CN104152570B - 一种基底细胞癌易感基因snp多态性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有两种针对Mn‑SOD基因的探针、四种针对P53基因的探针和四种针对SMO基因的探针，以及两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与基底细胞癌易感基因SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑12所示。本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，也能够实现低通量的检测，灵活性高，对于有些医院样本不多的情况下可操作性强，且设备投入少，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种基底细胞癌易感基因SNP多态性检测技术，属于分子生物学基因芯片技术领域，具体属于体外诊断试剂领域中SNP多态性检测方法，根据检测结果从基因水平评估皮肤基底细胞癌发病的风险等级，并作为预防和治疗皮肤基底细胞癌的方向指导。
背景技术
基底细胞癌(basal cell carcinima,BCC)又称为基底细胞上皮瘤(basal cellepithelioma),由Kropecher于1903年首次报告,是最常见的皮肤恶性肿瘤之一。其常发生于皮肤曝光区,特别是面部,发生于躯干的约占10％。研究发现紫外线照射、人类乳头瘤病毒感染、基因突变等因素与其发病密切相关。基底细胞癌患者，较易出现区域淋巴结转移，近年来围绕基底细胞癌的研究越来越受到重视。
有关基因突变与基底细胞癌之间的关系研究报道很多，目前MnSOD、P53、SMO等基因的遗传易感性与基底细胞癌有密切的关系。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种强氧化性、清除自由基金属离子的蛋白质。Shimoda Matsubayashi等(Shimoda-Matsubayashi S et al,1996.Methodsin Molecular Biology,Volume 554,2009,pp 233-249)报告，编码锰超氧化物歧化酶(MnSOD)信号肽的基因序列(又称为线粒体靶向序列，MTS)存在遗传多态性，即的-9位密码子存在GTT(缬氨酸，V)和GCT(丙氨酸，A)的互换。该遗传多态性会影响MnSOD的功能而与皮肤癌发生相关。
P53是一抑癌基因,其基因产物是一种核酸蛋白,野生型P53为细胞生长分化的调节因子,控制着细胞由G1期进入S期的通道。现已证明BCC存在P53突变,突变率约为50％～100％，国外研究证实，日光中的紫外线为导致白种人皮肤癌的主要原因之一,而过量紫外线照射引起的P53突变系其中的重要环节。紫外线过量照射,导致表皮角质形成细胞DNA损伤，P53发生突变,丧失其抑癌功能,并参与抑制细胞凋亡的过程,提示P53突变与BCC的发生、发展有关。研究发现P53基因rs78378222和rs1042522多态性位点影响P53基因的转录激活功能、对细胞周期的阻滞作用等，引起细胞无限制的增殖，最终导致皮肤基底细胞癌的发生。
SMO基因是Hedgehog信号转导网络系统中的一个成分,该网络系统在决定胚胎诱导模式和胚胎发育时各结构细胞命运中发挥重要作用。研究表明，SMO基因rs121918348和rs121918347多态性与一些散发性的基底细胞癌的发生有关。
综上所述，鉴于Mn-SOD、P53、SMO 3个基因与基底细胞癌的发生有着重要的关联关系，因此，可以将这些基因做为预测和筛查皮肤基底细胞癌的潜在指标，通过对这些易感基因多态性的检测，能在预防和治疗基底细胞癌以及降低疾病的发生率方面起到重要的作用。
目前有关SNP多态性的检测方法主要是测序法，虽然测序法是基因检测的“金标准”，但是测序法检测周期长，对于被检测者来说，他们是希望越快拿到检测结果越好，所以测序法不利于临床上开展基底细胞癌相关基因的检测。而且测序法成本相对还高，对患者和相关检测机构来说，成本都很高，这进一步限制其在临床上的应用。因此，需要一种既方便又经济的检测方法就迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一种基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，解决了现有技术中的不足，本发明可以方便灵活地对单个或多个样本进行检测。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有两种针对Mn-SOD基因的探针、四种针对P53基因的探针和四种针对SMO基因的探针，以及两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与基底细胞癌易感基因SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列分别为：
针对Mn-SOD基因rs4880C位点的探针T1：5’-GCTCCGGCTTTGGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；
针对Mn-SOD基因rs4880T位点的探针T2：5’-AGCTGGCTCCGGTTT-3’，如SEQ ID NO：2所示；
针对P53基因rs78378222A位点的探针T3：5’-ATTTTACAATAAAACTTTGC-3’，如SEQID NO：3所示；
针对P53基因rs78378222C位点的探针T4：5’-TTATTTTACAATACAACTTTG-3’，如SEQID NO：4所示；
针对P53基因rs1042522C位点的探针T5：5’-TGCTCCCCCCGTG-3’，如SEQ ID NO：5所示；
针对P53基因rs1042522G位点的探针T6：5’-TGCTCCCCGCGTG-3’，如SEQ ID NO：6所示；
针对SMO基因rs121918348A位点的探针T7：5’-CCAAAGCAGATCAAGAAG-3’，如SEQ IDNO：7所示；
针对SMO基因rs121918348G位点的探针T8：5’-CAAAGCGGATCAAGAAG-3’，如SEQ IDNO：8所示；
针对SMO基因rs121918347T位点的探针T9：5’-CATGAGCACCTTGGTCT-3’，如SEQ IDNO：9所示；
针对SMO基因rs121918347G位点的探针T10：5’-ATGAGCACCTGGGTCT-3’，如SEQ IDNO：10所示；
针对人类基因组设计的阳性质控探针T11：5’-TTGAACAGGTGGAGGC-3’，如SEQ IDNO：11所示；
针对人类基因组设计的阴性质控探针T12：5’-TGGCCAGCGTGGACAAC-3’，如SEQ IDNO：12所示；
上述探针均进行5’端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5-20uM。
所述的基质载体上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示：
5’-TTCGGTTGGGCTTTAC-3’，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下：
针对rs4880位点的上游引物M1：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTAGTGTGCGGGTGAGAAG-3’，如SEQ ID NO：14所示；
针对rs4880位点的下游引物M2：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCTGGTGCTTGCTGTGGTG-3’，如SEQ ID NO：15所示；
针对rs78378222位点的上游引物M3：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTTTCACCCCACCCTTCCC-3’，如SEQ ID NO：16所示；
针对rs78378222位点的下游引物M4：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCACCTGCTGACCCCAGTAGC-3’，如SEQ ID NO：17所示；
针对rs1042522位点的上游引物M5：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACT TGGTAAGGACAAGGGTTGG-3’，如SEQ ID NO：18所示；
针对rs1042522位点的下游引物M6：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCCCAAAGGGTGAAGAGGAATC-3’，如SEQ ID NO：19所示；
针对rs121918348位点的上游引物M7：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTAGAGCGGAGTGATTGGAGG-3’，如SEQ ID NO：20所示；
针对rs121918348位点的下游引物M8：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCTCGTGCCGCTTAGAGAAGG-3’，如SEQ ID NO：21所示；
针对rs121918347位点的上游引物M9：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTACCTGTCTACGTTCCCTC-3’，如SEQ ID NO：22所示；
针对rs121918347位点的下游引物M10：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCAGGTACGCCTCCAGATG-3’，如SEQ ID NO：23所示。
所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下：
通用上游引物M11：5’-GGAGGACTGCTCACGAACT-3’，如SEQ ID NO：24所示；
通用下游引物M12：5’-GGGACACGCAGTCGACATC-3’，如SEQ ID NO：25所示；
所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
所述的基质载体为玻片或尼龙膜。
本发明同时还提供了基底细胞癌易感基因SNP多态性检测的方法，该方法包括以下步骤：
A.设计相关基因分型的引物和探针，所述探针如T1-T12及CC所示，所述引物包括M11-M12；
B.用活性氨基标记步骤A中的探针5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测的膜条，对所述下游通用引物M8的5’端进行生物素标记，对显色探针5’端进行氨基标记，并对其3’端进行生物素标记；
C.利用步骤A所述引物进行人类基因组的PCR扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶和四甲基联苯胺显色；
D.采用扫描仪进行杂交信号的扫描或是肉眼直接观察，然后判断分型结果。
本发明提供的技术方案与现有技术相比有以下优点：
(1)本发明的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，也能够实现低通量的检测，灵活性高，对于有些医院临床样本不多的情况下可操作性强，且设备投入少，成本低廉。
(2)本发明对样本的要求很低，可以是抗凝血，也可以是无创采样的唾液等。
(3)本发明的试剂盒由于采用通用引物进行PCR扩增，扩增条件一致的情况下，还只使用了一个生物素标记的通用引物，大大节省了试剂成本，相比市面上的一些试剂成本更低廉。
(4)本发明的一个特点是试剂盒中有阳性质控、阴性质控以及显色反应质控，阳性质控可以监控DNA提取的质量，PCR反应的过程等，阴性质控可以监控PCR过程中的污染等情况，显色反应点可以监控杂交过程是否正确与否，这些质控的加入，大大增加了结果的可靠性和准确性。
附图说明
图1为本发明所提供的试剂盒中基质载体上各探针位置示意图；
图2为本发明实施例中进行PCR扩增的循环参数图；
图3本发明实施例中膜条杂交结果显色扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
本实施例提供的基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有两种针对Mn-SOD基因的探针、四种针对P53基因的探针和四种针对SMO基因的探针，以及两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与基底细胞癌易感基因SNP位点杂交的寡核苷酸序列，基质载体上各探针位置如图1所示。所述的基质载体可以是玻片、尼龙膜或是其他可以固定探针的载，本实施例中为尼龙膜。
上述探针中，针对Mn-SOD基因rs4880C位点的探针T1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；针对Mn-SOD基因rs4880T位点的探针T2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；针对P53基因rs78378222A位点的探针T3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；针对P53基因rs78378222C位点的探针T4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；针对P53基因rs1042522C位点的探针T5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；针对P53基因rs1042522G位点的探针T6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；针对SMO基因rs121918348A位点的探针T7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；针对SMO基因rs121918348G位点的探针T8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；针对SMO基因rs121918347T位点的探针T9的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；针对SMO基因rs121918347G位点的探针T10的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；针对人类基因组设计的阳性质控探针T11的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；针对人类基因组设计的阴性质控探针T12的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；上述探针均进行5’端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5-20uM。
本发明中将高灵敏度的多重聚合酶链反应(PCR)技术和反向点杂交技术进行了结合，从而得到一种全新的基因及基因突变检测技术。本发明中将特异的探针分别固定到固相载体上，再将经PCR特异性扩增的产物(在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，通过酶联反应及显色，肉眼就能判断出基因分型的结果，更适用于临床检测的需要。本发明针对rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的核苷酸序列，设计一套特异性的探针，采用合适的浓度，按照图1所示位置，将相应探针印制在尼龙膜相应区域上，根据显色位点的不同，来判断各位点的基因型别。
所述的尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。所述的显色控制探针CC的引入可对显色过程进行有效的质量控制。
所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下：针对rs4880位点的上游引物M1的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；针对rs4880位点的下游引物M2的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；针对rs78378222位点的上游引物M3的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；针对rs78378222位点的下游引物M4的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；针对rs1042522位点的上游引物M5的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；针对rs1042522位点的下游引物M6的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；针对rs121918348位点的上游引物M7的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；针对rs121918348位点的下游引物M8的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；针对rs121918347位点的上游引物M9的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；针对rs121918347位点的下游引物M10的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下：通用上游引物M11的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；通用下游引物M12的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
在实际检测时，将提取好的基因组DNA加入到PCR反应液中，采用多重PCR反应，扩增出带有生物素标记的目的基因片段，取DNA杂交膜条和45ulPCR产物进行杂交显色反应，杂交温度设定为45℃，杂交时间为60分钟，然后洗涤，再显色，肉眼判断显色结果。
本实施中例提供的上述试剂盒进行基底细胞癌易感基因SNP多态性检测的方法如下：
取50例样本，采用本发明的试剂盒进行检测，同时用测序法进行对比实验。
a.样本DNA的提取。临床样本可以是EDTA-抗凝血，也可以是唾液样本，方便灵活多样，采用市面上相应的试剂盒进行提取DNA。取5ulDNA加入到试剂盒中的PCR反应液中，
b.按图2中所述的程序进行PCR扩增。
c.采用本发明的DNA杂交膜条，对以上PCR产物进行杂交检测。首先将PCR产物进行预变性，95℃，5min，然后立即置于冰水混合物上预冷。
d.杂交：
取5mL离心管，放入标记膜条1张，标记好对应的检测样本编号，加2ml杂交缓冲液液、对应的PCR产物40ul，盖紧管盖，放入振荡水槽(或空气浴摇床)，45℃下轻摇(约100转/分)40分钟。同时预热洗膜缓冲液。
e.偶联：
杂交结束后，将膜条从杂交管里取出，放入50mL离心管中(最多可在同一管里处理10张膜片)；
加预热洗膜缓冲液20ml，POD液10ul，混匀，使膜条充分展开。45℃轻摇(40～50转/分)10分钟，弃去液体；
加预热洗膜缓冲液40ml，45℃轻摇3分钟，弃去液体；重复1次；
加显色缓冲液40ml，室温轻摇3分钟，弃去液体。
f.显色：
取50ml离心管，加显色缓冲液20ml，TMB 1ml，H2O2 10ul，混匀即为显色液。
放入膜条后水平混匀，使膜条充分展开后在室温避光静置8分钟，弃去液体。
加显色缓冲液40ml，轻摇3分钟，弃去液体。取出杂交膜条，显色完成。
g.结果分析:
用吸水纸吸去膜条表面水分，在扫描仪上尽快扫描。显色反应控制点(CC)显色正常，表示偶联和显色过程正常，否则需要重新检查杂交过程。
图3为本实施例中膜条杂交结果显色扫描图，参照分型结果进行分析和统计。与测序结果进行对比发现，一致性为100％。
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势，一次可做任意数量的样本，检测的准确性和可靠性都很高，检测结果与测序结果完全相符。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，其特征在于：所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有两种针对Mn-SOD基因的探针、四种针对P53基因的探针和四种针对SMO基因的探针，以及两种针对人类基因组设计的探针，所述的两种针对Mn-SOD基因的探针、四种针对P53基因的探针和四种针对SMO基因的探针均为能够与基底细胞癌易感基因SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列分别为：
针对Mn-SOD基因rs4880C位点的探针T1：5’-GCTCCGGCTTTGGT-3’；
针对Mn-SOD基因rs4880T位点的探针T2：5’-AGCTGGCTCCGGTTT-3’；
针对P53基因rs78378222A位点的探针T3：5’-ATTTTACAATAAAACTTTGC-3’；
针对P53基因rs78378222C位点的探针T4：5’-TTATTTTACAATACAACTTTG-3’；
针对P53基因rs1042522C位点的探针T5：5’-TGCTCCCCCCGTG-3’；
针对P53基因rs1042522G位点的探针T6：5’-TGCTCCCCGCGTG-3’；
针对SMO基因rs121918348A位点的探针T7：5’-CCAAAGCAGATCAAGAAG-3’；
针对SMO基因rs121918348G位点的探针T8：5’-CAAAGCGGATCAAGAAG-3’；
针对SMO基因rs121918347T位点的探针T9：5’-CATGAGCACCTTGGTCT-3’；
针对SMO基因rs121918347G位点的探针T10：5’-ATGAGCACCTGGGTCT-3’；
针对人类基因组设计的阳性质控探针T11：5’-TTGAACAGGTGGAGGC-3’；
针对人类基因组设计的阴性质控探针T12：5’-TGGCCAGCGTGGACAAC-3’；
上述探针均进行5’端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5-20uM；
所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下：
针对rs4880位点的上游引物M1：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTAGTGTGCGGGTGAGAAG-3’；
针对rs4880位点的下游引物M2：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCTGGTGCTTGCTGTGGTG-3’；
针对rs78378222位点的上游引物M3：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTTTCACCCCACCCTTCCC-3’；
针对rs78378222位点的下游引物M4：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCACCTGCTGACCCCAGTAGC-3’；
针对rs1042522位点的上游引物M5：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACT TGGTAAGGACAAGGGTTGG-3’；
针对rs1042522位点的下游引物M6：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCCCAAAGGGTGAAGAGGAATC-3’；
针对rs121918348位点的上游引物M7：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTAGAGCGGAGTGATTGGAGG-3’；
针对rs121918348位点的下游引物M8：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCTCGTGCCGCTTAGAGAAGG-3’；
针对rs121918347位点的上游引物M9：
5’-GGAGGACTGCTCACGAACTACCTGTCTACGTTCCCTC-3’；
针对rs121918347位点的下游引物M10：
5’-GGGACACGCAGTCGACATCAGGTACGCCTCCAGATG-3’。
2.根据权利要求1所述的基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，其特征在于：所述的基质载体上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如下所示：
5’-TTCGGTTGGGCTTTAC-3’，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
3.根据权利要求1所述的基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液中含有扩增包含rs4880、rs78378222、rs1042522、rs121918348、rs121918347位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下：
通用上游引物M11：5’-GGAGGACTGCTCACGAACT-3’；
通用下游引物M12：5’-GGGACACGCAGTCGACATC-3’；
所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
4.根据权利要求1所述的基底细胞癌易感基因SNP多态性检测试剂盒，其特征在于：所述的基质载体为玻片或尼龙膜。
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