라제이다. N 또는 C 말단에 DNA 결합 활성을 가지는 폴리펩타이드가 연결(fusion) 된 폴리머라제로는 Sso7d-Taq과 Pfu-S (Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 3 1197~1207)를 들 수 있다. Sso7d-Taq 은 Taq 의 N 말단에 DNA binding polypeptide 인 Sso7d 가 fusion 되어 있고, Pfu-S 의 경우 N 또는 C 말단에 Sso7d 가 융합되어 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 FEN1은 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus 유래일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법은 정량 또는 정성 PCR 반응에서 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 표적 핵산의 정량적 또는 정성적 검출에 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 내열성 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제는 1: 0.02 내지 1: 20의 몰비로 포함될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 방법에 사용되는 조성물 또는 키트를 제공하며, 핵산 증폭에 필요한 효소로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 포함하는, FRET 기반의 핵산 검출 키트 또는 조성물을 제공한다.

본원에 따른 방법, 조성물 및 키트는 5’->3’엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 감소된 DNA 중합효소를 및 FEN (Flap Endo Nuclease)과 함께 사용하여, 5’->3’엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 감소된 DNA 중합효소를 기존에 가능하지 않던 FRET 기반의 핵산 검출 또는 정량이 가능하다. 이로 인해, 정확성은 물론 시간면에서도 단축된 방식으로 핵산의 검출이 필요한 다양한 응용분야 예를 들면 질병의 진단이나 병원균의 감염 여부를 정확하고 신속하게 하여 편리성이 향상된다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 방법의 작동원리를 도식적으로 나타낸 것으로, 5‘->3’엑소,엔도뉴클레아제 활성이 없는 DNA 폴리머라제에 플랩구조를 인식하여 폴리뉴클레오타이드를 절단할 수 있는 Flap 엔도뉴클레아제를 함께 사용하여 Flap 엔도뉴클레아제가 Taq 폴리머라제의 5’엑소뉴클레아제 활성을 대신할 수 있는 것을 보여준다.
도 2는 본원의 일 구현예에서 5‘ 엑소뉴클레아제 활성이 없는 돌연변이 Taq 폴리머라제와 다양한 exo-, endo-nuclease 를 조합으로 사용한 TaqMan 프로브 기반의 실시간 정량 PCR (qPCR) 수행결과이다.
도 3 및 도 4는 본원의 일 구현예에서 5‘ 엑소뉴클레아제 활성이 없는 돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1을 다양한 혼합비 또는 사용량으로 실시한 TaqMan 프로브 기반의 실시간 정량 PCR (qPCR) 수행결과이다.
도 5는 TaqMan 프로브 타입의 정량 PCR에서 야생형 Taq 폴리머라제와 동등한 성능을 나타내는 본원에 따른 ‘돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1 혼합효소’의 프로브의 절단 패턴을 분석한 결과이다.
도 6은 본원에 따른 돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1 혼합효소 (1:2 몰비)의 합성속도를 실시간 정량 PCR (qPCR)로 수행한 결과이다.
도 7은 내열성 FEN1과 교정기능이 있는 Pfu 폴리머라제 혼합효소를 사용한 TaqMan qPCR을 수행한 결과이다.

본원은 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소를 이용하여 FRET 기반의 핵산 검출 및/또는 증폭 방법을 가능하게 함은 물론 증폭에 걸리는 시간을 획기적으로 단축하였다.

일반적으로 하나의 효소가 보유하고 있는 두 가지 서로 다른 활성은 해당 활성이 하나의 효소에 존재하고 있어야 온전히 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Bae et al., Coupling of DNA helicase and endonuclease activities of yeast Dna2 facilitates Okazaki fragment processing. J Biol. Chem. (2012) 277:26632-41.) 즉, 원래 하나의 효소에 포함된 두 가지 효소적 활성을 각각 별도의 효소로 분리하여, 각 활성을 갖는 개별적 효소로 제공하는 경우, 각 효소를 단순히 섞는 것만으로는 원래 효소가 갖는 활성을 복원하는 것은 어려운 것으로 알려져 있다.

하지만 본원에서는 도 1에 기재된 바와 같이, 5'->3' 엑소뉴클레아제 기능을 별도의 효소로서 증폭 반응에 제공함으로써, 엑소뉴클레아제 기능이 결여된 효소로 기존에 가능하지 않았던 FRET 기반의 핵산 증폭 또는 검출이 가능하게 하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 표적 핵산, 상기 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 프라이머 및 프로브, 데옥시뉴클레오타이드 5-트리포스페이트, 및 효소로서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는, 5'->3' 엑소/엔도뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소를 이용한 FRET 기반의 핵산 검출 및/또는 증폭 방법을 제공한다. 상기 증폭하는 단계는 상기 표적핵산 및 사용하는 프로브, 및 프라이머의 길이, 서열구성, 교잡정도, 사용하는 완충액의 조성 등에 따라 상기 표적핵산이 증폭 가능한 조건에서 수행된다.

다른 양태에서 본원은 핵산 또는 DNA 증폭 반응 과정에서 두 종류의 효소 즉 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 폴리머라제 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제의 조합을 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 핵산의 증폭 속도를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

본원에서 5'->3' 엑소뉴클레아제는 이중가닥 핵산을 특이적으로 인식하여 5‘ 방향에서 3'방향으로 핵산을 절단 또는 분해하는 활성 또는 상기 활성을 갖는 효소를 일컫는 것이다. 많은 종류의 DNA 폴리머라제가 핵산 중합활성에 부가하여 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 가진다. 예를 들면 E. coli DNA 폴리머라제 I, Thermus aquaticus (Taq) 유래 폴리머라제, Thermus thermophilus (Tth) 유래 폴리머라제, Thermus brockianus 유래 폴리머라제, Pyrococcus furiosus (Pfu) 유래 폴리머라제 및 Thermus flavus (Tfl) 폴리머라제를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 5'->3' 엑소 뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소는 핵산을 합성하는 효소 즉 폴리머라제로서, 상술한 바와 같은 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 원래 없거나 또는 그러한 활성이 다양한 방식 예를 들면 결실, 치환 등의 돌연변이 등과 같은 방법으로 불활성화된 또는 제거된 중합효소를 일컫는 것이다. 일 예로 5'->3' 엑소뉴클레아제 기능이 결실 또는 제거된 Taq 폴리머라제, 미국특허 5,474,920, 미국 공개공보 2004-0081963, 2013-0252309 및 2011-0027833 등에 기재된 것을 참고할 수 있다.

본원에서 "플랩 엔도뉴클레아제 (5'-flap endonuclease)", "FEN" 및 "FEN1" 은 5‘ 플랩 구조를 특이적으로 인식하여 자르는 엔도뉴클레아제 활성 및 닉(nick) 또는 갭이 있는 이중가닥에 대한 특이적 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있으며, 마우스, 인간, 효모, 원핵세포 및 다양한 내열성 박테리아에서 발견된다. 원핵생물에서, FEN1 활성은 DNA 폴리머라제 I의 5' 뉴클레아제 도메인이 갖는다. 진핵세포, archaea, 박테리오파아지에서는 별개의 폴리펩타이드로 존재한다. 플랩 엔도뉴클레아제 관련된 추가의 정보는 Xu et al., J. Biol. Chem. 276:30167-30177 (2001) and Kaiser et al. J Biol Chem 274:21387-21394 (1999)를 참고할 수 있다. FEN은 단일가닥 및 이중 가닥 DNA의 정션(junction)에서 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매하여 자른다 (Harrington and Lieber, EMBO 13:1235-46 (1994); Harrington and Lieber, J Biol Chem 270:4503-8 (1995)). 세포에서 플랩 엔도뉴클레아제는 DNA 복제에서 불연속가닥의 복제, 특히 오카자키 단편의 성숙에 필요한 효소 중의 하나이다. 본원에 따른 방법에는 다양한 유래의 FEN1이 사용될 수 있으며, 특히 FRET 기반의 핵산 검출방법에 안정적으로 사용될 수 있는 50도 이상에서 안정적으로 활성을 나타낼 수 있는 종류의 열내성 FEN1 이 사용될 수 있다.

일 구현예에서는 Pfu에서 유래한 내열성 FEN1을 사용한다. 열내성을 가지고 있으므로 Heating 과 cooling 이 반복되는 PCR 반응에서 안정적으로 작용한다.

본원에서 “표적 핵산”은 본원에 따른 방법, 조성물 또는 키트를 이용하여 증폭, 또는 검출하고자하는 특정한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 또는 핵산 단편 (폴리뉴클레오타이드)를 일컫는다. 이러한 표적 핵산은 크기 (길이)가 특별히 제한되는 것은 아니며, 증폭을 위해 제공되는 한 종류의 주형에 한 개 이상 존재할 수 있다. 또한 표적 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥 일 수 있다. 이중 가닥일 경우, 각 단일 가닥의 서열을 모두 포함하는 것이다. 본원에 따른 표적 핵산에 포함된 베이스 또는 뉴클레오타이드는 천연 또는 특정 목적을 위해 변형된 것을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 증폭은 인비트로(시험관내)에서 관심있는 핵산 또는 표적 핵산 또는 표적 뉴클레오타이드 서열의 카피수를 증가시키는 모든 과정을 의미하는 것으로, 이 과정에서 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA로 편입되어 들어간다. 본원의 일 구현예에 따르면 증폭 반응은 복제과정을 여러 주기(사이클) 반복하는 것으로, 예를 들면 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 통해, 변성-혼성-복제 과정을 10-100 주기 반복하는 것이다. PCR (Polymerase Chain Reacton)과 같은 핵산을 증폭하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 PCR이 사용된다. PCR 방법은 예를 들면 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 기재되어 있다. 통상 PCR은 핵산 주형(template)의 증폭하고자 하는 부위를 플랭킹하는 부위에 특이적으로 결합하는 전방(forward) 및 하방(reverse) 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 내열성 DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머의 3‘ 말단으로부터 핵산을 합성한다. 통상 PCR은 (i) 이중가닥을 단일가닥으로 분리하는 단계; (ii) 프라이머가 단일가닥 주형에 결합하는 단계; (iii) 상기 프라이머로부터 5-3’방향으로 핵산을 합성하는 단계가 반복적으로 수행되어 표적 핵산이 증폭되며, (ii) 및 (iii) 단계는 하나의 단계에서 수행될 수도 있다. PCR은 온도가 조절되는 자동화된 기기에서 수행된다. PCR은 목적하는 여러 주기로 반복될 수 있으며 그 결과 표적 핵산이 기하급수적으로 증폭되며, 증폭산물의 양 말단은 사용된 프라이머와 동일하다. 각 단계에 사용되는 온도, 시간 그리고 단계간 전이 속도는 기술분야의 당업자에게 알려진 여러 요인에 의해 결정되며 예를 들면 McPherson, M.J. and Quirke, P. (eds) (1991) PCR: 및 A Practical Approach. IRL Press, London; Mullis, K., Ferre, F. and Gibbs, R.A. (eds) (1994) The Polymerase Chain Reaction. Birkauser, Boston, MA, USA 등에 기재된 것을 참고할 수 있다. PCR의 각 단계를 수행하는 조건은 변할 수 있으나, 통상적으로, 핵산은 >90℃에서 변성되며, 프라이머는 약 50-75℃에서 어닐링 되고, 합성은 65-75℃에서 수행된다. PCR은 다양하게 변형된 형태로 수행될 수 있으며, "RT-PCR," "실시간 PCR," "네스티드(nested) PCR," "정량(quantitative) PCR," "다중(multiplexed) PCR," "비대칭(asymmetric) PCR" 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 “뉴클레오타이드”는 염기-당-포스페이트가 결합된 것으로 폴리머인 핵산, 즉 DNA 또는 RNA를 이루는 단량체이다. 본 발명의 방법에서핵산의 합성에 사용되는 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트인 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP를 포함하며, 필요한 경우, dUTP를 포함할 수 있다. 뉴클레오사이드는 염기-당이 결합된 것으로 뉴클레오타이드와 혼용되어 상호 교환적으로 사용되기도 한다.

본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산을 일컫는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “프로브”는 프라이머와는 구별되는 개념으로 예를 들면 실시간 정량 PCR에서 다양한 종류의 형광 검출 방식에 맞추어 프라이머와 함께 사용되는 것으로, 전방 및 후방 프라이머 사이의 위치하는 서열에 결합하는 올리고뉴클레오타이드로 5‘ 말단 및 3’ 말단이 각각 형광염료 또는 소거제로 표지되어 있다.

이러한 프로브가 사용되는 형광검출 방식은 예를 들면 FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)에 근거한 근접 프로브 (adjacent probe) 또는 5' 뉴클리아제 프로브 방식, 또는 접촉 소거 (contact quenching)에 근거한 Molecular beacon 프로브 또는 가닥 대체식 프로브 (starnd displacement probe) 방식을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다 (Recent Pat DNA Gene Seq. 2007;1(2):145-7. Mol Biotechnol. 2003 Nov;25(3):267-74.). 이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 근접 프로브 방식은 각 각 형광염료와 소거제로 표지된 두 개의 올리고뉴클레오타이드가 근접한 위치에 오면 형광신호가 사라지는 원리이고, 5' 뉴클리아제 프로브 방식은 한 분자의 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 각 부분이 형광염료 및 소거제 (또는 그 반대)로 표지되어 있고, 뉴클리아제에 의해 5' 부분이 제거되면서 형광신호가 방출되는 원리로 TaqMan 프로브가 있다. 접촉 소거 방식은 수소 결합 등에 의해 형광염료와 소거제가 결합해 있다가, 상보적 서열에의 결합, 또는 가닥 대체 등에 의해 형광신호가 방출되는 원리이다. 사용되는 구체적 방식은 검출장비, 사용되는 구체적인 형광염료 및 소거제, 핵산 서열 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자라면 이러한 것을 고려하여 적절한 방식을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 사용된 용어 “형광염료”(fluorophore, fluorochrome)는 특정한 제1 파장의 에너지를 흡수하고 다른 제2 파장의 에너지를 방출할 수 있는 물질을 일컫는 것이다. 예를 들면, 플루오레신 또는 그 유도체 예컨대 플루오레신 아이소티오시아네이트, FAM과 같은 카르복시 플루오레신, 플루오레신 아마디이트, Cy3, Cy5, Cy7과 같은 시아닌 또는 그 유도체, TAMRA (tetramethylrhodamine)과 같은 로다민 또는 그 유도체, 쿠마린 또는 그 유도체 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 예를 들면 FAM, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, LC red 640, Cy5, 또는 LC red 705가 형광염료로 사용되며, 이러한 물질은 Applied Biosystmes사, 또는 Invitrogen사에서 구입할 수 있다. 예를 들면 하기와 같은 명칭으로 판매된다: FAM, TET, JOE, HEX, TAMRA, ROX, Cy5, Cy3, CalRed, Quasar, VIC, Texas Red.

본원에서 사용된 용어 “소거제”(quencher)는 형광염료에서 발생하는 여기 (excitation) 에너지를 받아들이는 형광소거제 (fluorophore quencher) 또는 비형광 소거제 (dark quencher)이다. 전자인 형광소거제는 전달된 에너지가 특정 파장의 빛으로 방출되고, 또는 후자의 경우는 열로 된다. 이들은 형광염료와 근접하여 또는 일정거리 내에 위치할 경우, 형광염료의 에너지 방출 (emission)이 억제되어, 형광 신호가 검출되지 않고, 억제할 수 없을 만큼 충분히 먼거리에 위치하는 경우, 형광신호가 검출된다. 예를 들면 형광물질 중 TAMRA는 FAM이라는 물질의 소거제로 사용될 수 있다. 소거제의 예로는 Black Hole Quencher (BHQ; Biosearch Technologies, Novato, Calif.), Dabsyl (dimethylaminoazosulphonic acid), Qxl^TM quenchers (AnaSpec Inc., San Jose, Calif.), Iowa black FQⓡ, Iowa black RQⓡ (Integrated DNA technologies, USA), IRDye QC-1, QYSⓡ quenchers (Life technologies, USA)등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 형광물질이 함께 사용되는 물질의 종류에 따라 소거제로 사용되는 경우도 있으며 이러한 경우를 제한하는 것은 아니다.

당업자라면 형광염료와 소거제는 상술한 형광에너지 전달 방식, 각 물질의 파장, 검출장비 등을 고려하여 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

본원의 일 구현예에 따른 프로브는 단일가닥 DNA로 그 5‘에 형광염료로, 3’에는 소거제로 표지되어 있으며, 예를 들면 비형광분자 소거제 (dark quencher)로 표지되어 있으며, FRET 또는 접촉방식으로 사용될 수 있으며, 특히 FRET 방식으로 사용된다. FRET의 원리는 사용되는 프로브의 디자인 및 응용분야에 대하여는 Vladimir V. Didenko, Biotechniques. 2001 November; 31(5): 1106-1121을 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법은 일 구현예에서 특히 실시간 정량 PCR에 사용된다. 이 경우, 본원에 따른 방법은 상술한 바와 같은 프로브를 추가로 포함한다.

본원에 따른 방법에서는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 일정한 비율로 혼합하여 사용함으로서 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어서 TaqMan qPCR 에 적용하지 못했으나, 다른 기능들 예컨대 속도 향상, 정확도 향상이 가능한 폴리머라제를 FEN1 과 혼합함으로써 이러한 장점을 유지한 채로 TaqMan qPCR 에 적용가능하게 되었다.

일 구현예에서는 검출 시점이 기존 효소를 사용할 때 38.14 cycle 에서 합성 속도가 빠른 본원에 따른 혼합효소를 사용할 때 24.88 cycle 로 약 13 cycle을 줄일 수 있었다.

본원에 따른 방법에서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제는 1:0.005 내지 1:50의 몰비로 사용된다. 바람직하게는 1:0.02 내지 1:20의 몰비로, 더욱 바람직하게는 1:0.1 내지 1:10의 몰비로 사용된다. 일 구현예에서는 1:2의 몰비로 사용된다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제는 각 효소가 동일한 몰비 수준에서 사용될 수 있으며, 1:0.5 ~ 1:2 또는 특히 1:1 몰비로 사용될 수 있다. 본 이론으로 한정하는 것은 아니나, 한 분자의 폴리머라제가 TaqMan 프로브를 들어올려서 플랩을 형성할 경우, 여기에 실제 작용할 수 있는 FEN1도 한 분자이다. FEN1의 분자수가 증가할 경우, 1개의 플랩에 대하여 여러개의 FEN1이 결합하고자 하여 경쟁효과로 인해 오히려 억제효과가 나타날 가능성을 배제할 수 없으며, FEN1 분자수가 감소하는 경우, 기질 (플랩)대비 효소의 양의 적어 제한적 요소가 되어 반응효율이 낮아질 수 있다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법에 사용되는 신속한 핵산 증폭에 사용되는 핵산 증폭용 반응 조성물 또는 키트를 제공한다. 본원에 따른 조성물 및 키트는 본원에 따른 효소의 조합에, 핵산 증폭 예를 들면 PCR에 필요한 다른 성분 예를 들면 프로브, 프라이머, dNTP, 이가 양이온 등을 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법은 일 구현예에서 예를 들면 FRET을 이용한 실시간 PCR에 사용될 수 있으며, 이러한 경우 형광신호를 검출 및/또는 분석할 수 있는 형광검출기를 구비한 PCR 장치를 이용하여 핵산 증폭과정을 실시간으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 돌연변이 Taq 폴리머라제와 다양한 Nuclease 를 조합한 정량 PCR

5‘ 뉴클리아제 활성이 없는 돌연변이 Taq 폴리머라제(nTaq, Cat# P025 엔지노믹스)에 5‘ 뉴클리아제 활성을 가지는 다양한 효소를 조합하여 TaqMan 프로브 타입의 정량 PCR 구현에 적합한 폴리머라제-뉴클리아제 조합을 선별하기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다. 인간 cDNA 10 ng을 주형으로 하여 GAPDH 유전자를 표적 DNA로 증폭하기 위해 Forward (5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’), Reverse (5’-TTGACGGTGCCATGGAATTTG-3’) 프라이머와 형광 TaqMan 프로브(5‘ FAM-CCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAA-TAMRA 3’)를 사용하였다 (제노텍, 대한민국). 유전자 증폭을 위해 표준 PCR 완충액(10 mM Tris-HCl/pH 8.3, 1.5 MgCl₂, 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP)에 야생형 Taq 폴리머라제와 돌연변이 Taq 폴리머라제를 각각 1 unit (50 ng/unit) 씩 사용하였다. 5’ 뉴클리아제 활성을 가지는 후보 효소로는 각각 30 unit 의 RecJ (NEB, 미국), 1 unit 의 Nuclease BAL-31(NEB, 미국), 10 unit 의 T7 Exonuclease (NEB, 미국), 10 unit 의 T5 Exonuclease (NEB, 미국), 10 unit 의 Exonuclease VII (NEB, 미국), 10 unit 의 Exonuclease V (NEB, 미국), 50 ng 의 내열성 FEN1 (엔지노믹스, 대한민국)을 사용하였다. PCR 반응은 실시간 PCR 장비 (CFX96, Bio-Rad)를 사용하였으며 95℃에서 10분 전변성 단계 후 95℃에서 30초, 60℃에서 60초를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 수행하였다. 상대적 형광값은 매 사이클의 60℃, 60초 반응 후에 측정하여 나타내었다.

실험 결과 도 2에 기재된 바와 같이 야생형 Taq 폴리머라제 (WT) 의 경우 타겟 유전자의 증폭과 이어진 TaqMan 프로브 절단에 의해 형광 증폭 곡선이 나타나는 것을 확인할 수 있었으나 (도 2A; 붉은색 곡선), 5 뉴클리아제 활성이 없는 Taq 폴리머라제 (MT)의 경우 TaqMan 프로브를 절단할 수 없어 형광 증폭신호가 검출되지 않음을 확인할 수 있었다 (도 2A; 검정색 곡선). 돌연변이 Taq 폴리머라제 (MT) 의 결여된 5‘ 뉴클리아제 활성을 보완하여 TaqMan 프로브 타입의 정량 PCR 구현에 도움을 줄 것으로 예상되는 다양한 5’ 뉴클리아제들을 돌연변이 Taq 폴리머라제 (MT) 와 함께 반응시킨 결과, 내열성 FEN1 과 혼합하였을 때만 야생형 Taq 폴리머라제와 유사한 형광 증폭 곡선 및 사이클 임계값(Cycle threshold, Ct)을 도출해 냄을 확인할 수 있었다 (도 2A; 보라색 곡선, 도 2B).

이 결과는 신속성, 정확성 등의 측면에서 상당한 효과를 가지지만 5’뉴클리아제 활성의 부재로 인해 TaqMan 정량 PCR 응용 불가능했던 다양한 내열성 폴리머라제(예, 유전적으로 변형된 신속성 Taq polymerase, 교정기능이 있는 Pfu polymerase)과 내열성 FEN1을 혼합함으로써 TaqMan 정량 PCR 에 적합한 혼합효소를 생산할 수 있는 가능성을 보여주었다.

실시예 2. 돌연변이 Taq 폴리머라제 및 FEN1의 조합을 이용한 정량 PCR

TaqMan 정량 PCR 에서 5‘ 뉴클리아제 활성이 없는 돌연변이 Taq 폴리머라제(엔지노믹스)와 내열성 FEN1의 조합비를 찾아내기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다. 기본적으로 실험은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며 야생형 Taq 폴리머라제와 돌연변이 Taq 폴리머라제를 각각 1 unit 씩, 내열성 FEN1 의 경우 폴리머라제의 양 대비 1:0, 1:0.01 내지 1:1 으로 증가시켜 사용하였다.

실험 결과 도 3에 기재된 바와 같이 5 뉴클리아제 활성이 없는 Taq 폴리머라제 (MT)와 내열성 FEN1을 1:0, 1:0.01, 1:0.1, 1:1의 중량비로 증가시킨 결과, FEN1의 양이 늘어날수록 형광 그래프의 기울기가 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3A; ③, ④, ⑤, ⑥). Taq polymerase (MT) 와 FEN1을 1:1 비율이 되게 첨가하였을 때 그래프의 기울기가 가장 컸으며 같은 양의 야생형 Taq 폴리머라제 (WT) 과 비슷한 형태의 형광 그래프를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 3A; ⑦). 음성 대조군으로 주형 DNA를 넣지 않은 경우 Taq 폴리머라제(MT)+FEN1 과 Taq polymerase (WT) 모두 증폭 신호가 검출되지 않았다 (도 3A; ①, ②).

형광 증폭 신호가 검출된 경우 실제로 목적하는 정확한 크기의 표적이 증폭되었는지 확인하기 위해 증폭산물에 대하여 아가로스 젤 분석을 수행해 본 결과, 형광 증폭 신호가 나타난 경우 정확히 예상한 157 bp에서 PCR 산물이 생성됨을 확인하였다 (도 2B). 상기 각 실험에서의 사이클 임계값과 상대적형광강도 (Relative Fluorescence Units, RFU) 값은 도 2의 C와 D에 각각 그래프로 표시하였다.

실시예 3. 돌연변이 Taq 폴리머라제 및 FEN1의 최적 조합비 및 사용량 결정

먼저 돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1 의 최적 조합비를 보다 상세하게 결정하였다. 기본적으로 실험은 실시예 2와 동일하게 진행하였다. 돌연변이 Taq 폴리머라제의 양은 1 unit을 사용하였으며 내열성 FEN1 의 혼합 비율은 1:0.2 내지 1:200 (몰비) 으로 사용하였다.

결과는 도 4의 A 에 기재되어 있다. 돌연변이 Taq 폴리머라제를 고정하고 FEN1의 양을 증가하였을 때 혼합 비율이 1:0.2 ~ 1:10 (몰비) 까지는 혼합비율에 따른 Ct 차이가 1.5 cycle 이내로 미미하였으나 (최대 28.69 ~ 최소 27.38) 1:20에서 4 cycle 정도 뒤쳐진 후 1:40 부터는 형광 신호가 검출되지 않았다 (그래프 상에는 40 Ct 로 표시함). 따라서 본원의 발명을 적합하게 구현하기 위해서는 돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1 의 조합비가 1:40 보다 낮아야 함을 알 수 있다. 실시예 2의 결과를 함께 고려할 때, 바람직하게는 1:0.02 내지 1:20 (몰비)로 사용해야 함을 알 수 있다.

다음으로 돌연변이 Taq 폴리머라제와 내열성 FEN1의 최적 사용량을 결정하였다. 기본적인 실험 방법은 실시예 1과 동일하며 돌연변이 Taq 폴리머라제와 내열성 FEN1의 혼합비는 1:2 (몰비)로 하여 사용하였다.

결과는 도 4의 B 에 기재되어 있다. 혼합 효소의 사용량을 Taq 폴리머라제의 양을 기준으로 0.005 ~ 50 unit 까지 증가시켜 사용한 결과 2.5 ~ 10 unit을 사용했을 때 평균 26 cycle 로 가장 빠른 Ct 값을 나타내었다. 0.5 와 50 unit을 사용한 경우에는 평균 30.44 와 28.22의 Ct 값을 나타내었다. 혼합 효소의 양을 0.1 unit 이하로 사용한 경우 유전자 증폭 일어나지 않았다. 따라서 돌연변이 Taq 폴리머라제와 FEN1을 1:2의 몰비로 사용하였을 때 Taq 폴리머라제의 양을 기준으로 0.1 unit을 초과하여 50 unit 이하로 사용할 수 있으며, 특히 0.5 내지 50 unit, 더욱 특히 2.5 내지 10 unit으로 사용하여야 함을 확인하였다.

실시예 4. 내열성 FEN1 의 TaqMan 절단 패턴 분석

TaqMan 프로브 타입의 정량 PCR에서 야생형 Taq 폴리머라제와 동등한 성능을 보이는 ‘돌연변이 Taq 폴리머라제 - FEN1 혼합효소’의 프로브의 절단 패턴에 차이가 있는지 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 수행하였다. 기본적인 실험은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며, 정량 PCR 완료 후 증폭 산물을 15% denaturing PAGE 로 분석하였다.

결과는 도 5에 기재되어 있다. 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 후 UV 상에서 이미지화 함으로써 젤에 나타나는 밴드는 5’에 FAM 이 표지된 완전한 TaqMan 프로브이거나 해당 프로브의 잘려진 형태이다. 야생형 Taq 폴리머라제를 사용한 경우 주형 DNA의 존재 하에서 TaqMan 프로브의 일부분이 절단되어 두 가지 다른 작은 크기의 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 5; Lane 3). 5‘ 뉴클리아제 활성이 없는 Taq 폴리머라제 (MT)를 사용한 경우 이러한 절단 패턴이 나타나지 않았지만 (도 5; Lane 4), 여기에 내열성 FEN1을 첨가한 경우 야생형 Taq 폴리머라제를 사용한 경우와 유사한 절단 패턴을 확인할 수 있었다 (도 5; Lane 5). 이 결과는 열내성 FEN1 의 효소적 활성이 PCR 에서 야생형 Taq 폴리머라제의 5’ 뉴클라아제 활성을 대체 할 수 있음을 의미한다.

실시예 5. 돌연변이 Sso7d-ΔTaq 폴리머라제 및 FEN1의 조합을 이용한 신속한 정량 PCR

본 실시예에서는 돌연변이 Taq 폴리머라제로서 Sso7d-ΔTaq (US 2004/0081963에 개시)를 사용하였다. 실험은 기본적으로 실시예 1과 동일하게 진행하였다. Sso7d-ΔTaq와 내열성 FEN1의 혼합 비율은 1:2 (몰비) 로 하여 사용하였다. 돌연변이 Taq 폴리머라제 사용에 따른 신속 PCR 반응 여부를 확인하기 위해 각기 다른 통상 조건과 빠른 조건에서 TaqMan 정량 PCR을 수행하였다. 통상 조건은 실시예 1과 동일하며, 빠른 조건은 95℃에서 10분 전변성 단계 후 95℃에서 3초, 60℃에서 10초를 1 사이클로 하여 총 45 사이클을 수행하였다.

결과는 도 6에 기재되어 있다. 도 6의 A와 B에 나타나 있는 것과 같이 GAPDH (TaqMan probe: FAM dye)를 표적으로 통상 조건 (95℃/30초, 60℃/60초, 총 45 cycle)으로 PCR을 수행한 경우, 혼합폴리머라제 (Sso7d-ΔTaq + FEN1)와 야생형 폴리머라제 (WT Taq)가 거의 유사한 Ct 값과 RFU 값을 나타냈다. 하지만 빠른 조건 (95℃/3초, 60℃/10초, 45 cycle)에서 실험을 수행한 경우 혼합 폴리머라제가 야생형 폴리머라제와 비교하여 약 13 cycle 이상 빠른 Ct 값은 나타냄을 확인하였다.

이러한 결과는 MERS-CoV (메르스 코로나 바이러스, upE region, TaqMan probe: Cy5 dye)를 표적으로 실험하였을 때에도 본원에 따른 혼합 폴리머라제를 사용시, 야생형 폴리머라제 대비 15 cycle 이상 빠른 Ct 값을 보여줌으로써 범용적으로 유사한 경향성을 나타냄을 알 수 있었다 (도 6의 C 및 D).

따라서 상기와 같은 결과는 그 자체로 신속한 합성 속도를 갖지만, 5‘ 엑소뉴클라아제 활성이 결여되어 FRET 기반의 프로브인 TaqMan을 사용한 정량 PCR 에 적용할 수 없었던, Sso7d-ΔTaq과 같은 돌연변이 폴리머라제를 본원의 방법에 따라 내열성 FEN1 과 혼합할 경우 TaqMan을 사용한 정량 PCR에의 사용가능하며, 편리성이 월등히 향상된다.

실시예 6. 돌연변이 Pfu 폴리머라제와 내열성 FEN1을 혼합한 신속하면서도 높은 신뢰도의 정량 PCR

기본적으로 실험은 실시예 1과 동일하게 진행하였다. 신속 PCR 구현을 위해 빠른 조건을 사용하였으며 Pfu 폴리머라제의 경우 비교 대상인 Taq 폴리머라제와 동일하게 1 unit (50 ng)을 사용하였다.

Pfu 폴리머라제는 Taq 폴리머라제의 5‘->3’ 엑소/엔도뉴클레아제 활성 대신 3‘->5’ 엑소뉴클레아제 활성을 보유하고 있다. 이 때문에 잘못 복제된 염기서열을 교정할 수 있어 높은 정확성 (fidelity)이 요구되는 핵산의 합성에 주로 사용된다. 그러나 5’->3’ 뉴클레어제 활성이 없어 TaqMan qPCR 에 적용할 수 없다는 단점을 가지고 있다.

신규한 바이러스의 정확한 진단을 할 경우, TaqMan과 같은 방식의 프로브를 사용한 정량 PCR을 통해 빠른 진단을 수행하고 해당 정량 PCR에서 증폭된 산물에 대한 서열 분석을 통해 유전자의 변이 여부를 분석하여 ‘동정’ 작업을 수행하는 작업이 요구될 수 있다. 특히 최근 유행하는 MERS-CoV 의 경우 정확한 확진을 위해서 ORF1b 와 N gene 에 대한 염기서열분석 분석이 필요하다. 그러나 기존의 Taq 폴리머라제를 이용한 TaqMan 정량 PCR 산물의 경우, Taq 폴리머라제 자체의 낮은 정확도로 인해 서열 분석에 적합하지 않다는 문제가 있다. 따라서 서열 분석을 위해서는 교정 기능이 있는 Pfu 폴리머라제로 검체를 또 다시 증폭해야 하며, 시료가 충분하지 않거나 감염의 위험이 있는 경우 정확하고 안전한 진단에 어려움이 발생한다.

하지만 본원에 따른 방법에서는 내열성 FEN1을 Pfu 폴리머라제와 혼합하여 사용하여, 5‘->3’ 뉴클레아제 활성이 없음에도 불구하고 FEN1의 활성을 통해 TaqMan qPCR을 가능하게 할 수 있음을 확인하였다.

결과는 도 7에 기재되어 있으며, Taq 폴리머라제 + FEN1 과 Pfu 폴리머라제 + FEN1을 사용하여 TaqMan qPCR을 구현한 실험 결과를 개시한다. 본 실험에서 사용된 폴리머라제 들은, Fast PCR 이 가능하도록 하기 위해서 각각 Sso7d 가 융합된 형태의 폴리머라제를 사용하였다. Fast Taq (Sso7d-ΔTaq + FEN1) 과 Fast Pfu (Sso7d-Pfu + FEN1)를 사용한 경우, 모두 유사한 증폭 곡선과 Ct 값을 나타내었다 (도 7의 A). 이렇게 증폭된 PCR 산물을 각각 클로닝 한 후, 서열 분석을 통해 돌연변이 발생 확률을 분석한 결과 Fast Pfu를 사용한 경우가 Fast Taq을 사용한 경우보다 약 20배 이상 돌연변이 발생 확률이 낮은 것을 확인하였다 (도 7의 B). 본 실험에 사용한 표적 서열은 도 7의 C에 나타나 있으며 돌연변이가 주로 발생한 부위를 붉은색으로 표시하였다 (밑줄은 forward/reverse primer 서열, 밑줄+이탤릭은 TaqMan probe 서열).

이러한 결과는, 신속한 합성의 특성과 교정 기능을 모두 보유한 Sso7d-Pfu 폴리머라제와 내열성 5’ 플랩 엔도뉴클레아제 (FEN1)를 혼합하면, 기존에는 가능하지 않았던 FRET 기반의 정량 PCR의 구현이 가능하여, 빠른 증폭은 물론 정확도가 높은 다양한 핵산 검출이 가능하다.

본원에서는 5‘ 뉴클레아제 활성이 결여된 다양한 형태의 폴리머라제로 nTaq, Sso7d-Taq 및 Sso7d-Pfu를 본 방법에 사용한 실험을 통해 이들 효소가 FRET 기반의 증폭에 성공적으로 적용될 수 있음을 확인하였다. 따라서 다양한 유래 및/또는 유형의 5’엑소뉴클리아제 기능 또는 활성이 결여 또는 감소된 효소가 본원의 방법에 성공적으로 적용되어 활용될 수 있다.

본 발명은 2014년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 연구개발특구진흥재단의 “연구개발특구육성(특구기술사업화사업)“지원을 받아 (주)엔지노믹스에서 수행된 연구(No.2014DD017}를 기반으로 한 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (11)

1. 표적 핵산, 상기 표적 핵산에 결합하는 적어도 하나의 프라이머 및 프로브, 데옥시뉴클레오타이드 5‘-트리포스페이트, 및 효소로서 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 포함하는 증폭 반응 조성물을 제공하는 단계, 상기 단계에서 상기 프로브는 상기 표적 핵산에 특이적 염기만으로 구성되고, 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 내열성 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제는 1: 1 내지 1:2의 몰비로 포함되고, 그리고,
   상기 표적 핵산을 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계를 포함하는, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소를 이용한 FRET 기반의 핵산 검출 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소는 원래 상기 활성이 없는 효소이거나 또는 상기 활성을 갖지 않도록 돌연변이가 유발된 것인, 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 DNA 중합효소는 Methanococcus jannaschii, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 또는 Aquifex aeolieus 유래인, 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 감소된 핵산 중합효소는 N 말단이 결여되거나 또는 N 말단의 엑소뉴클라아제 도메인에 돌연변이가 도입된 폴리머라제, 또는 N 또는 C 말단에 DNA 결합 활성을 가지는 폴리펩타이드가 연결(fusion) 된 폴리머라제로, 상기 폴리머라제는 Taq (Thermus aquaticus), Pfu (Pyrococcus furiosus) 폴리머라제, Tth (Thermus thermophilus) 폴리머라제, 또는 Tf1 (Thermus flavus) 폴리머라제인, 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 내열성 플랩 엔도뉴클레아제는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 또는 Archaeaglobus veneficus 유래인, 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 증폭은 PCR이며, 상기 검출은 정량적 또는 정성적 검출인, 방법.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 사용되는 키트로서, 상기 키트는 핵산 증폭에 필요한 효소로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 1:1 내지 1:2의 몰비로 포함하는, FRET 기반의 핵산 검출 키트.
   
10. 핵산 증폭에 필요한 효소로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되거나 또는 감소된 DNA 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 1:1 내지 1:2의 몰비로 포함하는, FRET 기반의 핵산 검출용 조성물.
    
11. 핵산 증폭에 필요한 효소로서, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되고 교정기능이 있는 중합효소 및 내열성 플랩 엔도뉴클레아제를 1:1 내지 1:2의 몰비로 포함하는, FRET 기반의 핵산 검출용 조성물.

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