CN102312014A - 检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片及其制作方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,所述固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜。本发明还公开该基因芯片的制作方法,以及包括该基因芯片的试剂盒。本发明的基因芯片可以快速系统地检测与糖尿病相关的基因突变,易于规模化使用;在利用本发明基因芯片检测时,操作简单,易于掌握,省时,成本低;本发明的基因芯片可适应不同层次医院的临床需求,具有很好的应用市场和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片检测领域,具体涉及一种快速检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片及其制作方法,以及包括该基因芯片的试剂盒,适用于低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的复杂代谢性疾病,发病率逐年上升,我国的糖尿病发病人数位居世界第二,其中90%为2型糖尿病(简称T2DM),且发病年龄趋向年轻化。持续高血糖所引发的慢性并发症已成为肾功能衰竭、失明和心脑血管疾病的主要原因,给个人、社会和国家医疗保健带来了沉重的负担,成为全球性的社会卫生和经济问题。由于T2DM具有家族性特征,且不同种族间发病率存在明显差异,另外同卵双生和异卵双生个体发病率和病情也不同,因此遗传成分在该病的发病中起重要作用。因此,通过连锁或关联分析确定糖尿病的易感或致病基因,对于从基因角度阐释糖尿病发病机制有重要意义。
传统的糖尿病易感基因检测方法主要包括:PCR-RFLP、AS-PCR和DNA测序方法等,这些方法在基因突变检测中起了重要作用,但普遍存在着明显的不足,诸如检测基因位点有限、耗时长、操作繁琐等,不适用于大批量、系统检测,给糖尿病的临床诊断带来困难。其中,PCR-RFLP方法是经典的生物学方法,但由于限制性内切酶识别位点有限,难以实现同时检测多个位点,且耗时较长;AS-PCR方法虽能准确检测突变,但要求扩增条件非常优化,且引物要有高度的特异性,否则易出现假限性或假阳性结果;DNA测序虽是目前公认的检测新突变的金标准,但由于其对特殊结构DNA序列无法测序,而且只有异质性水平>25%时才能检出,而临床常用标本外周血白细胞中异质性水平通常都达不到这个标准,因此很易漏检。因此,如何快速、准确地检测糖尿病基因突变是糖尿病临床诊断的主要难题之一。
基因芯片是近年来兴起的一项重要生物技术,越来越多地应用于基因多态性分析和诊断。
随着基因芯片技术的发展,到2007年用全基因组SNP基因芯片进行糖尿病易感基因筛查的研究迅速增多,Diabetes Gene Discovery Group,Finland-US Investigationof NIDDM Genetics(FUSION),deCODE Genetics,DiaGen等研究使用Illumina 100K或Illumina 300KSNP基因芯片,Diabetes Genetics Initiative,Wellcome Trust CaseControl Consortium,Pima,Starr County,Texas,Old Order Amish,Framingham HealthStudy等研究使用Affymetrix 100K或Affymetrix 500K芯片,Japanese multi-diseasecollaborative genome scan使用JSNP Genome Scan 100K SNP芯片,BioBank Japan使用定制的268K SNP芯片。这些研究中或使用昂贵的商品化SNP芯片,或使用数十万个SNP位点,大规模应用其成本过高。目前常用的SNaPshot和Sequenom技术则需要购买昂贵的专门设备。因此,应用这些芯片虽然发现了多个2型糖尿病相关易感基因位点,但这些研究成果未能得到大规模关联分析的检验。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,该基因芯片只需借助常规的实验器具即可进行检测,易规模化应用。基于此,本发明的另一个目的在于提供一种前述基因芯片的制作方法以及包括该基因芯片的试剂盒。
为实现上述目的,本发明的技术方案是:
一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,所述固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜。本技术方案通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选,设计相关探针,经过反复试验筛选和验证,得到了一组杂交特异性高准确度好的探针,其核苷酸序列如SEQ IDNo.1~14所示,这些探针分为野生型探针和突变型探针,对下述SNP位点:INS rs689、JAZF1 rs864745、DCD rs1153188、IGF2BP2 rs1470579、TCF7L2 rs7501939、TSPAN8,LGR5rs7961581以及rs9465871(具体如表1所示)。进而,本发明采用生物软件Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International,CA)和NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.hi.gov/BLAST/)辅助设计和分析所需的引物和探针,使目的片段扩增和杂交反应能在同一条件下进行。本技术方案的基因芯片的固相载体还可以是其他任何不影响核酸杂交,且可稳定连接杂交探针的载体。
优选地,所述基因芯片的点阵布控:膜芯片为96个样点组成的6行×16列的矩阵,包括质控系统和检测系统,其中,质控系统为:
(1)芯片阳性对照,为SEQ ID No.1~14探针的等量混合的25uM溶液,作为设计布控于左上、右上、右下三个角,作为阳性对照样点,共12个阳性对照样点;
(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液点样,各探针平行点4个点,即每4个点检测一个等位基因型,上下共8个点,共同构成一个基因位点检测区;
(3)芯片阴性对照,为5×SSC,共4个阴性对照样点,位于每个基因位点检测区之间。
优选地,探针3’端具有15个多聚T,并经氨基基团修饰。
本发明的一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,包括如下步骤:
1)对硝酸纤维素膜或尼龙膜进行预处理,形成固相载体;
2)用芯片点样仪将稀释好的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针印点到固相载体上,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示。
优选地,步骤1)中的预处理为:将硝酸纤维素膜或尼龙膜浸入灭菌双蒸水中浸泡8min~12min,再浸入5×SSC 24min~34min,而后取出并风干,4℃保存备用。
优选地,探针采用如下方式制备:合成探针,探针在合成时3’端合成15个多聚T,并经氨基基团修饰,而后用20×SSC-Buffer作为稀释液稀释至终浓度为15μM。
优选地,步骤2)具体为:采用478A芯片点样仪将所述用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针点印于处理好的固相载体上,然后用紫外光照射8min,使之交联固定,4℃保存备用。
优选地,探针印点到固相载体后,还包括对固定有探针的固相载体进行洗涤的步骤,具体为:室温下含2×SSC-0.1%SDS洗涤溶液中振动洗涤5min×2次,含0.5×SSC-0.1%SDS洗涤溶液中振动洗涤15min。
本发明的一种试剂盒,包括检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,该基因芯片包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,所述固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
优选地,还包括用于扩增易感基因位点所在区域的引物,引物序列为SEQ IDNo.15~28所示的寡核苷酸,所扩增区域为SEQ ID No.29~35所示。这些引物具有良好的扩增效能,扩增可以在同一个条件下进行。
优选地,还包括以下试剂中的一种或多种:杂交液、封闭液、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl2。
本发明的基因芯片在应用中,7个目的DNA片段的扩增可在同一条件下进行PCR,使获得的目的片段浓度高,足以保证后续杂交反应所需的DNA量,而且又省时并降低了实验成本。
本发明的基因芯片在应用中,每个位点的野生型探针和突变型探针退火温度很相近,在42℃进行杂交反应时可获得满意的杂交效果,根据两种探针杂交信号的强弱,可判断被检测位点是否发生突变。该芯片可系统检测糖尿病相关的易感基因突变位点,并设立了阳性对照、阴性对照和片内平行对照,便于控制和分析实验结果。
本发明还提供采用该基因芯片进行检测糖尿病易感基因突变的方法,该方法包括下列步骤:
1)提取样品DNA;
2)通过PCR扩增样品DNA和标记目的DNA;
3)杂交反应;
4)洗涤,直接读片。
本发明采用定制基因芯片技术,通过自动化基因芯片点样仪将预先合成的探针点样于固相载体(膜)上,构成专门针对2型糖尿病大样本关联分析用的基因芯片,利用本发明的基因芯片对32份外周血样本应用该芯片进行检测,并测序验证芯片检测结果,芯片检测结果与测序结果相符,所以本发明的基因芯片具有高的准确性和重复性。具体来说,与现有技术相比,本发明的基因芯片具有如下优点:
1、可以快速系统地检测与糖尿病相关的基因突变;
2、检测时,操作简单,易于掌握,省时,成本低;
3、可适应不同层次医院的临床需求,具有很好的应用市场和经济效益。
本发明的基因芯片可快速检测2型糖尿病易感基因7个位点突变,相对于目前常用的SNaPshot和Sequenom技术,利用该基因芯片的检测方法不需要特殊的昂贵仪器,实验室常规的荧光显微镜即可进行检测。该芯片适用于大样本低成本2型糖尿病易感基因关联分析。
应用本发明的基因芯片,实验流程简单、成本低。所需引物可在同一退火温度进行PCR反应,扩增同时完成生物素标记,经过1次杂交反应,即可检测7个基因位点。检测结果准确、快速、效率高,膜芯片可满足不同层次医院的要求,可用于2型糖尿病易感基因关联分析。
附图说明
图1为2型糖尿病易感基因7个位点突变位点检测微阵列芯片点样矩阵图,
其中,●为阳性对照;○为阴性对照;◎为突变型探针;⊙为野生型探针;
图2为生物素标记7个突变位点检测微阵列膜芯片检测结果图;
图3为测序验证芯片检测结果所得的测序峰图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合实施例对本发明作进一步的描述,但本发明要求保护的范围并不局限于实施例所述的范围。
实施例一
本实施例中的基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,该探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,固相载体为硝酸纤维素膜。
其中,探针和引物设计如下:
通过对2型糖尿病易感基因位点突变进行筛选,设计相关探针,经过反复试验筛选和验证,得到了一组杂交特异性高、准确度好的探针,探针序列如表1所示。
表1 7个位点野生型和突变型探针序列
探针在合成时3’端合成15个多聚T,并经氨基基团修饰。
基因芯片点阵布控:膜芯片为96个样点组成的6行×16列的矩阵,包括质控系统和检测系统,其中,质控系统为:
(1)芯片阳性对照,为SEQ ID No.1~14探针的等量混合的25uM溶液,作为设计布控于左上、右上、右下三个角,作为阳性对照样点,共12个阳性对照样点;
(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液点样,各探针平行点4个点,即每4个点检测一个等位基因型,上下共8个点,共同构成一个基因位点检测区;
(3)芯片阴性对照,为5×SSC,共4个阴性对照样点,位于每个基因位点检测区之间。
同时根据相关SNP位点设计引物,经过反复筛选和验证,得到一组用于扩增包含突变位点目的片段的特异引物(表2)。这些引物扩增获得的片段长度集中在300~450bp左右,长度适中。并且这些引物可在同一反应条件下完成PCR扩增反应,所得到的混合产物能很好地满足杂交的需要,为芯片杂交节省了时间并降低了成本。
表2 涵盖2型糖尿病易感基因7个位点突变目的片段特异性扩增引物
本实施例中基因芯片采用如下方法制备:
1)对硝酸纤维素膜进行预处理,具体为:将硝酸纤维素膜放入ddH2O浸泡5min,浸入5×SSC Buffer 15min,取出,风干;
2)将用20×SSC-Buffer稀释的终浓度为15μM的探针溶液按点样矩阵排列在384孔板,用芯片点样仪点印,如图1所示;紫外线照射8min交联固定。
其中,20×SSC-Buffer由8.766g氯化钠、4.412g柠檬酸钠、双蒸水定容至50ml,再用氢氧化钠调pH至7.5制成。
实施例二
本实施例中的基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,该探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,固相载体为尼龙膜。本实施例中的探针及引物设计如实施例一,此处不再赘述。
本实施例中基因芯片采用如下方法制备:
1)对硝酸纤维素膜进行预处理,具体为:将硝酸纤维素膜放入ddH2O浸泡10min,浸入5×SSC Buffer 30min,取出,风干;
2)将用20×SSC-Buffer稀释的终浓度为15μM的探针溶液按点样矩阵排列在384孔板,用芯片点样仪点印,如图1所示;紫外线照射8min交联固定。
其中,20×SSC-Buffer由8.766g氯化钠、4.412g柠檬酸钠、双蒸水定容至50ml,再用氢氧化钠调pH至7.5制成。
实施例三
本实施例中的基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡该苷酸探针,该探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,固相载体为尼龙膜。本实施例中的探针及引物设计如实施例一,此处不再赘述。
本实施例中基因芯片采用如下方法制备:
1)对硝酸纤维素膜进行预处理,具体为:将硝酸纤维素膜放入ddH2O浸泡12min,浸入5×SSC Buffer 32min,取出,风干;
2)将用20×SSC-Buffer稀释的终浓度为15μM的探针溶液按点样矩阵排列在384孔板,用芯片点样仪点印,如图1所示;紫外线照射8min交联固定。
其中,20×SSC-Buffer由8.766g氯化钠、4.412g柠檬酸钠、双蒸水定容至50ml,再用氢氧化钠调pH至7.5制成。
采用本发明基因芯片检测易感基因位点的检测方法,具体包括如下步骤:
1、样品DNA提取
获取外周血DNA,利用血液基因组DNA提取试剂盒(血液基因组提取试剂盒DP318-02,TIANGEN),按厂商说明书操作,提取基因组DNA。
2、目的DNA扩增,杂交,检测:
PCR反应液是由10×buffer、10μmol/L的正向引物、10μmol/L反向引物、25mmol/L MgCl2、10mmol/LdNTPs(含0.5nM Biotin-dUTP,Fermentas)和无菌双蒸水组成。
扩增条件为:95℃预变性3min,35个循环(94℃变性45s,55℃退火35s,72℃延伸45s),72℃延伸7min;
变性;
预杂交30min封闭非特异性结合;生物素标记的目的DNA与杂交液(ChurchBuffer:1mM EDTApH8.0,1%BSA,7%SDS,0.5M phosphate buffer,100ug/ml鲑鱼精DNA)按1∶10混匀,42℃杂交2h;
室温下分别以2×SSC-0.1%SDS,0.5×SSC-0.1%SDS,0.5×SSC洗涤2次,马来酸buffer-0.3%Tween20洗脱3min,1×封闭液封闭30min,浸入含0.025%的avidin-AP的1×封闭液(封闭液:6%酪蛋白,1%PVP,10mMEDTA,溶解于PBS)中反应30min,洗脱液洗15min,检测液平衡3min,在含2%的NBT/BCIP的检测液中避光显色。待阳性对照的颜色深度达到要求时,以超纯水冲洗膜芯片终止反应;根据蓝紫色信号强弱判读结果,若野生型探针的杂交信号远远强于突变型探针,则为野生型;若突变型探针的杂交信号远远强于野生型探针,则为突变型;若两者信号强度比较接近,则疑为异质型,需测序验证。检测结果参见图2。
3、检测结果的测序验证
对于检测结果,同时做一份普通PCR,用于测序验证。比较测序和膜芯片检测结果,两者结果相符。结果参见图3。
以上对本发明进行了详细介绍,文中应用具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (11)
1.一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,其特征在于,包括固相载体、固定在固相载体上的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示,所述固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
2.如权利要求1所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,其特征在于,所述基因芯片的点阵布控:膜芯片为96个样点组成的6行×16列的矩阵,包括质控系统和检测系统,其中,质控系统为:
(1)芯片阳性对照,为SEQ ID No.1~14探针的等量混合的25uM溶液,作为设计布控于左上、右上、右下三个角,作为阳性对照样点,共12个阳性对照样点;
(2)芯片平行对照,采用25uM的探针溶液点样,各探针平行点4个点,即每4个点检测一个等位基因型,上下共8个点,共同构成一个基因位点检测区;
(3)芯片阴性对照,为5×SSC,共4个阴性对照样点,位于每个基因位点检测区之间。
3.如权利要求1所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片,其特征在于,探针3’端具有15个多聚T,并经氨基基团修饰。
4.一种检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)对硝酸纤维素膜或尼龙膜进行预处理,形成固相载体;
2)用芯片点样仪将稀释好的用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针印点到固相载体上,探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1~14所示。
5.如权利要求4所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,其特征在于,步骤1)中的预处理为:将硝酸纤维素膜或尼龙膜浸入灭菌双蒸水中浸泡8min~12min,再浸入5×SSC 24min~34min,而后取出并风干,4℃保存备用。
6.如权利要求4所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,其特征在于,探针采用如下方式制备:合成探针,探针在合成时3’端合成15个多聚T,并经氨基基团修饰,而后用20×SSC-Buffer作为稀释液稀释至终浓度为15μM。
7.如权利要求4所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,其特征在于,步骤2)具体为:采用478A芯片点样仪将所述用于检测2型糖尿病易感基因的特异性寡核苷酸探针点印于处理好的固相载体上,然后用紫外光照射8min,使之交联固定,4℃保存备用。
8.如权利要求4所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片的制作方法,其特征在于,探针印点到固相载体后,还包括对固定有探针的固相载体进行洗涤的步骤,具体为:室温下含2×SSC-0.1%SDS洗涤溶液中振动洗涤5min×2次,含0.5×SSC-0.1%SDS洗涤溶液中振动洗涤15min。
9.一种试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1~3任一项所述的检测2型糖尿病易感基因7个位点突变的基因芯片。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,还包括用于扩增易感基因位点所在区域的引物,引物序列为SEQ ID No.15~28所示的寡核苷酸,所扩增区域为SEQID No.29~35所示。
11.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,还包括以下试剂中的一种或多种:杂交液、封闭液、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、MgCl2。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120111 |