CN101016564B - 一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片。其步骤是以醛基玻片为载体，其次是引物和探针设计，第三是芯片点阵布控，最后是监控系统与检测系统的点阵布控。监控系统由碱基突变位点的阴性对照、阳性对照和平行对照组成；检测系统为待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型探针。每芯片含1～3个0.04cm²的点样矩阵、每个矩阵90条探针、324个样点。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增和Cy5标记、1次杂交反应，即可检测1～3份不同标本的mtDNA 45个位点。适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。

Description

一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片

技术领域

本发明涉及一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片。可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。

背景技术

糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的复杂代谢性疾病，发病率逐年上升，我国的糖尿病发病人数位居世界第二，其中90％为2型糖尿病，且发病年龄趋向年轻化。持续高血糖所引发的慢性并发症已成为肾功能衰竭、失明和心脑血管疾病的主要原因，给个人、社会和国家医疗保健带来了沉重的负担，成为全球性的社会卫生和经济问题。线粒体基因缺陷赋予了个体一定的糖尿病遗传易感性。1999年世界卫生组织制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于β细胞遗传缺陷疾病，线粒体糖尿病成为糖尿病中的主要亚型之一。然而目前临床上对糖尿病的诊断通常只分为1型和2型，仅根据临床实验室的一般生化和免疫项目检测难以正确诊断线粒体糖尿病，因此，检测糖尿病的线粒体DNA易感基因位点，对于糖尿病的正确分类、线粒体糖尿病的早期诊断和积极预防有着重要的意义。

传统的糖尿病线粒体基因突变检测方法主要包括：PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等，这些方法在基因突变检测中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等，不适用于大批量、系统检测，给线粒体糖尿病的临床诊断带来困难。

快速准确地检测糖尿病线粒体基因突变是早期诊断线粒体糖尿病的关键指标。PCR-RFLP方法是经典的生物学方法，但由于限制性内切酶识别位点有限，难以实现同时检测多个位点，且耗时较长；AS-PCR方法虽能准确检测突变，但要求扩增条件非常优化，且引物要有高度的特异性，否则易出现假限性或假阳性结果(Urata M，Wada Y，Kim SH，et al.High-sensitivity detection of the A3243Gmutation of mitochondrial DNA by a combination of allele-specific PCR and peptidenucleic acid-directed PCR clamping.Clin Chem，2004，50：2045-2051.)；DNA测序虽是目前公认的检测新突变的金标准，但由于其对特殊结构DNA序列无法测序，而且只有异质性水平＞25％时才能检出，而临床常用标本外周血白细胞中异质性水平通常都达不到这个标准，因此很易漏检(Maitra A，Cohen  Y，Gillespie SE，et al.The Human MitoChip：a high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14：812-819.)。因此，如何快速、准确检测糖尿病线粒体基因突变是线粒体糖尿病临床诊断的主要难题之一。

基因芯片是近年来兴起的一项重要生物技术，越来越多地应用于基因表达、基因突变检测、多态性分析和基因诊断(Poddar SK.Symmetric vs asymmetric PCRand molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus.Mol CellProbes，2000，14：25-32.王军，王升启，程晓霞，等.寡核苷酸微阵列法检测高血压患者血管紧张素转换酶基因多态性的临床应用.中华检验医学杂志[J]，2005，28：276-277.)。Chee等于1996年利用标准的光刻和固相DNA合成技术合成寡核苷酸探针，成功研制了第一张线粒体基因测序芯片(Chee M.，Yang R.，Hubbell E.etal.Accessing genetic information with high-density DNA arrays.SCIENCE，1996，274：610-614.)；其后，Maitra等于2004年也利用该项技术研发了用于癌症线粒体基因突变检测的双链测序芯片(Maitra A，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChip：a high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14：812-819.)。这两种测序芯片可对线粒体基因进行系统的分析，但检测技术和设备要求高，难以在临床实践中普遍应用。2005年Park等研制了Cy3标记的RNA靶探针寡核苷酸芯片对年轻的成人发病型糖尿病(MODY)的HNF-1α突变进行了检测(Park HG，Ham HO，Kim KH，HuhN.Oligonucleotide chip for the diagnosis of HNF-1αmutations.Biosensors andBioelectronics，2005，21：637-644.)。Du等于2003年利用功能化单层金芯片检测了线粒体tRNALeu(UUR)基因3243、3251、3256、3260、3302、3303和tRNAlys基因的8344共7个位点突变(Du WD，Marsac C，Kruschina M et al.Functionalizedself-assembled monolayer on gold  for detection of human mitochondrial tRNA genemutations.Analytical Biochemistry，2003(322)：14-25.)。但总的来说，这些芯片检测的基因位点有限，均在十个以内，而且均不是针对糖尿病相关的线粒体基因突变检测。因此，本课题组对糖尿病线粒体基因突变进行了相关研究，制备的9个突变位点(tRNA^Leu(UUR)基因：3243，3256，3290；ND1基因：3316，3394，3593，3606，3618，3688)检测芯片，以醛基玻片作为载体，10条探针的5＇或3＇端加长臂15T后经氨基修饰后固定在玻片上，被检测的目的DNA以荧光染料Cy3标记，阳性对照为3290位点的野生型探针和突变型探针混合液。利用该芯片对经PCR-RFLP方法筛选出的已知突变标本进行了检测，初步摸索了试验条件，不足之处是芯片未设立阴性对照、Cy3荧光染料的背景较高、以及所检测位点少(刘松梅，周新，李霞等.2型糖尿病线粒体基因8个突变位点的研究.中国病理生理杂志，2006，22：586-591.)。之后，又研制了检测28个突变位点(tRNA^Leu(UUR)基因：3243，3250，3251，3252，3254，3256，3260，3264，3290，3302，3303；ND1基因：3316，3391，3394，3398，3399，3421，3426，3460，3537，3593，3606，3618，3688，4136，4164，4200，4216)的检测芯片，以尼龙膜为载体，56条探针经长臂8T修饰后，用478A手工点样仪(美国UVP公司)点样，通过紫外线照射固定在尼龙膜上，被检测的目的DNA以生物素标记，阳性对照为生物素标记的3243位点野生型探针和突变型探针混合液，阴性对照为5×SSC探针稀释液。利用该膜芯片对200例2型糖尿病标本和210名正常对照标本进行了检测，检出了7种突变位点，具有成本低，无需特殊设备，经济实用特点。不足之处是膜芯片样点不够规整，所需的洗片和显色过程耗时较长，目视化观察判断结果存在一定的假阳性率和假阴性率、以及不能系统检测整个线粒体突变位点(刘松梅，周新，郑芳等.基因芯片筛查2型糖尿病线粒体DNA碱基突变.中华医学杂志，2006，86(40)：2853-2857.)。因而，本课题组进一步研制了45个突变位点检测的玻璃基因芯片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片。该芯片设计了监控系统和检测系统。监控系统包括碱基序列设计合理的野生型和突变型探针组成的阳性对照和平行对照，以及探针稀释液组成的阴性对照；检测系统由待检的mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针组成。每张芯片包含1～3个0.04cm²的点样矩阵，每个矩阵90条探针、324个样点(18行×18列)，布控合理、规整，度高。实验操作流程简单，省时，成本低，仅需1次不对称PCR扩增和Cy5标记、1次杂交反应，即可筛查1～3份不同标本的mtDNA45个位点。该芯片检测所需试剂微量、结果准确、效率高，克服了传统和现有方法中存在的不足(如漏检、耗时长等)，达到了快速检测线粒体糖尿病的临床效果。可满足不同层次医院的要求，适用于糖尿病患者和高危人群的检测，有助于临床特殊类型糖尿病的正确诊断和分类，早发现病人，早预防，早治疗。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

(1)计算机软件辅助设计探针和引物

该芯片是一种检测多位点极为复杂的反应体系，涉及90条探针和18条引物的设计和筛选。本发明按疾病相关遗传基因生物学规律，结合PCR理论，考虑一次性快速准确检测线粒体糖尿病，既不漏诊，也不误诊等方方面面，进行设计、排列组合，巧妙布控。采用生物软件Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational.CA)和NCBI BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)辅助设计和分析所需的探针和引物，使目的片段扩增和杂交反应，能在同一条件下完成，要求苛刻，技术含量高。

(2)芯片矩阵布控设计

一张芯片上同时固定检测mtDNA 45个突变位点的探针90条，囊括目前国内外报道的与糖尿病相关的整个线粒体基因突变位点。每个基因位点的野生型和突变型探针，平行点印3个样点，即6个样点检测1个基因位点，共点印324个样点(18行×18列)，包括阳性对照、阴性对照和平行对照，组成微阵列芯片的质量保证和检测监控体系，确保检测的准确性，既防漏检，又防误诊，减小误差。具体布控矩阵如图1所示。

(3)涉及多种复杂的反应过程

该芯片涉及多种复杂反应过程，包括物理过程、化学反应、生物化学反应和分子生物学反应，如玻片的醛基化修饰，点样，固定，DNA模板的提取，PCR扩增和标记，杂交、洗涤、显色等。

检测线粒体糖尿病时，只需患者的外周血100μl或带毛囊的头发3-5根、进行一次不对称PCR和一次杂交反应，即可于6小时内准确地检测1～3份被检标本是否存在上述45个基因位点突变。

(4)靶DNA标记和检测

基因芯片的被检测目的片段的标记与扩增同步，采用Cy5荧光标记，无需显色，洗片后直接使用荧光扫描仪观察结果，节省实验时间。

(5)荧光信号分析

该微阵列芯片通过GenePix pro 4.0软件获取324个样点的荧光信号强度，通过已知突变位点的野生型和突变型探针荧光信号强度比值，背景信号强度确立突变型的Cutoff值。GeneSpring 7.3软件(Silicon Genetics company)分析45个基因位点野生型和突变型探针的检测效率。

一种检测线粒体糖尿病45个基因位点微阵列芯片的制备步骤是：

(1)以醛基玻片为载体：

玻片经铬酸洗液浸泡过夜，去除表面有机物等杂质，然后用蒸馏水清洗，再用25％氨水浸泡过夜，水洗。pH为4.5氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇浸20min，再用95％乙醇超声清洗，纯水超声清洗，115℃烘干45min。最后在5％的戊二醛溶液中50min，超声10min，水洗两次，置于室温干燥备用。

(2)设计引物和探针

本发明研制的微阵列芯片可检测目前国内外报道的与糖尿病相关的线粒体基因45个突变位点。首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病相关的线粒体基因突变位点，再以线粒体基因剑桥序列(GenBank#J01415.0gi：337188)作为参考序列，采用Primer Premier5.0(PREMIER Biosoft  International，CA)和NCBI  BLAST  软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).针对mtDNA 45个突变位点.设计特异性野生型和突变型寡核苷酸探针90条(请见表1，mtDNA 45个位点野生型和突变型探针序列)，退火温度为59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，以及特异性扩增9个目的DNA片段序列(Sequence ID 1-9)引物18条(请见表2，9个目的片段的特异性扩增引物)。

未公开的引物7F和7R扩增范围为mtDNA 14470-14944(Sequence ID 7)，该片段涵盖了mtDNA 14577T→C，14693A→G，14709T→C 3个突变位点。未公开的72条探针(表1中未标明下划线的碱基序列)的G+C碱基含量为40％～60％、退火温度为56.7～62℃，与已公开的9个位点探针可在同一个杂交反应体系发生反应，既可检测位于线粒体16S rRNA基因、tRNA^Leu(UUR)基因、ND1基因、ND2基因、ND4基因、tRNA^Glu基因和D-loop区的36个位点的碱基突变，又可检测线粒体tRNA^Leu(UUR)基因和ND1基因的9个突变位点(已公开的玻璃载体基因芯片检测位点)，进一步完善了基因芯片的设计和应用，达到了系统地检测与糖尿病相关的整个线粒体基因的45个突变位点，检测效率大为提高，不会漏检上述36个突变位点，实现了使用该膜芯片检测线粒体糖尿病既无漏诊、又无误诊的目标。

(3)芯片点阵布控

所研制的微阵列芯片为324个样点组成的18行×18列的矩阵(图1)，包括监控系统和检测系统。

监控系统包括3个部分，分别为：①芯片阴性对照，为探针稀释液(pH 8.0，1×TE Buffer)，布控在有公共野生型探针的位点处，如点样矩阵(图1)中，mtDNA3200，3205与3206位点公用一条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照。若阴性对照杂交后无信号或信号与背景信号持同，表明正常；若有杂交信号或高于背景信号，表明探针稀释液有污染或点样过程有污染。②芯片阳性对照，为mtDNA 3243和5178两个位点的4条探针按1∶1∶1∶1比例混合的5μM溶液，布控在微阵列芯片的左边3列，共54(18×3)个阳性对照样点，如图1所示。若杂交后有信号，表明正常；若无信号，则说明实验失败或这两个基因位点所处的片段同时缺失，但目前尚无此报道。③芯片平行对照，为各位点的5μM的探针溶液平行点印3个点，如图1中mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针各点印3个样点，即6个样点检测1个基因位点。若信号强度均一，说明杂交和洗涤过程控制良好，探针的结合能力好，具有可重复性，否则表明探针的结合能力或特异性存在问题，或是杂交或洗涤过程控制欠佳。

检测系统由线粒体基因45个位点的90条野生型和突变型寡核苷酸探针布控的样点组成；每条探针均采用pH8.0的1×TE Buffer稀释为5μM溶液，并点印3个平行点，即6个样点(野生型和突变型探针各3个样点)检测1个基因位点，45个基因位点按照从左到右从小到大的顺序排列(图1)。如果应用于线粒体糖尿病高危人群筛选，当某个位点的突变型与野生型探针信号比值(ratio-1)≥1.1且消减背景信号后的两者比值(ratio-2)≥1.3，则判定该位点发生突变。如果应用于临床线粒体糖尿病确诊，则ratio-1和ratio-2值均必须超过2.0或者其中之一超过3.0。

(4)监控系统与检测系统的点阵布控：监控系统与检测系统的点阵布控在同一区域。采用Packard芯片点样仪(Nanoliter Dispensing system，PackardInstrument Company)点印于醛基玻片上；室温(25～30℃)保湿固定48～72小时，4℃冰箱保存备用。该微阵列芯片洗涤过程为：室温(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗涤5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗涤15min×2次，室温下双蒸水洗涤10min，离心甩干。

表1 mtDNA 45个位点野生型和突变型探针序列

注：带下划线突变位点的探针序列在研制者发表的文章中已公开

表2  9个目的片段的特异性扩增引物

引物编号	序列，5＇→3＇	扩增范围	产物长度
				1	F：CTTGACCGCTCTGAGCTAAACR：TGTTGAGCTTGAACGCTTTC	1657-2216	560bp
2	F：AGCGCCTTCCCCCGTAAATGAR：AGAATGATGGCTAGGGTGACTTC	3160-3755	596bp
				3	F：GACGCACTCTCCCCTGAACTCCR：GGATTCTCAGGGATGGGTTCG	4048-4365	318bp
4	F：CCCTTTCACTTCTGAGTCCCAGR：CTTTGAAGGCTCTTGGTCTGTAT	4797-5549	753bp

引物编号	序列，5＇→3＇	扩增范围	产物长度
				5	F：CGGTCAATGCTCTGAAATCTGTGR：CATTGTTGGGTGGTGATTAGTCG	8164-8669	506bp
6	F：TGCTAGTAACCACGTTCTCCTGR：CCGATGAACAGTTGGAATAGG	11901-12764	864bp
				7	F：<u>TCCAAAGACAACCATCATTCC</u>R：<u>GATTGATGAAAAGGCGGTTGA</u>	14470-14944	475bp
8	F：CGCCTACACAATTCTCCGATCR：CGGTTGTTGATGGGTGAGTC	15574-16084	511bp
				9	F：AACTCCACCATTAGCACCCR：GGGATATTGATTTCACGGAG	15973-16427	455bp

注：带下划线引物序列(7F，7R)尚未公开，其余的16条引物序列在研制者发表的文章中已公开或来自文献(Levin BC，Cheng H，Reeder DJ(1999)A human mitochondrial DNAstandard reference material for quality control in forensic identification，medical diagnosis，andmutation detection.Genomics 55：135-146.Fukuda M，Nakano S，Imaizumi N，Kitazawa M，Nishizawa M，Kigoshi T，Uchida K(1999)Mitochondrial DNA mutations are associated with bothdecreased insulin secretion and advanced microvascular complications in Japanese diabeticsubjects.J Diabetes Complications 13：277-283.)

一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片的检测步骤是：

(1)收集病人标本，提取模板DNA。

(2)采用表2中9对引物进行不对称多重PCR扩增目的DNA(Sequence ID 1-9)。不对称PCR反应液是由10×buffer(晶美公司)，10μmol/L的各正向引物(1F-9F)，1μmol/L各反向引物(1R-9R)，25mmol/L MgCl₂(晶美公司)，10mmol/L dNTPs(含0.5nM Cy5-dCTP，由Amersham公司提供)，1U Tag DNA聚合酶(晶美公司)和无菌双蒸水组成。引物1和4，2和3，5和6可行多重不对称PCR。扩增条件为95℃预变性3min，35个循环(94℃变性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min。

(3)PCR产物100℃煮沸变性，-20℃聚冷。

(4)42℃预杂交30min封闭芯片非特异性结合，将变性的Cy5标记ssDNA与预热的杂交液1∶10混匀，充入反应舱42℃杂交3h。标记的被检标本扩增的目的片段在相同的杂交反应条件下同时与监控系统和检测系统的所有探针反应。

(5)室温(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗涤5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗涤15min×2次，室温下双蒸水洗涤10min，离心甩干。

(6)Axon Genepix 4000B芯片扫描仪在650nm波长采集芯片图像(图2)，GenePix Pro 4.0软件获取各个点的荧光强度和背景信号，根据信号比值判定被检测位点是否发生突变，即可对线粒体糖尿病进行筛查和确诊。(Cy5对光敏感，整个操作过程尽量避光)

(7)与已公开的基因芯片比较，该微阵列芯片具有独特优点：①1张芯片可同时检测1～3份不同标本mtDNA 45个位点碱基突变；②操作简单，无需单独标记靶DNA，无需显色，且Cy5标记的检测荧光背景信号低；③可检测mtDNA 45个位点碱基突变，无漏检和误诊，在9个位点玻璃芯片和28个位点膜芯片所检测报告阴性标本中检出了位于线粒体16S rRNA基因、tRNA^Leu(UUR)基因、ND1基因、ND2基因、ND4基因、tRNA^Glu基因和D-loop区的其它位点的碱基突变，并均经DNA测序验证(图3)；④根据野生型和突变型探针荧光强度比值，以及背景信号强度，判断被检位点是否发生突变，结果科学客观，其误差远远小于膜芯片目视化观察结果。该微阵列芯片的突变型探针和野生型探针的背景荧光强度分别为43.25±2.1，44.56±2.63；各基因位点的片内平行对照点之间的荧光强度一致性好，变异系数小于5.6％；片间相同位点之间变异系数小于7.46％，减去背景信号的阳性探针荧光强度明显高于阴性探针(t＝8.6，P＝0.000)，易于判断结果；检测结果假阴性率为0.53％，假阳性率为2.22％；而膜芯片的假阴性率为1.1％，假阳性率为4.9％。⑤成本低，反应体系微量，1次不对称PCR的反应体系为25μl，1次杂交反应体系为200μl。

发明的优点和效果：

本发明研制了一种快速检测线粒体糖尿病的45位点微阵列芯片。该芯片具有很多优点：①9个目的DNA片段的扩增和Cy5荧光染料标记可在同一条件下进行，多重不对称PCR可获得大量Cy5-ssDNA，足以保证后续杂交反应所需的DNA量，省时并降低了实验成本；②探针退火温度为59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，在42℃进行杂交反应时可获得满意的杂交效果；③Cy5荧光染料标记，洗片后直接采用荧光扫描仪观察结果，无需显色，根据两种探针杂交信号的强弱，可判断被检测位点是否发生突变，省时；④芯片包含监控系统和检测系统两个体系，可系统检测糖尿病相关的线粒体基因45个突变位点，并有质量控制；④提供的玻璃芯片可应用于临床，具有很好的应用市场和经济效益。因此，该芯片可快速检测线粒体基因45个位点突变，适用于糖尿病患者和高危人群的筛查，辅助线粒体糖尿病的确诊。本发明为进一步拓展线粒体基因突变相关疾病的筛查提供了一条新的思路、奠定了基础。

附图说明

图1  45个突变位点检测微阵列芯片点样矩阵

图中：●，阳性对照；◎，突变型探针；⊙，野生型探针；○，阴性对照；数字为基因位点

图2  Cy5标记45个突变位点检测微阵列芯片检测结果

图2A中：a，3593T→C突变，b，4833A→G突变，c，16223T基因型；图2B中a，12026 A→G突变，b，16223T基因型。

图3微阵列芯片检测的mtDNA15个突变位点经测序验证结果图

图中：箭头所指为突变后的碱基，数字为突变的基因位点

具体实施方式

实施例1

样品的处理和标记

(1)新鲜全血标本

采用改良NaI方法(喻红，彭芳芳.医学生物化学与分子生物学实验技术，第1版，武汉大学出版社，2003)提取DNA模板。

(2)血痕标本

取1.5×1.5cm²大小的血痕，浸人1ml双蒸水中，振荡混匀后，12,000rpm离心3min，去上清，加双蒸水洗涤一次，然后加入200μl 5％的Chelex-100，56℃孵育20～30min后，煮沸8min，10,000rpm离心3min，取上清进行PCR扩增。

(3)毛球标本

将3～4根毛发在距离根部3～4mm处剪断，毛球浸于Chelex-100溶液中，置56℃保温6～10h。振荡5～10s。100℃煮沸10min后，10000r/min离心3min，取上清液待用。

样本处理好之后，进行目的DNA扩增：不对称PCR反应液是由10×buffer，10μmol/L的各正向引物，1μmol/L各反向引物，25mmol/LMgCl₂，10mmol/LdNTPs(含0.5nM Cy5-dCTP，由Amersham公司提供)和无菌双蒸水组成。且引物1和4，2和3，5和6可行多重不对称PCR。扩增条件为95℃预变性3min，35个循环(94℃变性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min；PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后，100℃煮沸10min变性后放入-20℃冰箱聚冷备用。

实施例2

芯片制作方法

将45个位点的90条氨基修饰的野生型和突变型探针用1×TE-Buffer(1mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，稀释为终浓度为5μM；按照附图一的所示的点样矩阵排列在384孔板(Costar)中，通过芯片点样仪(Nanoliter Dispensing system，Packard Instrument Company)点印于醛基修饰的载玻片表面，置于密闭的饱和盐溶液上方保持相对湿度，室温(25℃～30℃)下固定48～72小时，4℃冰箱保存备用。

实施例3

杂交反应和信号检测

42℃预热杂交液(Roche)，充入芯片反应舱，预杂交30min，以封闭基片非特异性结合；取变性的标记PCR产物混合液45μl与预热的杂交液按1∶10混合，避光充入反应舱，42℃杂交3小时。

室温(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗涤5min×2次(20×SSC-Buffer：8.766g氯化钠，4.412g柠檬酸钠，双蒸水定容至50ml，氢氧化钠调pH至7.5；0.1％SDS：1克SDS(十二烷基磺酸钠)溶于100ml双蒸水)，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗涤15min×2次，室温下双蒸水洗涤10min，离心甩干。AxonGenepix 4000B芯片扫描仪在650nm波长采集芯片图像(图2)，GenePix Pro 4.0软件获取各个点的荧光强度和背景信号，根据信号比值判定被检测位点是否发生突变。(Cy5对光敏感，整个操作过程尽量避光)

GeneSpring 7.3软件(Silicon Genetics company)对芯片的分析结果如下。Gene Name  Fold Change Description

5178w3 19.45 5178 wild-type probe

5178w1 17.99 5178 wild-type probe

5178w2  17.03 5178 wild-type probe

12026ml 6.356 12026 mutant probe

12026m3 5.254 12026 mutant probe

12026m2 4.485 12026 mutant probe

4833w2 3.898 4833 wild-type probe

3251w2 3.755 3250，3251，3252，3254 and 3256 public wild-type probe

3391m3 3.231 3391 mutant probe

3394m2 2.946 3394 mutant probe

3606w3 2.766 3606 wild-type probe

3391ml  2.766 3391 mutant probe

3606w2  2.744    3606 wild-type probe

3606w1  2.667    3606 wild-type probe

3394m3  2.603    3394 mutant probe

3391m2  2.599    3391 mutant probe

3394m1  2.555    3394 mutant probe

3460w1  2.532    3460 wild-type probe

3460w2  2.513    3460 wild-type probe

3316w3  2.237    3316 wild-type probe

3316w1  2.175    3316 wild-type probe

16223w2 2.127    16223 wild-type probe

3316w2  2.092    3316 wild-type probe

12258w2 2.079    12258 wild-type probe

12026w3 0.482    12026 wild-type probe

12026w1 0.44    12026 wild-type probe

14577m1 0.386    14577 mutant probe

3398m3  0.383    3398 mutant probe

3302w3  0.372    3302 and 3303 public wild-type probe

3254m3  0.37    3254 mutant probe

15812m1 0.347    15812 mutant probe

3254m1  0.345    3254 mutant probe

15812w2 0.317    15812 wild-type probe

15812w3 0.286    15812 wild-type probe

15812w1 0.284    15812 wild-type probe

15812m3 0.229    15812 mutant

Gene Name    P-value DescriDtion

3206w2  0.0491  3200，  3205 and 3206 public wild-type probe

3399m3  0.0474  3399 mutant probe

8381w2  0.0434  8381 wild-type probe

4164w2  0.0409  4164 wild-type probe

4164w3  0.0397  4164 wild-type probe

8381w1  0.0389  8381 wild-type probe

3206w3  0.0389  3200，  3205 and 3206 public wild-type probe

4200w3  0.0385  4200 wild-type probe

4164w1  0.0361  4164 wild-type probe

16223w2 0.0341  16223 wild-type probe

3399m1  0.032    3399 mutant probe

16223w3 0.031    16223 wild-type probe

3290w2  0.0281  3290 wild-type probe

3618w2  0.028    3618 wild-type probe

14709m1 0.025    14709 mutant probe

4216w3  0.024    4216 wild-type probe

3593w3  0.0214  3593 wild-type probe

14577m1 0.0212  14577 mutant probe

14577w1 0.0211  14577 wild-type probe

4216w2  0.0181  4216 wild-type probe

14577w2 0.0172  14577 wild-type probe

14693m3 0.0153  14693 mutant probe

14577w3 0.0149  14577 wild-type probe

3256m2  0.0148  3256 mutant probe

14709w3 0.0142  14709 wild-type probe

14577m3 0.0119  14577 mutant probe

14577m2 0.0115  14577 mutant probe

14693m1 0.00975  14693 mutant probe

16223m1 0.00924 16223 mutant probe

14709w2 0.00837 14709 wild-type probe

12026w2 0.00693 12026 wild-type probe

14709w1 0.00619 14709 wild-type probe

4216w1  0.00581 4216 wild-type probe

16223m2 0.00362  16223 mutant probe

3606w1  0.00326 3606 wild-type probe

3290w3  0.00291 3290 wild-type probe

16223m3 0.00218 16223 mutant probe

4136w2  0.000814  4136 wild-type probe

3290w1  0.000639  3290 wild-type probe

4136w1  0.000519  4136 wild-type probe

3606w2  0.000326  3606 wild-type probe

4136w3  0.000108  4136 wild-type

<110>  武汉大学

<120>  一种检测线粒体糖尿病的45个基因位点微阵列芯片

<130>  mtDNA1657-2216

<160>  9

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  560

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>  1

cttgaccgct ctgagctaaa cctagcccca aacccactcc accttactac cagacaacct  60

tagccaaacc atttacccaa ataaagtata ggcgatagaa attgaaacct ggcgcaatag  120

atatagtacc gcaagggaaa gatgaaaaat tataaccaag cataatatag caaggactaa  180

cccctatacc ttctgcataa tgaattaact agaaataact ttgcaaggag agccaaagct  240

aagacccccg aaaccagacg agctacctaa gaacagctaa aagagcacac ccgtctatgt  300

agcaaaatag tgggaagatt tataggtaga ggcgacaaac ctaccgagcc tggtgatagc  360

tggttgtcca agatagaatc ttagttcaac tttaaatttg cccacagaac cctctaaatc  420

cccttgtaaa tttaactgtt agtccaaaga ggaacagctc tttggacact aggaaaaaac  480

cttgtagaga gagtaaaaaa tttaacaccc atagtaggcc taaaagcagc caccaattaa  540

gaaagcgttc aagctcaaca    560

<210>  2

<211>  596

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>  1

agcgccttcc cccgtaaatg atatcatctc aacttagtat tatacccaca cccacccaag    60

aacagggttt gttaagatgg cagagcccgg taatcgcata aaacttaaaa ctttacagtc    120

agaggttcaa ttcctcttct taacaacata cccatggcca acctcctact cctcattgta    180

cccattctaa tcgcaatggc attcctaatg cttaccgaac gaaaaattct aggctatata    240

caactacgca aaggccccaa cgttgtaggc ccctacgggc tactacaacc cttcgctgac    300

gccataaaac tcttcaccaa agagccccta aaacccgcca catctaccat caccctctac    360

atcaccgccc cgaccttagc tctcaccatc gctcttctac tatgaacccc cctccccata    420

cccaaccccc tggtcaacct caacctaggc ctcctattta ttctagccac ctctagccta    480

gccgtttact caatcctctg atcagggtga gcatcaaact caaactacgc cctgatcggc    540

gcactgcgag cagtagccca aacaatctca tatgaagtca ccctagccat cattct        596

<210>  3

<211>  318

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>    1

gacgcactct cccctgaact ctacacaaca tattttgtca ccaagaccct acttctaacc    60

tccctgttct tatgaattcg aacagcatac ccccgattcc gctacgacca actcatacac    120

ctcctatgaa aaaacttcct accactcacc ctagcattac  ttatatgata tgtctccata   180

cccattacaa tctccagcat tccccctcaa acctaagaaa tatgtctgat aaaagagtta    240

ctttgataga gtaaataata ggagcttaaa cccccttatt tctaggacta tgagaatcga    300

acccatccct gagaatcc                                                  318

<210>  4

<21l>  753

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>    1

ccctttcact tctgagtccc agaggttacc caaggcaccc ctctgacatc cggcctgctt    60

cttctcacat gacaaaaact agcccccatc tcaatcatat accaaatctc tccctcacta    120

aacgtaagcc ttctcctcac tctctcaatc ttatccatca tagcaggcag ttgaggtgga    180

ttaaaccaga cccagctacg caaaatctta gcatactcct caattaccca cataggatga    240

ataatagcag ttctaccgta caaccctaac ataaccattc ttaatttaac tatttatatt    300

atcctaacta ctaccgcatt  cctactactc aacttaaact ccagcaccac gaccctacta   360

ctatctcgca cctgaaacaa gctaacatga ctaacaccct taattccatc caccctcctc    420

tccctaggag gcctgccccc gctaaccggc tttttgccca aatgggccat tatcgaagaa    480

ttcacaaaaa acaatagcct catcatcccc accatcatag ccaccatcac cctccttaac    540

ctctacttct acctacgcct aatctactcc acctcaatca cactactccc catatctaac    600

aacgtaaaaa taaaatgaca gtttgaacat acaaaaccca ccccattcct ccccacactc    660

atcgccctta ccacgctact cctacctatc tcccctttta tactaataat cttatagaaa    720

tttaggttaa atacagacca agagccttca aag                                 753

<210>  5

<211>  506

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>    1

cggtcaatgc tctgaaatct gtggagcaaa ccacagtttc atgcccatcg tcctagaatt    60

aattccccta aaaatctttg aaatagggcc cgtatttacc ctatagcacc ccctctaccc    120

cctctagagc ccactgtaaa gctaacttag cattaacctt ttaagttaaa gattaagaga    180

accaacacct ctttacagtg aaatgcccca actaaatact accgtatggc ccaccataat    240

tacccccata ctccttacac tattcctcat cacccaacta aaaatattaa acacaaacta    300

ccacctacct ccctcaccaa agcccataaa aataaaaaat  tataacaaac cctgagaacc    360

aaaatgaacg aaaatctgtt cgcttcattc attgccccca caatcctagg cctacccgcc    420

gcagtactga tcattctatt  tccccctcta ttgatcccca cctccaaata tctcatcaac    480

aaccgactaa tcaccaccca  acaatg                                         506

<210>  6

<211>  864

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>    1

tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct acttacagga ctcaacatac    60

tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac acaatggggc tcactcaccc    120

accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa caccctcatg ttcatacacc    180

tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat taccgggttt tcctcttgta    240

aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa cagaggctta cgacccctta    300

tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc catgtctaac aacatggctt    360

tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag gccccaaaaa ttttggtgca    420

actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc accctaaccc tgacttccct    480

aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa aaaaactcat acccccatta    540

tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc ttccccacaa caatattcat    600

gtgcctagac caagaagtta ttatctcgaa ctgacactga gccacaaccc aaacaaccca    660

gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata ttcatccctg tagcattgtt    720

cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata aactcagacc caaacattaa    780

tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata ctaatcttag ttaccgctaa    840

caacctattc caactgttca tcgg                                           864

<210>  7

<211>  475

<212>  DNA

<213>Homo sapiens

<400>    1

tccaaagaca accatcattc cccctaaata aattaaaaaa actattaaac ccatataacc    60

tcccccaaaa ttcagaataa taacacaccc gaccacaccg ctaacaatca atactaaacc    120

cccataaata ggagaaggct tagaagaaaa ccccacaaac cccattacta aacccacact    180

caacagaaac aaagcataca tcattattct cgcacggact acaaccacga ccaatgatat    240

gaaaaaccat cgttgtattt caactacaag aacaccaatg accccaatac gcaaaattaa    300

ccccctaata aaattaatta accactcatt catcgacctc cccaccccat ccaacatctc    360

cgcatgatga aacttcggct cactccttgg cgcctgcctg atcctccaaa tcaccacagg    420

actattccta gccatgcact actcaccaga cgcctcaacc gccttttcat  caatc        475

<210>  8

<211>  511

<212>  DNA

<213>Homo sapiens

<400>    1

cgcctacaca attctccgat ccgtccctaa caaactagga ggcgtccttg ccctattact    60

atccatcctc atcctagcaa taatccccat cctccatata tccaaacaac aaagcataat    120

atttcgccca ctaagccaat cactttattg actcctagcc gcagacctcc tcattctaac    180

ctgaatcgga ggacaaccag taagctaccc ttttaccatc attggacaag tagcatccgt    240

actatacttc acaacaatcc taatcctaat accaactatc tccctaattg aaaacaaaat    300

actcaaatgg gcctgtcctt gtagtataaa ctaatacacc agtcttgtaa accggagatg    360

aaaacctttt tccaaggaca aatcagagaa aaagtcttta actccaccat tagcacccaa    420

agctaagatt ctaatttaaa ctattctctg ttctttcatg gggaagcaga tttgggtacc    480

acccaagtat tgactcaccc atcaacaacc g                                   511

<210>  9

<211>  455

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

<400>  1

aactccacca ttagcaccca aagctaagat tctaatttaa actattctct gttctttcat    60

ggggaagcag atttgggtac cacccaagta ttgactcacc catcaacaac cgctatgtat    120

ttcgtacatt actgccagcc accatgaata ttgtacggta ccataaatac ttgaccacct    180

gtagtacata aaaacccaat ccacatcaaa accccctccc catgcttaca agcaagtaca    240

gcaatcaacc ctcaactatc acacatcaac tgcaactcca aagccacccc tcacccacta    300

ggataccaac aaacctaccc acccttaaca gtacatagta cataaagcca tttaccgtac    360

atagcacatt acagtcaaat cccttctcgt ccccatggat gacccccctc agataggggt    420

cccttgacca ccatcctccg tgaaatcaat atccc                               455

Claims (2)

1.一种检测线粒体糖尿病45个基因位点的微阵列芯片，其制备步骤如下：

A、以醛基玻片为载体；

B、设计引物和探针：首先从MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中国期刊网和重庆维普数据库中检索与糖尿病相关的mtDNA突变位点；其次以线粒体基因剑桥碱基序列为参考序列；第三是采用Primer Premier 5.0和NCBI BLAST软件，针对mtDNA 45个突变位点，设计特异性扩增目的DNA序列引物，以及特异性野生型和突变型寡核苷酸探针，探针退火温度为56.7℃～62℃，探针的5′端或3′端加载长臂15T后修饰氨基基团；

C、芯片点阵布控：微阵列芯片为324个样点组成的18行×18列的矩阵，包括监控系统和检测系统，监控系统为：①芯片阴性对照，为探针稀释液，pH 8.0，1×TE缓冲液，布控在有公共野生型探针的位点处，点样矩阵中，mtDNA3200，3205与3206位点公用1条野生型探针，在mtDNA 3200和3205位点的突变型探针点样处下方，点印阴性对照；②芯片阳性对照，为mtDNA 3243和5178两个位点的4条探针按1∶1∶1∶1比例混合的5μM溶液，布控在微阵列芯片的左边3列，共54个阳性对照样点；③芯片平行对照，为各位点的5μM探针溶液平行点印3个点，在矩阵中mtDNA 1888位点的野生型探针和突变型探针各点印3个样点，共6个样点检测1个基因位点；检测系统由mtDNA 45个位点的野生型和突变型寡核苷酸探针布控的样点组成；每条探针采用pH8.0的1×TE缓冲液稀释为5μM溶液，并点印3个平行点，共6个样点检测1个基因位点，45个基因位点从左到右顺序排列；

D、监控系统与检测系统的点阵布控：监控系统与检测系统的点阵布控在同一区域，采用Packard芯片点样仪点印于醛基玻片上；室温保湿固定48～72小时，4℃冰箱保存备用；

所述的特异性野生型和突变型寡核苷酸探针：

所述的目的DNA序列引物：

  引物编号   序列，5′→3′   扩增范围   产物长度   1   F：<u>CTTGACCGCTCTGAGCTAAAC</u>R：<u>TGTTGAGCTTGAACGCTTTC</u>   1657-2216   560bp   2   F：<u>AGCGCCTTCCCCCGTAAATGA</u>R：<u>AGAATGATGGCTAGGGTGACTTC</u>   3160-3755   596bp   3   F：<u>GACGCACTCTCCCCTGAACTCC</u>R：<u>GGATTCTCAGGGATGGGTTCG</u>   4048-4365   318bp   4   F：<u>CCCTTTCACTTCTGAGTCCCAG</u>R：<u>CTTTGAAGGCTCTTGGTCTGTAT</u>   4797-5549   753bp   5   F：<u>CGGTCAATGCTCTGAAATCTGTG</u>R：<u>CATTGTTGGGTGGTGATTAGTCG</u>   8164-8669   506bp   6   F：<u>TGCTAGTAACCACGTTCTCCTG</u>R：<u>CCGATGAACAGTTGGAATAGG</u>   11901-12764   864bp   7   F：<u>TCCAAAGACAACCATCATTCC</u>R：<u>GATTGATGAAAAGGCGGTTGA</u> 14470-14944 475bp   8   F：<u>CGCCTACACAATTCTCCGATC</u>R：<u>CGGTTGTTGATGGGTGAGTC</u>   15574-16084   511bp   9   F：<u>AACTCCACCATTAGCACCC</u>R：<u>GGGATATTGATTTCACGGAG</u>   15973-16427   455bp

                                            。

2.根据权利要求1所述的一种检测线粒体糖尿病45个基因位点的微阵列芯片，其特征在于：所述的微阵列芯片洗涤过程为，室温以2×SSC-0.1％SDS洗涤5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗涤15min×2次，室温下双蒸水洗涤10min，离心甩干。

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