CN101003836B

CN101003836B - 引物的设计方法、目标核酸的检测方法、单碱基突变的检测方法以及检测试剂盒

Info

Publication number: CN101003836B
Application number: CN2007100040047A
Authority: CN
Inventors: 中村奈绪子; 伊藤桂子
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Canon Medical Systems Corp
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2027-01-19
Also published as: CN101003836A; US20090117544A1; EP1837408A1; JP4580875B2; US7803544B2; JP2007189983A; US7951541B2; US20110021379A1

Abstract

本发明的目的在于提供用于改善LAMP扩增产物和探针的杂交效率以得到能够更加精确地进行检测的LAMP扩增产物的LAMP引物的设计方法。本发明提供的引物设计方法为通过使利用多个引物将目标核酸扩增的扩增产物与探针核酸杂交而进行检测的方法，其特征在于，相对于目标核酸，从其5’末端侧开始依次规定F3区域、F2区域和F1区域，并从其3’末端侧开始依次规定B3c区域、B2c区域和B1c区域，进而在从上述F2区域至F1区域的部分上规定FP区域和/或在从上述B2c区域至B1c区域的部分上规定BPc区域，按照上述FP区域和上述F2区域和/或上述BPc区域和上述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基的方式对各区域进行规定来设计引物。

Description

引物的设计方法、目标核酸的检测方法、单碱基突变的检测方法以及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及目标核酸的检测方法，具体地说，涉及用于扩增目标核酸的引物的设计方法、目标核酸的检测方法、单碱基突变的检测方法以及检测试剂盒。

背景技术

为了检测带有特定核酸序列的核酸链，通常已知有使用与检测对象互补的核酸引物进行扩增、利用电泳确认有无扩增的方法和使用与成为该扩增产物中的检测对象的序列相互补的探针进行检测的方法。该使用探针的检测方法具有可以改变扩增产物的特异性并进行确认的优点。

作为基因的扩增技术，通常已知有PCR(聚合酶链反应)法(例如非专利文献1)，但该方法存在以下问题：需要复杂的温度控制装置、对于多个碱基不同的模板难以进行特异的扩增反应等。

作为不需要这种复杂的温度控制的基因扩增方法，开发出了LAMP(环介导等温扩增)法(参照专利文献1)。LAMP法是在60～65℃的等温条件下扩增特定的基因区域的技术。LAMP法使用内侧引物对、外侧引物对、进而任意添加有环(loop)引物对(专利文献2)的多个引物与链置换型的聚合酶以及作为基质的核苷酸来扩增特定的基因区域。LAMP法与PCR法相比不仅最终产物的量多，而且操作简单、快速、廉价，因此可期待今后在广阔的领域中有所应用。

利用探针核酸检测PCR产物时，由于PCR产物的结构为双链状态，因此互补链成为探针的竞争物，存在杂交效率降低的问题。作为解决该问题的方法，发明了以下方法：添加结合在目标核酸的链除去与探针互补序列部位的部分上的核酸，从而防止待检测的核酸的自身杂交(例如专利文献3)，但并不能得到充分的灵敏度。另外，还开发了将双链的检测核酸中的互补链侧分解或分离的方法，但无论哪种方法都存在着需要使用酶、磁珠等而导致价格昂贵、操作复杂的问题。

另一方面，由于LAMP产物在产物中具有单链环区域，因此如果按照该区域与探针相结合进行设计，则不用经过将待检测的核酸制成单链的工序即可与探针高效地杂交。作为利用该单链环区域、检测LAMP扩增产物的方法，有对杂交在单链环区域的探针进行荧光标记并测定荧光偏光度的方法(专利文献4)；将杂交在单链环区域的引物的5’末端固定在固定化载体上并观察凝集反应的方法(专利文献5)；将杂交在单链环区域的探针固定在固相上并通过荧光或电化学原理检测探针与LAMP扩增产物的杂交的方法(专利文献6)。

专利文献1：日本专利第3313358号说明书

专利文献2：国际公开第02/024902号小册子

专利文献3：日本特开平6-70799号公报

专利文献4：日本特开2002-272475号公报

专利文献5：日本特开2002-345499号公报

专利文献6：日本特开2005-143492号公报

非专利文献1：Science，230，p.1350-1354，1985

发明内容

如上所述，作为检测LAMP扩增产物的方法，公开了使探针杂交在其单链区域上进行检测的技术(例如参照专利文献4、5)。但是，对于利用了该杂交反应的检测技术，还有复杂结构上的问题，不明确的方面很多，迫切希望能够确立利用探针来检测通过LAMP法扩增的目标基因产物的技术。本发明鉴于上述事实而完成，其目的在于提供用于改善LAMP扩增产物和探针的杂交效率以获得能够以更高精度进行检测的LAMP扩增产物的LAMP引物的设计方法。

本发明人等为了解决上述课题进行了深入地研究，结果发现用于LAMP产物扩增的引物是阻碍杂交反应、降低反应效率的一个原因，进而完成了本发明。

即，通过本发明提供一种引物的设计方法，该方法为在通过使利用多个引物将目标核酸扩增而得到的扩增产物与探针核酸杂交而进行检测的方法中使用的上述引物的设计方法，其特征在于，上述目标核酸从5’末端侧开始依次具有F3区域、F2区域和F1区域，并从3’末端侧开始依次具有B3c区域、B2c区域和B1c区域，进而在从上述F2区域至F1区域的部分上具有FP区域和/或在从上述B2c区域至B1c区域的部分上具有BPc区域，上述探针核酸是具有与选自上述FP区域的序列、上述BPc区域的序列以及与它们的互补序列中的序列相互补的碱基序列的大于等于一种的探针，当上述多个引物为在3’末端侧具有与上述F2区域相同序列且在5’末端侧具有与上述F1区域互补序列的FIP引物、具有与上述F3区域相同序列的F3引物、在3’末端侧具有与上述B2c区域互补序列且在5’末端侧具有与上述B1c区域相同序列的BIP引物以及具有与上述B3c区域互补序列的B3引物时，按照上述FP区域和上述F2区域、和/或上述BPc区域和上述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基的方式对各区域进行规定来设计引物。

另外，从本发明的另一侧面出发，提供一种引物的设计方法，该方法为在通过使用多个引物使含有单碱基突变的目标核酸扩增、并使该扩增产物与探针核酸杂交而检测该单碱基突变的方法中使用的上述引物的设计方法，其特征在于，上述目标核酸从5’末端侧开始依次具有F3区域、F2区域和F1区域，并从3’末端侧开始依次具有B3c区域、B2c区域和B1c区域，进而在从上述F2区域至F1区域的部分上具有含有上述单碱基突变的FP区域和/或在从上述B2c区域至B1c区域的部分上具有含有上述单碱基突变的BPc区域，上述探针核酸是具有与选自上述FP区域的序列、上述BPc区域的序列以及它们的互补序列中的序列相互补的碱基序列的大于等于一种的探针，当上述多个引物为在3’末端侧具有与上述F2区域相同序列且在5’末端侧具有与上述F1区域互补序列的FIP引物、具有与上述F3区域相同序列的F3引物、在3’末端侧具有与上述B2c区域互补序列且在5’末端侧具有与上述B1c区域相同序列的BIP引物以及具有与上述B3c区域互补序列的B3引物时，按照上述F2区域不与上述FP区域中的单碱基突变重复的方式、和/或上述B2c区域不与上述BPc区域中的单碱基突变重复的方式进行规定来设计引物。

从本发明的另一侧面出发，还提供通过使利用了按照上述设计方法设计的引物的LAMP扩增产物与探针核酸杂交进行检测，从而检测目标核酸或其单碱基突变的方法。从本发明的另一侧面出发，还提供用于使用按照上述方法设计的引物来扩增目标核酸的检测试剂盒。

根据本发明，可以得到杂交效率高的LAMP扩增产物，能够精度良好地检测LAMP扩增核酸。由此，能够简单且以高精度检测目标核酸。

附图说明

图1为目标核酸上的各区域的配置图。

图2为目标核酸上的检测区域的配置图。

图3为目标核酸上的环引物区域的配置图。

图4为表示LAMP法的扩增中间产物和引物的退火位置。

图5为形成在LAMP物中的4种单链环区域部分的示意图。

图6为F2区域和FP区域重复时的示意图。

图7为LF区域和FP区域重复时的示意图。

图8为表示当内侧引物、环引物成为对探针核酸的阻碍因素时的各序列的相关关系的一览图。

图9为表示目标核酸的各区域的设计模式的图。

图10为表示检测单碱基突变时各区域的设计模式的图。

图11为表示MTHFR基因序列的区域设定的图。

图12为由内侧引物产生的假阳性信号检测结果。

图13为表示MTHFR基因序列的区域设定的图。

图14为由环引物产生的假阳性信号检测结果。

图15为表示在实施例2中添加的引物种类与LAMP扩增效率和电流检测结果的一览图。

图16为表示环引物阻碍探针核酸和检测序列的杂交的结果。

图17为表示在实施例3中添加的引物种类与LAMP扩增效率和电流检测结果的一览图。

图18为表示NAT2基因序列的区域设定的图。

图19为在单碱基突变部位上设计环引物时的LAMP扩增结果。

图20为表示在实施例4中添加的引物种类与LAMP扩增效率和电流检测结果的一览图。

具体实施方式

以下详细地说明本发明。本说明书中，将待检测的核酸称为目标核酸，将其碱基序列称为目标序列。另外，将供于本发明的检测方法、可含有目标核酸的溶液称为试样溶液。

本发明通过使利用LAMP法得到的扩增产物与探针核酸杂交来进行检测，将在与探针核酸的杂交中使用的该扩增产物中的序列称为检测序列。因此，探针核酸具有与该检测序列相互补的序列。

所谓的LAMP法是指使用多个引物和链置换型DNA聚合酶将试样中含有的目标核酸进行扩增的方法。扩增产物的检测方法有各种方法，但本发明如上所述涉及的是使用探针核酸进行检测的方法。以下，说明LAMP法的大致内容。

如图1所示，在LAMP法中，对于目标核酸而言，从其5’末端侧开始依次规定F3区域、F2区域和F1区域，并从其3’末端侧开始依次规定B3c区域、B2c区域和B1c区域。进而，如图2所示，在使扩增产物与探针核酸杂交进行检测的本发明方法中，在从上述F2区域至F1区域的部分上规定FP区域、在从上述B2c区域至B1c区域的部分上规定BPc区域。该FP区域、BPc区域以及成为其互补链的区域为用于与探针核酸杂交的检测区域，其碱基序列为检测序列。在利用与探针核酸的杂交进行的检测中使用的序列可以使用FP区域的序列、BPc区域的序列以及它们的互补序列中的任何一种，还可以同时使用多种。因此，按照探针核酸的序列具有与在上述序列中用于检测的序列相互补的序列的方式来准备。

另外，这里，将F3区域、F2区域和F1区域的互补链分别称为F3c区域、F2c区域和F1c区域，将B3c区域、B2c区域和B1c区域的互补链分别称为B3区域、B2区域和B1区域。同样，将FP区域和BPc区域的互补链分别称为FPc区域和BPc区域。本说明书中，为了方便，将具有F3区域等的互补链称作正链，将具有F3c等的互补链称作负链。

在LAMP法中用于扩增核酸的引物主要包括4种引物，这些引物为(1)在3’末端侧具有与上述F2区域相同的序列、且在5’末端侧具有与上述F1区域互补序列的FIP引物；(2)具有与上述F3区域相同序列的F3引物；(3)在3’末端侧具有与上述B2c区域互补的序列、且在5’末端侧具有与上述B1c区域相同序列的BIP引物；以及(4)具有与上述B3c区域互补序列的B3引物。一般来说，将FIP引物和BIP引物称为内侧引物，将F3引物和B3引物称为外侧引物。

在LAMP法中，通过进而任意地使用称为环引物的引物，可以缩短扩增时间。此时，如图3所示，对于目标核酸而言，在从上述F2区域至F1区域的部分上规定LF区域、在从上述B2c区域至B1c区域的部分上规定LBc区域。这些区域称为环引物区域。而且，除了上述4种引物之外，还使用具有与LF区域互补序列的环引物LFc和具有与上述LBc区域相同序列的环引物LBc。详细内容参照WO2002/024902。这些环引物LFc和LBc可以同时使用，也可以仅使用其中一种。

图4为表示LAMP法的扩增中间产物的示意图。在LAMP法中，首先由目标核酸产生图4所示的哑铃型中间产物，将其作为扩增循环的起点。起点结构体的生成及之后的扩增过程是众所周知的，详细内容参照日本专利第3313358号说明书。如图4所示，中间产物由于两端部分带有互补序列，因此自身退火而形成环。

如图4所示，FIP引物和BIP引物退火在中间产物上，产生合成起点，合成反应由3’末端侧开始进行。具有环结构的中间产物作为FIP和BIP引物的模板连续地发挥作用，核酸合成得以进行。另外，如图所示，环引物退火在与FIP和BIP引物退火的环所不同的环上，进一步产生合成起点，从而促进扩增。

如本发明那样，使LAMP扩增产物与探针核酸杂交进行检测时，由于将单链的环部分用于反应中很有利，因此将检测区域规定在该环部分上。

图5为示意地表示形成在LAMP扩增产物中的4种单链环区域部分的图。作为各个检测区域，具有FP区域或BPc区域或它们的互补区域，还同时表示了与该检测序列杂交的探针核酸。另外，如图5所示，在检测扩增产物时也可以使用4种探针核酸，但也可以仅适当选择使用1种或2种探针核酸。

这里，就本发明的第一方式而言，规定上述FP区域和上述F2区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。同样，规定上述BPc区域和上述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。重复部分优选为0～10个碱基，更优选为0～5个碱基。在规定这些区域以满足上述条件的同时，对其它区域也进行适当规定，按照这些规定设计引物。

按照这种条件设计引物、即按照各区域满足上述条件的方式进行规定，对于提高扩增产物与探针核酸的杂交效率是很重要的。以下参照图6详细说明其理由。

图6为示意地表示FP区域和F2区域大部分重复的例子的图。图6(a)表示在环部分具有FP区域的情况，即正链的情况。此时，探针核酸具有与FP区域互补的序列(即FPc区域的序列)。但是，在反应溶液中存在未反应的FIP引物，该未反应的FIP引物具有与F2区域相同的序列。因此，如图6(a)所示，未反应FIP引物和探针核酸通过FP区域和F2区域的重复部分的序列而杂交。即，未反应FIP引物成为扩增产物的竞争结合物质，成为降低扩增产物与探针核酸的杂交效率的要因。另外，即便在未达成目标核酸的扩增时，由于未反应的引物与探针核酸的杂交，也有可能检测出假阳性的信号。

图6(b)表示环部分具有FPc区域的情况，即负链的情况。如图2所示那样，在该核酸链上存在与F2区域互补的F2c区域。由于该F2c区域与FIP引物的F2区域互补，因此未反应FIP引物与F2c区域退火形成双链，成为阻碍扩增产物与探针核酸的杂交的要因。该影响在实时检测扩增产物时、和在以高灵敏度、高精度检测时是特别致命的。

综合以上所述的杂交阻碍要因，可以分为以下2个。即(I)未反应引物与探针核酸的反应、(II)未反应引物与扩增产物的反应。由于这些阻碍要因，会产生杂交的反应效率降低、检测精确度恶化的问题。

接着，作为本发明的第二方式，说明使用环引物的情况。此时，规定上述FP区域和LF区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。同样，规定上述BPc区域和该LBc区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。在规定这些区域以满足上述条件的同时，对其它区域也进行适当规定，按照这些规定设计引物。

对于本发明第二方式而言，由于FP区域与环引物区域的大部分重复，因此与上述第一方式相同，会阻碍杂交效率。例如，如图7(a)所示，为正链时，未反应的环引物LFc与扩增产物中的LF区域退火形成双链，阻碍与探针核酸FPc的杂交。即，受到上述阻碍要因(II)的影响。另外，如图7(b)所示，为负链时，未反应的循环探针LFc与探针核酸FP杂交，阻碍扩增产物与探针核酸的杂交。另外，即便在未达成目标核酸的扩增时，未反应的环引物也会与探针核酸杂交，有可能检测出假阳性的信号。即，受到上述阻碍要因(I)的影响。

另外，图7中使用了按照F2区域、FP区域、LF区域的顺序进行配置的例子，但也可以按照F2区域、LF区域、FP区域的顺序进行配置。

图8综合表示了上述阻碍要因。图8(a)以阴影表示了未反应引物对于探针核酸显示假阳性时(阻碍要因1)的相关关系。扩增产物中的目标核酸序列与内侧引物(即FIP和BIP引物)中的序列、或环引物(即LFc和LBc引物)的序列在同一链上(即正链之间或负链之间)时，产生阻碍要因(I)。如果换句话说，则是探针核酸的序列与内侧引物的序列或环引物的序列在相反链上的情况。

图8(b)以网格表示了未反应引物与探针核酸竞争结合时(阻碍要因II)的相关关系。扩增产物中的目标核酸的序列与内侧引物中的序列或环引物的序列在相反链上时，产生阻碍要因(II)。如果换句话说，则是探针核酸的序列与内侧引物中的序列或环引物的序列在同一链上的情况。

如上所述，当FP、F2和LF区域以及BP、B2和LBc区域的任何一个有重复时，如果该重复部分过大，则产生阻碍杂交的影响或者降低杂交效率的影响。本发明人等发现了这种问题，进行了深入研究的结果发现，如下述实施例所示，通过使重复部分小于等于10个碱基，能够排除这些影响或者使这些影响在允许范围内。

另外，即便重复部分小于等于10个碱基，如果剩余的非重复部分的碱基数过少，则也易受到影响，因此优选非重复部分大于等于10个碱基。该非重复部分只要存在于单链环结构部分内，则可以是任何碱基，可以根据目标核酸的序列、各引物与检测序列的关系进行适当决定。

图9表示分别对于目标核酸链的正链和负链，检测序列区域(FP、FPc、BP、BPc)、内侧引物序列区域(F1c+F2、B1c+B2)、环引物序列区域(LFc、LBc)的设计模式。(1)和(2)为在F区域侧设计检测序列和环引物两者的情况。(1)的情况中，按照FP区域、F2区域或LF区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基的方式进行设计。

使FP区域和F2区域或LF区域的重复部分小于等于10个碱基的理由如上所述。例如，当检测序列为正链(FP)时，由于F2产生阻碍要因I、由于LFc产生阻碍要因II。当检测序列为负链(FPc)时，由于LFc产生阻碍要因I、由于F2产生阻碍要因II。

另外，LF区域和F1区域的重复部分小于等于20个碱基，更优选小于等于10个碱基。其原因为，如果LF区域和F1区域的重复碱基数多，则环引物LFc必须退火在成为双链的F1-F1c区域上，扩增效率降低。

图9(2)的情况为，按照FP区域和LF区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基的方式进行设计。使FP区域和LF区域的重复部分小于等于10个碱基的理由如上所述。例如，当检测序列为正链(FP)时，由于LFc产生阻碍要因II。当检测序列为负链(FPc)时，由于LFc产生阻碍要因I。

另外，FP区域和F1区域的重复碱基数小于等于15个碱基，更优选为0个碱基。其原因为，如果FP区域和F1区域有大于等于15个碱基重复时，则在检侧负链(FPc)时，由于F1c产生阻碍要因I。另外，探针核酸必须杂交在成为双链的F1-F1c区域上，杂交效率降低。

另外，F2区域和LF区域的重复碱基数小于等于20个碱基，更优选小于等于10个碱基。其原因为，如果F2区域和LF区域有超过20个的碱基重复，则含有F2序列的FIP引物和环引物LFc在该重复部分的序列互补，因此引物之间会发生相互作用。其结果是，难以与本来应该退火的扩增产物反应，扩增效率降低。

图9(3)表示了未在F区域侧设计环引物的情况。从与(1)、(2)情况相同的理由出发，设计FP区域和F2区域具有至少小于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。另外，按照FP区域和F1区域的重复部分小于15个碱基、更优选为0个碱基的方式进行设计。

图9(4)表示了未在F区域侧设计检测序列的情况。(4)的情况可以与在B区域设计检测序列的(6)～(8)相组合。从与(1)和(2)情况相同的理由出发，F2、LF和F1的重复部分小于等于20个碱基，更优选小于等于10个碱基。

图9(5)表示未在F区域侧设计环引物和检测序列的情况。(5)的情况可以与在B区域设计检测序列的(6)～(8)相组合。为了提高自身退火效率，优选F2区域和F1区域相距大于等于5个碱基。

对于表示B区域的图9(6)～(10)，也与F区域侧的情况相同。对于未设计检测序列的(9)和(10)而言，可以与在F区域侧设计有检测序列的(1)～(3)相组合。

根据目标核酸的序列，如图9(1)、(2)、(6)和(7)所示，如果将检测序列区域和环引物序列区域设计在同一环内，则由于单链环部分成为长链，自身退火效率降低，因而扩增效率往往降低。此时，不在含有检测序列一侧的环部分上设计环引物、而在另一侧的环部分上设计环引物的方法是有效的。

进而，作为本发明的第三方式，提供了与使用LAMP法检测单碱基突变(单碱基多态)的方法相关的引物的设计方法。利用LAMP法进行的扩增方法和使用了探针核酸的检测方法与上述第一和第二方式相同，但在检测单碱基突变时，按照显示目标核酸的单碱基突变的部位包含在FP和BP任一个区域的方式进行设计。即，相对于目标核酸，从其5’末端侧开始依次规定F3区域、F2区域和F1区域，并从其3’末端侧开始依次规定B3c区域、B2c区域和B1c区域，进而，在从上述F2区域至F1区域的部分上规定含有单碱基突变的FP区域。或者，在从上述B2c区域至B1c区域的部分上规定含有单碱基突变的BPc区域。

在本方式中使用的引物与上述第一方式相同。这里，在第三方式中按照上述F2区域与上述FP区域中的单碱基突变不重复的方式进行规定。或者，按照上述B2c区域与上述BPc区域中的单碱基突变不重复的方式进行规定。在规定这些区域以满足上述条件的同时，还可以适当规定其它区域，按照这些规定设计引物。

当检测单碱基突变时，只要使用扩增达到饱和的扩增产物与探针核酸杂交即可。此时，通过扩增产物中的单碱基突变部位的碱基，决定有无与探针核酸的杂交。这样，由于只要区分伴随单碱基的不同的相对信号的差别即可，因此引物设计中的限制有所放松。

但是，如果在单碱基突变部位或者成为其互补链的部分上设计内侧引物或环引物，则内侧引物或环引物所含类型的基因组优先地扩增，无法得到反映目标核酸本来基因型的扩增产物。

因此，重要的是，在目标核酸中的单碱基突变(单碱基多态)部分上按照内侧引物或环引物序列区域不重复的方式进行设计。由此，根据上述规定来规定区域、设计引物。

作为本发明的第四方式，提供与如上述第二方式那样使用环引物检测单碱基突变的方法相关的引物的设计方法。

即，在从上述F2区域至F1区域的部分上规定LF区域，在从上述B2c区域至B1c区域的部分上规定LBc区域。除了上述引物之外，还使用具有与上述LF区域互补序列的环引物LFc和具有与上述LBc区域相同序列的环引物LBc。这里，本发明的第四方式中，规定上述LFc区域不与上述FP区域中的单碱基突变重复。另外，规定上述LBc区域不与上述BPc区域中的单碱基突变重复。在规定这些区域以满足上述条件的同时，还可以适当规定其它区域，按照这些规定设计引物。

图10表示检测单碱基突变时的目标核酸的正链或负链上的各区域的设计模式。图10(1)和(2)为在F区域侧设计检测序列和环引物区域序列两者的情况。图10(1)的情况中，按照F2区域或LF区域与包含在FP或FPc区域中的单碱基突变部位或其互补链部位不重复的方式进行设计。即，F2区域直至邻接于突变部位的碱基都可以与FP区域重复。同样，LF区域直至邻接于突变部位的碱基都可与FPc区域重复。

LF区域和F1区域优选具有小于等于20个碱基的重复部分，更优选具有小于等于10个碱基的重复部分。如果LF区域与F1区域的重复碱基数多，则环引物LFc必须退火在成为双链的F1-F1c区域，扩增效率降低，因此优选上述范围。

图10(2)的情况是按照包含在FP区域中的单碱基突变部位与LF区域不重复的方式进行设计。反过来说，LF区域直至邻接于突变部位的碱基都可与FP区域重复。FP区域和F1区域的重复部分优选小于15个碱基，更优选为0个碱基。FP区域与F1区域的重复碱基数越多，则探针必须退火在成为双链的F1-F1c区域，杂交效率降低，因此优选上述范围。

F2区域和LF区域的重复碱基数小于等于20个碱基，更优选具有小于等于10个碱基。F2区域与LF区域的重复碱基数越多，则内侧引物内的F2序列和环引物FPc序列成为互补序列的部分变得越多，引物之间发生相互作用。其结果是，难以与本来应该退火的目标核酸反应，扩增效率降低，因此优选上述范围。

图10(3)是未在F区域侧设计环引物的情况。与图10(1)和(2)相同，F2区域在直至突变部位之前都可以与FP重复，FP区域和F1区域的重复碱基数优选小于15个碱基，更优选为0个碱基。

图10(4)是未在F区域侧设计检测序列的情况。图10(4)的情况可与在B区域设计有检测序列的图10(6)～(8)相组合。与图10(1)和(2)的情况相同，F2和LF、LF和F1的重复碱基数优选小于等于20个碱基，更优选小于等于10个碱基。

图10(5)是未在F区域侧设计环引物和检测序列的情况，图10(5)的情况可与在B区域设计有检测序列的图10(6)～(8)相组合。为了提高自身退火效率，优选F2区域和F1区域相距大于等于5个碱基。

图10(6)～(10)表示了B区域的情况，与F区域侧的情况相同。未设计检测序列的图10(9)和(10)可以与在F区域侧设计有检测序列的图10(1)～(3)相组合。

检测单碱基突变时，如果也根据目标核酸的序列在同一环内设计检测序列区域或成为其互补链的序列区域和环引物序列区域，则单链环部分变为长链，自身退火效率降低，因此扩增效率往往降低。此时，在含有检测序列的环侧不设计环引物而缩短环部分、在另一不含有检测序列的环侧上设计环引物的方法是有效的。

本发明的第五方式提供通过LAMP法将目标核酸扩增并利用探针核酸进行检测的方法。或者提供利用LAMP法将含有单碱基突变的目标核酸扩增并利用探针核酸进行检测，从而检测单碱基突变的方法。该第五方式中，利用使用了在上述第一～第四方式中所设引物的LAMP法将目标核酸扩增，并使该扩增产物与探针核酸杂交来进行检测。

如上所述，这里所使用的探针核酸具有与检测序列(FP、FPc、BP、BPc)互补的序列。可以相对于检测序列中的任一个序列准备探针核酸，也可以相对于多个检测序列准备探针核酸。探针核酸可以是悬浮在溶液中的状态，还可以固定在凝集载体等上，或者固定在固体基质上。

探针核酸可以是未经标记，也可以是根据检测方法标记有Cy5、Cy3、FITC、若丹明等荧光物质，还可以标记有鲁米诺、光泽精、吖啶鎓酯衍生物等发光物质，标记有半抗原或酶。另外，为了使探针核酸固定在基质上，还可以利用氨基、羧基、羟基、巯基、磺基等反应性官能团，卵白素、生物素等物质进行修饰。

作为固定探针核酸的基质，可以列举出硝基纤维素膜、尼龙膜、微孔板、玻璃、电极、磁铁、微球、塑料、胶乳、合成树脂、天然树脂、光纤维等。

另外，还可以通过探针核酸构成DNA芯片。所谓的DNA芯片是将探针核酸高密度地固定在玻璃或硅的基板上而成，是可以一次研究多个基因的序列信息的装置。目前主流的荧光检测方式是使用荧光标记的样品基因与芯片上的探针反应，使用高灵敏度的荧光分析装置进行检测的方式。作为其它检测方法，还开发了电流检测方式的DNA芯片。该方法为将固定在电极上的探针核酸与目标核酸杂交后，添加特异性地反应于双链DNA的插入剂，测定由插入剂得到的电化学信号的方法。由于电化学DNA芯片不需要标记、在检测中不需要昂贵的装置，因此作为第二代的DNA芯片令人期待(例如参照日本特开平5-199898号公报)。

使用多种探针核酸时，根据检测方法，可以同时使用未标记的探针和标记的探针、固定在固相上的探针和未固定在固相上的探针。例如，在使用捕获用核酸探针和检测用标记探针核酸的三明治杂交等中，标记探针核酸悬浮在溶液中并与检测序列杂交，捕获用探针核酸悬浮在溶液中，与检测序列杂交后被固定在基质上或者还可以预先被固定在基质上。

<杂交反应条件>

扩增产物和探针核酸的杂交在适当的条件下进行。适当条件随扩增产物的种类或结构、检测序列中所含碱基的种类、探针核酸的种类的不同而不同。例如，在离子强度为0.01～5的范围、pH为5～10范围的缓冲液中进行。还可以在反应溶液中添加作为杂交促进剂的硫酸葡聚糖以及鲑精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂等。在反应温度例如为10℃～90℃的范围下进行，还可以通过搅拌或振荡等提高反应效率。反应后的洗涤中可以使用例如离子强度为0.01～5的范围、pH为5～10范围的缓冲液。

<检测方法>

检测杂交在探针核酸上的扩增产物的方法可以使用任意方法。其具体例如下所述。

作为第一检测方法，可以使用利用结合在核酸双链中的插入剂的方法。该方法中，利用氨基、羧基、羟基、巯基、磺基等反应性官能团，卵白素、生物素等物质将探针核酸进行修饰并固定在固相上。使扩增产物与固定在固相上的探针核酸杂交，之后洗涤。利用结合在双链上的插入剂的信号来检测探针核酸和扩增产物是否杂交。

作为插入剂，只要是具有光化学活性或电化学活性，则没有特别限定，例如可以使用乙锭、溴化乙锭、吖啶、氨基吖啶、吖啶橙、二氨基吖啶、玫瑰树碱、放线菌素D、柔红霉素、丝裂霉素C、Hoechst33342、Hoechst33258、阿克拉霉素、DAPI、阿霉素、表阿霉素、阿克拉希霉素等。另外，作为其它能够使用的插入剂，可以列举出在日本特开昭62-282599号公报中记载的物质。

使用电极检测电化学变化时，除了上述插入剂本身相对于氧化还原反应为可逆的物质之外，还可以使用含有引起电可逆氧化还原反应的物质作为中心金属的金属络合物、即金属插入剂。作为这种金属插入剂，例如可以列举出三(菲绕啉)锌络合物、三(菲绕啉)钌络合物、三(菲绕啉)钴络合物、二(菲绕啉)锌络合物、二(菲绕啉)钌络合物、二(菲绕啉)钴络合物、二吡啶铂络合物、多吡啶铂络合物、菲绕啉铂络合物、三(二吡啶)锌络合物、三(二吡啶)钌络合物、三(二吡啶)钴络合物、二(二吡啶)锌络合物、二(吡啶)钌络合物、二(二吡啶)钴络合物。

使用电极检测基因时，也可以利用产生电化学发光的插入剂。这种插入剂没有特别限定，例如可以列举出鲁米诺、光泽精、芘、二苯蒽和红荧烯。由这些插入剂产生的电化学发光可以通过使用萤火虫荧光素、脱氢荧光素之类的荧光素衍生物，苯基苯酚、氯苯酚之类的酚类或萘类之类的增强剂进行增强。

在为光学活性的插入剂时，根据吸光度、荧光、发光、消光、荧光偏光、圆偏光二色性等光学信息来检测单独为插入剂时与结合在双链上时的信号之差，或者检测结合在双链上的插入剂的吸收波长、荧光波长、发光波长、消光波长的变化。为电化学活性的插入剂时，通过测定中心金属或插入剂本身的氧化还原电流进行检测。

作为第二检测方法，可以使用使捕获用探针核酸与标记了的检测用探针核酸进行三明治杂交的方法。捕获用探针核酸通过第一检测方法记载的方法固定在固相上。标记检测核酸的物质可以根据之后进行的检测方法决定。例如可以利用电极活性物质、荧光物质、发光物质、电化学发光物质、酶、酶底物、半抗原、抗原、抗体、放射性同位素等进行标记。如上述半抗原那样不能直接检测信号的物质，利用酶结合卵白素之类的酶结合抗半抗原抗体，通过由酶反应获得的物质的浊度、吸光度、荧光、发光、消光、荧光偏光、圆偏光二色性之类的光学信息进行测定，或者通过测定电活性间接地检测基因。

另外，当探针核酸构成DNA芯片时，可以通过荧光检测方式和电流检测方式等进行检测。

为电流检测方式时，通常根据第一检测方法，在使用结合在核酸双链上的插入剂进行检测的玻璃或硅的基板上配置电极，在该电极上固定探针核酸。本领域技术人员可以根据需要适当地设计电极的数量和配置图案。另外，还可以与其它的普通电化学检测法同样，使用对电极和参照极。

这里使用的电极没有特别限定，可以使用金、金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓、钨等金属单质及它们的合金，或者石墨、玻璃碳等碳等，或者它们的氧化物、化合物。

接着，使目标核酸与固定在电极上的探针核酸杂交，之后添加电化学活性的插入剂。目标核酸与基板上的探针核酸的杂交由插入剂的电化学信号检测。

电化学测定是施加例如大于等于插入剂发生电化学反应的电位的电位，测定来自于插入剂的反应电流值。此时，电位可以以恒速扫描或者利用脉冲施加，或者还可以施加恒定电位。测定时可以使用例如恒电位计、数字万用表和功能性发生器等装置控制电流、电压。

插入在双链中的插入剂可以使用电化学活性的物质，例如Hoechst33258、吖啶橙、喹吖因、柔红霉素、金属插入剂、双吖啶等双插入剂、三插入剂、多插入剂等。而且，还可以使用电化学活性的金属络合物、例如二茂铁、紫精等预先将这些插入剂进行修饰。

为荧光检测方式时，有根据第二检测方法利用Cy5、Cy3、FITC、若丹明等荧光色素标记探针核酸，使目标核酸发生三明治杂交的方法；通过使用用荧光色素标记过的引物或者dNTP等将目标核酸标记，之后与固定在固相上的探针核酸杂交的方法等。使用根据标记种类的适当检测装置进行目标核酸与固相上的探针核酸的结合。

<检体试样>

作为本发明对象的检体没有特别限定，例如可以使用由个体采集的血液、血清、白血球、尿、粪便、精液、唾液、组织、活组织检查、口腔内粘膜、培养细胞、痰等。所谓的个体可以是人、人以外的动植物以及病毒、细菌、细菌、酵母和支原体等微生物。由这些检体试样中提取出核酸成分，调制供于目标核酸的检测试验的试样溶液。提取方法没有特别限定，例如也可以利用市售的核酸提取方法QIAamp(QIAGE公司生产)、Sumaitest(住友金属公司生产)等。

<引物>

在LAMP反应中，由于必须在由外侧引物合成核酸之前开始由内侧引物的核酸合成，因此就内侧引物和外侧引物的熔化温度(Tm)、量比而言，通过使内侧引物的熔化温度(Tm)、量比分别高于外侧引物，能够高效地进行反应。熔化温度(Tm)可以详细地表示为(F3-F3c间和B3-B3c间的熔化温度)≤(F2-F2c间和B2-B2c间的熔化温度)≤(F1-F1c间和B1-B1c间的熔化温度)。使(F2-F2c间和B2-B2c间的熔化温度)≤(F1-F1c间和B1-B1c间的熔化温度)的原因在于，F1-F1c间和B1-B1c间的分子内退火比F2或R2退火更为优先地在环部分发生。对于量比，详细地说可以将内侧引物的浓度设定为外侧引物浓度的2～50倍，优选为4～25倍。

<引物长度>

在LAMP反应中使用的6种引物的链长优选为10～100个碱基。内侧引物是结合有2个区域的引物，但这里表示各个区域的链长。大于等于10个碱基是指引物在维持特异性的同时用于退火在模板上的必须长度。另外，由于通过化学合成难以制造过长的碱基，因此优选上述链长。

从成为单链环部分的F2c区域到F1c区域的距离以及从B2c区域到B1c区域的碱基数优选为0～120个碱基，更优选为5～70个碱基。该数值中不包括F2c、B2c区域。由于单链环部分过于接近或者过于疏远时，自身退火不能高效地进行，因此优选上述链长。

F1-B1间(不含F1、B1区域)的碱基数还可以是0个碱基，更优选间隔大于等于10个碱基。F1-B1间狭窄时，往往使扩增不稳定。

F2-B2间(包括F2、B2区域)的碱基数也根据链置换型聚合酶的活性，但优选小于等于700个碱基，更优选小于等于500个碱基。

<DNA聚合酶>

链置换型DNA聚合酶可以列举出Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶等，除这些之外，还可以使用日本专利第3313358中记载的DNA聚合酶。

<LAMP反应条件>

对于LAMP反应条件而言，温度、pH根据所使用的DNA聚合酶设定为其活性达到最优的条件。另外，为了调整酶活性、核酸的熔化温度(Tm)还可以适当添加盐类。例如可以列举出KCl、NaCl、(NH₄)₂SO₄等。另外，使用甜菜碱或DMSO等作为熔化温度(Tm)的调整剂，使用牛血清白蛋白或糖类作为保护酶的成分。详细情况参照日本专利第3313358。

实施例

以下使用实施例具体地说明本发明。

[实施例1]由内侧引物产生的假阳性信号的检测

<检测序列>

在本实施例中，使用人MTHFR基因作为样品用核酸。检测序列共设计为以下4种检测序列：设计在MTHFR LAMP产物中的单链环部分上，且检测序列与FIP引物的F2序列(i)完全不重复、(ii)重复5个碱基、(iii)重复10个碱基、(iv)重复15个碱基(图11)。

(i)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAAGTG

(ii)GGGGGAGGAGCTGACCAG

(iii)ATGTGGGGGGAGGAGCTG

(iv)TGAAGATGTGGGGGGAGG

<引物>

本实施例中使用的合成核苷酸引物如下所示。图11表示了人MTHFR基因的各引物的序列部分。这里，FIP引物含有F1c部分和F2部分，BIP引物含有B1c部分和B2部分。在它们中间可以插入任意序列，也可以不插入。另外，图11中，F区域中带有c的部分(即F1c)表示使用图11所示序列的相反链，相反，B区域中不带有c的部分(即B2和B3)表示使用图11所示序列的相反链。

MTHFR F3引物

GCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC

MTHFR FIP引物

CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG(F1c)-GCTGCTGAAGATGTGGGGGG(F2)

MTHFR B3引物

GCACAGGATGGGGAAGTC

MTHFR BIP引物

GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)-AGCTGGGGTCAGGCC(B2)

<LAMP反应液>

使以通过以下所示条件调制的人基因组或小鼠基因组为模板的LAMP反应液与固定在金电极上的探针核酸杂交。之后，使用电流检测方式检测该LAMP扩增产物中存在的检测序列。

LAMP反应溶液为以下组成。

灭菌超纯水 5.5μl

Bst DNA聚合酶 1μl

缓冲液 12.5μl

Tris·HCl pH为8.0 40mM

KCl 20mM

MgSO₄ 16mM

(NH₄)₂SO₄ 20mM

吐温20 0.2％

甜菜碱1.6M

DNTP2.8mM

F3引物(10μM) 0.5μl

B3物(10μM) 0.5μl

FIP引物(20μM) 2μl

BIP引物(20μM) 2μl

30ng/μl模板

(精制人基因组或精制小鼠基因组) 1μl

总量 25μl

<利用LAMP法的扩增反应>

使用人基因组、小鼠基因组的2种模板，添加灭菌超纯水代替基因组作为对照，在上述所示组成的LAMP反应液中、63℃下反应120分钟。利用琼脂糖电泳确认扩增产物时，对于以人基因组为模板的扩增产物而言，确认了扩增条带，但对于以小鼠基因组为模板的扩增产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物而言，未得到扩增条带。对于扩增后的溶液而言，在以人基因组为模板的扩增产物中可见白色沉淀，但在以小鼠基因组为模板的扩增产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物中未见白色沉淀。所谓的白色沉淀是如果达成了LAMP扩增，则由于扩增过程中产生的副产物、焦磷酸镁而在溶液中观察到的现象。

由这些结果可确认，对于以人基因组为模板进行扩增的产物而言，进行了特异的扩增反应，对于以小鼠基因组为模板的扩增产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物而言，未进行扩增反应。

<探针核酸固定化电极的制作>

探针核酸的碱基序列如下所示。

负探针GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA

正探针(i)CACTTTCTTCACTGGTCAGCTCCT

正探针(ii)CTGGTCAGCTCCTCCCCC

正探针(iii)CAGCTCCTCCCCCCACAT

正探针(iv)CCTCCCCCCACATCTTCA

正探针(i)(ii)(iii)(iv)使用5’SH修饰的负链探针。负探针使用表示与MTHFR基因序列无关的序列的5’SH修饰的探针。

探针在金电极上的固定利用硫醇基与金的强大化学结合性进行。将末端经硫醇基修饰过的探针溶液点样在金电极上，在25℃下静置1小时后，浸渍在1mM巯基己醇溶液中，利用0.2×SSC溶液洗涤。在每3个电极上点样同一个探针。洗涤后用超纯水洗涤，风干，制成探针固定化电极基板。

<电极配置>

1-3电极负探针

4-6电极正探针(i)

7-9电极正探针(ii)

10-12电极正探针(iii)

13-15电极正探针(iv)

<LAMP反应溶液的调制和杂交>

对于反应液，在以上述组成调制的人基因组为模板扩增的产物、以小鼠基因组为模板扩增的产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物的共计3种产物中添加终浓度为2×SSC的盐。另外，还调制仅有终浓度为2×SSC的溶液作为对照。将这些溶液点样在如上制作的探针核酸固定化电极基板上，在35℃下静置60分钟，从而进行杂交反应。之后，利用超纯水轻轻洗涤。在含有50μM作为插入剂的Hoechst33258溶液的磷酸缓冲液中浸渍该电极15分钟后，测定Hoechst33258分子的氧化电流响应。

<结果>

如图12所示，由作为对照的2×SSC溶液，未见与由固定有负探针(NP)的电极产生的电流值相比，由固定有正探针(i)～(iv)的电极产生的信号增加。另一方面，由以人基因组为模板扩增的产物，由正探针(i)～(iv)所有的探针都检测到了伴随着杂交的信号。

由以小鼠基因组为模板扩增的产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物，无论扩增反应是否发生，都从与F2区域重复15个碱基的正探针(iv)检测到了假阳性的信号。而重复10个碱基的正探针(iii)、重复5个碱基的正探针(ii)、重复0个碱基的正探针(i)随着重复部分的减少，假阳性信号消失。

由这些结果可知，由于单链环上的检测序列与内侧引物序列的重复，检测出假阳性的信号。这是由于表示与检测序列互补序列的探针核酸与溶液中的内侧引物发生杂交。如果重复部分为15个碱基，则可以明确地检测出假阳性信号，无法得到正确的检测结果。

[实施例2]由环引物产生的假阳性信号的检测

<检测序列>

本实施例中，与实施例1同样使用MTHFR基因作为样品用核酸。检测序列设计在MTHFR LAMP产物中的单链环部分。检测序列共设计为以下4种：与环引物LFc序列(v)完全不重复、(vi)重复5个碱基、(vii)重复10个碱基、(viii)重复15个碱基(图13)。

(v)TTTCTTCACTGGTCAGCTCCT

(vi)GACACTTTCTTCACTGGTCAG

(vii)TCAAAGACACTTTCTTCACTG

(viii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT

1)<引物>

本实施例中使用的合成核苷酸引物如下所示。图13表示人MTHFR基因的各引物的序列部分。这里，FIP引物具有F1c部分和F2部分，BIP引物具有B1c部分和B2部分。序列部分的标记方法与实施例1同样。

MTHFR F3引物

GCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC

MTHFR FIP引物

CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG(F1c)-GCTGCTGAAG ATGTGGGGGG(F2)

MTHFR B3引物

GCACAGGATGGGGAAGTC

MTHFR BIP引物

GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)-AGCTGGGGTCAGGCC(B2)

MTHFR LFc引物

GTAAAGAACAAAGACTTCAAAGACAC

MTHFR LBc引物

CCCTGGTTCATCCCCTG

<LAMP反应液>

使以根据以下所示条件调制的人基因组或小鼠基因组为模板的LAMP反应液与固定在金电极上的探针核酸杂交。之后，使用电流检测方式检测该扩增产物中存在的检测序列。

LAMP反应溶液为以下组成。

灭菌超纯水 1.5μl

Bst DNA聚合酶 1μl

缓冲液 12.5μl

Tris·HCl pH为8.0 40mM

KCl 20mM

MgSO₄ 16mM

(NH₄)₂SO₄ 20mM

吐温20 0.2％

甜菜碱1.6M

DNTP2.8mM

F3引物(10μM) 0.5μl

B3引物(10μM) 0.5μl

FIP引物(20μM) 2μl

BIP引物(20μM) 2μl

LFc引物(10μM) 2μl

LBc引物(10μM) 2μl

30ng/μl模板

(精制人基因组或精制小鼠基因组) 1μl

总量 25μl

<利用LAMP法的扩增反应>

使用人基因组、小鼠基因组的2种模板，添加灭菌超纯水代替基因组作为扩增的对照。图14(A)在使用4种基本引物(F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物)以外，还使用如2)所述组成的2种环引物(LFc引物、LBc引物)。图14(B)如上述记载的组成那样添加6种引物中仅除去LFc引物之外的其余5种引物，添加灭菌水代替LFc引物。图14(C)如上述所述组成那样添加6种引物中除去LFc引物和LBc引物之外的其余4种引物，添加灭菌水代替LFc引物和LBc引物。

在63℃下使LAMP反应进行30分钟、60分钟、90分钟、120分钟。与实施例1同样，利用琼脂糖电泳确认扩增产物时，对于以人基因组为模板的扩增产物而言，在3种引物对中均确认了扩增条带，但对于以小鼠基因组为模板的扩增产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物而言，在3种引物对中均未得到扩增条带。对于扩增后的溶液而言，在以人基因组为模板的扩增产物中可见白色沉淀，但在以小鼠基因组为模板扩增的产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物中未见白色沉淀。由这些结果可确认，对于以人基因组为模板进行扩增的产物而言，进行了特异的扩增反应，对于以小鼠基因组为模板的扩增产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物而言，未进行扩增反应。

<探针核酸固定化电极的制作>

探针核酸的碱基序列如下所示。

负探针GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA

正探针(v)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAA

正探针(vi)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC

正探针(vii)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA

正探针(viii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT

正探针(v)～(viii)使用5’SH修饰的正链探针。负探针使用表示与MTHFR基因序列无关的序列的5’SH修饰的探针。探针在金电极上的固定利用与实施例1相同的方法进行。

<电极配置>

1-3电极负探针

4-6电极正探针(v)

7-9电极正探针(vi)

10-12电极正探针(vii)

13-15电极正探针(viii)

<LAMP反应溶液的调制和杂交>

在63℃下使用上述A、B和C的3种引物对将3种分别以人基因组、小鼠基因组、添加灭菌超纯水代替基因组为模板的反应液扩增120分钟。扩增后，在各个反应液中添加终浓度为2×SSC的盐。另外，还调制仅有终浓度为2×SSC盐的溶液作为对照。将这些溶液点样在如上制作的探针核酸固定化电极基板上，在35℃下静置60分钟，进行杂交反应。之后，利用与实施例1同样的方法进行电化学测定。

<结果>

如图14所示，由作为对照的2×SSC溶液，未见与由固定有负探针的电极产生的电流相比，由固定有正探针(v)(vi)(vii)(viii)的电极产生的信号增加。另一方面，由以人基因组为模板扩增的产物，从正探针(v)(vi)(vii)(viii)都检测到了伴随着杂交的信号。

由以小鼠基因组为模板扩增的产物、添加灭菌超纯水代替基因组的产物，无论扩增反应是否发生，都从检测序列与环引物LFc序列重复15个碱基的正探针(viii)检测到了假阳性的信号。而重复10个碱基的正探针(vii)、重复5个碱基的正探针(vi)、重复0个碱基的正探针(v)随着重复部分的减少，假阳性信号消失。

由这些结果可知，如果单链环上存在的检测序列与环引物序列重复，则表示与检测序列互补的序列的探针核酸与溶液中的环引物发生杂交，检测出假阳性信号。

如图15所示，本实施例中利用包括带有与设计在F区域侧的检测序列相重复部分的环引物LFc的6种引物进行扩增的A中，如上所述，检测出了假阳性的信号。而在未添加两个环引物LFc和LBc、用4种引物进行扩增的C中，扩增效率低，饱和扩增需要120分钟。

另一方面，仅在未设计检测序列的B区域添加环引物LBc引物、利用5种引物进行扩增的B中，未检测到假阳性，在60分钟时使扩增饱和。由此说明，如果不能在同一环内设计检测序列或者成为检测序列互补链的序列和环引物时，则在与含有检测序列或者成为检测序列互补链的序列的环不同方向的环上设计环引物的方法，从LAMP扩增效率方面、扩增产物检测方面出发都是有效的。

[实施例3]由环引物导致的探针核酸与检测序列的杂交反应阻碍

<检测序列>

本实施例中，与实施例2相同，使用人MTHFR基因作为样品用核酸。检测序列共设计为以下4种：设计在MTHFR LAMP产物中的单链环部分，且成为检测序列互补链的序列与环引物LFc序列(ix)基本上不重复、(x)重复5个碱基、(xi)重复10个碱基、(xii)重复15个碱基)(图13)。实施例3中使用的检测序列与实施例2中使用的检测序列为相反链(即为互补的序列，且方向相反)的关系。

(ix)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAA

(x)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC

(xi)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA

(xii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT

<引物>

使用在实施例2中使用的同样的引物。

<LAMP反应液>

使以根据以下所示条件调制的人基因组为模板的LAMP反应液与固定在金电极上的探针核酸发生杂交。之后，使用电流检测方式检测该LAMP扩增产物中存在的检测序列。LAMP反应溶液的组成与实施例2的反应液相同。

<利用LAMP法的扩增反应>

以人基因组作为模板，分别制成下述LAMP反应液：A.添加了6种引物的LAMP反应液、B.仅不添加LFc引物而添加了其余5种引物的LAMP反应液、C.不添加LFc和LBc引物而添加了其余4种引物的LAMP反应液。使它们在63℃的反应液中反应30分钟、60分钟、90分钟、120分钟。利用琼脂糖电泳确认扩增产物。对于调制LAMP反应液时添加灭菌超纯水代替基因组的溶液也同时进行电泳，确认是否未发生污染。

<探针核酸固定化电极的制作>

探针核酸的碱基序列如下所示。

负探针GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA

正探针(ix)TTTCTTCACTGGTCAGCTCCT

正探针(x)GACACTTTCTTCACTGGTCAG

正探针(xi)TCAAAGACACTTTCTTCACTG

正探针(xii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT

正探针使用3’SH修饰的负链探针。

负探针使用表示与MTHFR基因序列无关的序列的3’SH修饰的探针。探针在金电极上的固定利用与实施例1相同的方法进行。点样也相同，在每3个电极上点样同一个探针。

<电极配置>

1-3电极负探针

4-6电极正探针(ix)

7-9电极正探针(x)

10-12电极正探针(xi)

13-15电极正探针(xii)

<LAMP扩增产物的稀释和杂交>

在63℃下使用上述A和B的引物对将以人基因组为模板的反应液扩增30分钟和60分钟。对该扩增产物进行电泳时，A和B引物对扩增了30分钟的产物的扩增条带都比扩增了60分钟的产物的扩增条带浅。由此结果可知，扩增30分钟的产物未达到饱和扩增。

利用LAMP缓冲液对反应了60分钟的A和B的扩增产物以及反应了30分钟的A的扩增产物进行阶段稀释。之后，与反应了30分钟的B的扩增产物一起电泳，选择分别达到同等程度的稀释率的溶液，使这些扩增产物的浓度达到同种程度。

之后，分别在反应了30分钟的B的扩增产物、利用LAMP缓冲液稀释过的60分钟反应的A和B的扩增产物、反应了30分钟的A的扩增产物中添加终浓度为2×SSC的盐。另外，还调制仅有终浓度为2×SSC的溶液作为对照。将这些溶液点样在如上制作的探针核酸固定化电极基板上，在35℃下静置60分钟，进行杂交反应。之后，利用超纯水轻轻洗涤。在含有50μM作为插入剂的Hoechst33258溶液的磷酸缓冲液中浸渍该电极15分钟后，测定Hoechst33258分子的氧化电流响应。

<结果>

如图16所示，对于反应60分钟和反应30分钟的B的扩增产物而言，可见与由固定有正探针(ix)(x)(xi)(xii)的电极相比大致同等程度的信号增加。而对于反应60分钟和反应30分钟的A的扩增产物而言，对检测序列与环引物LFc序列重复15个碱基的正探针(xii)的信号增加来说，反应30分钟的扩增产物低于反应60分钟的扩增产物。而重复10个碱基的正探针(xi)、重复5个碱基的正探针(x)、重复0个碱基的正探针(ix)随着重复部分的减少，反应60分钟的信号增加与反应30分钟的信号增加达到大致同等程度。

反应30分钟的A的扩增产物与反应60分钟的A的扩增产物相比，扩增反应在中途残留更多的未反应的LFc引物。由此，在大量残存未反应的LFc引物的溶液中，溶液中的LFc引物比固相上的探针优先地退火在单链的检测序列上，探针与检测序列的杂交效率降低。

由此可知，如果成为检测序列互补链的序列与退火在单链环上的引物序列重复，则溶液中残存的引物阻碍了探针核酸与检测序列的杂交反应，因此无法得到正确的判定结果。另外可以容易地预测到，不仅本实施例所示的环引物会产生这种影响，结合在单链环上的内侧引物也会造成同样的影响。

如图17所示，本实施例中利用包括带有与设计在F区域侧的检测序列互补链的序列相重复部分的环引物LFc的6种引物进行扩增的A中，如上所述，阻碍了探针核酸和目标核酸的杂交。而在未添加两个环引物LFc和LBc、用4种引物进行扩增的C中，扩增效率低，饱和扩增需要120分钟。

另一方面，仅在未设计检测序列的B区域添加环引物LBc引物、利用5种引物进行扩增的B中，未阻碍杂交，在60分钟时使扩增饱和。由此说明，如果不能在同一环内设计检测序列或者成为检测序列互补链的序列和环引物时，则在与含有检测序列或者成为检测序列互补链的序列的环不同方向的环上设计环引物的方法，从LAMP扩增效率方面、扩增产物检测方面出发都是有效的。

[实施例4]

关于在单碱基突变部位上设计引物时的LAMP扩增

本实施例中，使用人基因N-乙酰转化酶2(NAT2)作为样品用核酸，检测NAT2基因内存在的857G/A单碱基突变(图18)。人基因组的模板使用根据测序结果分别鉴定为857G/G同型、857A/A同型、857G/A异型的模板。含有单碱基突变的检测序列设计在NAT2 LAMP产物中的单链环部分，使利用以下所示条件进行了LAMP扩增的产物与固定在金电极上的探针核酸发生杂交。进行洗涤后，使用电流检测方式检测该LAMP扩增产物中存在的检测序列。

<检测序列>

(xiii)ATAGTAAGGGATCCATCACCAGG

(xiv)AAATAGTAAGGGATTCATCACCAGGT

<合成核苷酸引物>

NAT2 F3引物

GTGGGCTTCATCCTCAC

NAT2 FIP引物

AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC(F1c)-TAAAGACAATACAGATCTGGTCG(F2)

NAT2 B3引物

TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT

NAT2 BIP引物

GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA(B1c)-GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC(B2)

NAT2 LFc引物

AGTGAGAGTTTTAAACTCGACC

NAT2 LBc G引物

CTGGTGATGGATCCCTTAC

NAT2 LBc A引物

CCTGGTGATGAATCCCTTAC

对于在单碱基突变部位上设计环引物的LBG引物和LBA引物而言，按照Tm值为同等程度的方式对链长进行调整。

<LAMP反应液>

以与实施例2相同的组成进行。对于LBc引物而言，当使用LBc G引物和LBc A引物两个引物时，LBc G引物和LBc A引物的浓度各为一半。

<利用LAMP法的扩增反应>

以(D)857G/G同型、(E)857A/A异型作为模板，调制添加了除去3种环引物以外的4种引物的反应液。

以人基因组857G/A异型为模板，接着调制(F)～(I)的反应液。(F)添加包括所有环引物的7种引物、(G)添加除去LBcA引物之外的6种引物、(H)添加除去LBc G引物和LBc A引物之外的5种引物、(I)添加除去3种环引物(LFc、LBc G、LBc A引物)之外的4种引物。在63℃的反应液中使这些反应液反应30分钟、60分钟、90分钟、120分钟。

利用琼脂糖电泳确认扩增产物。对于在调制LAMP反应液时添加灭菌超纯水代替基因组的溶液同时进行电泳，确认是否未发生污染。

<探针核酸固定化电极的制作>

探针核酸的碱基序列如下所示。

负探针GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA

(xiii)正G探针CCTGGTGATGGATCCCTTACTAT

(xiv)正A探针ACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTT

正探针使用3’SH修饰的正链探针。负探针使用表示与NAT2基因序列无关的序列的3’SH修饰的探针。探针在金电极上的固定利用与实施例1相同的方法进行。点样也相同，在每3个电极上点样同一个探针。

<电极配置>

1-3电极负探针

4-6电极正G探针

7-9电极正A探针

<LAMP反应溶液的调制和杂交>

在于63℃下反应了60分钟的扩增产物D、E、F、G、H、I以及分别混合一半扩增产物D和E的D+E中，添加终浓度为2×SSC的盐。另外，还调制仅有终浓度为2×SSC的溶液作为对照。在55℃下使这些溶液与固定在金电极上的探针核酸杂交20分钟。之后，在45℃下使用0.2×SSC的缓冲液洗涤20分钟后，用超纯水轻轻洗涤。在含有50μM作为插入剂的Hoechst33258溶液的磷酸缓冲液中浸渍该电极15分钟后，测定Hoechst33258分子的氧化电流响应。

<结果>

如图19所示，以D.857G/G同型、E.857A/A异型为模性，未使用环引物的LAMP产物中可见分别来自G探针或A探针的信号增加。另外，对于混合D和E、人工地制作了异型产物的D+E产物而言，可见来自G探针、A探针两者的大致同等程度的信号增加。

以857G/A异型为模板、添加了包含LBc A引物和LBc G引物的7种引物的F使LBc A引物和LBc G引物的Tm值达到大致相同，但A型的信号高些。由此说明，难以使G型、A型的引物的反应效率等同。

另外，除去LBc A引物、添加了含有LBc G引物的6种引物的LAMP反应液G检测出了反映环引物类型的G型信号，几乎没有检测出A型的信号。由此说明，G的扩增产物几乎没有反映模板的类型，导入至环引物中的类型的产物优先被扩增。

另一方面，对于没有使用重复于突变部位的引物的H和I而言，可以得到正确反应模板类型的信号。这些结果表明，为了得到正确反映模板类型的扩增产物，不要在多态(突变)部位上设计引物。

如图20所示，如果关注添加的引物与饱和扩增时间的关系，则添加了下述环引物LBc的H在30分钟时达到饱和扩增，所述环引物不重复于单突变碱基突变部位而设计、且在F区域侧退火。而没有添加环引物的I需要60分钟达到饱和扩增。由此说明，当不能在含有单碱基突变(单碱基突变)部位或成为其互补链部位的环内设计环引物时，在与含有单碱基突变(单碱基突变)部位或成为其互补链部位的环不同方向的环上设计环引物的方法，从LAMP扩增效率方面、扩增产物检测方面出发都是有效的。

以下，以序列表表示本发明设计的检测序列。

序列表

<110>株式会社东芝

<120>引物的设计方法、目标核酸的检测方法、单碱基突变的检测方法以及检测试剂

盒

<130>A000505750

<160>55

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

aggagctgac cagtgaagaa agtg 24

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

gggggaggag ctgaccag 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

atgtgggggg aggagctg 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>4

tgaagatgtg gggggagg 18

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F3 Primer

<400>5

gctgaaggac tactacctct tctacc 26

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Flc of FIP Primer

<400>6

cggtttggtt ctcccgagag 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F2 of FIP Primer

<400>7

gctgctgaag atgtgggggg 20

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B3 Primer

<400>8

gcacaggatg gggaagtc 18

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Blc of BIP Primer

<400>9

gtgagtgatg ctggagtggg 20

<210>10

<211>15

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B2 of BIP Primer

<400>10

agctggggtc aggcc 15

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Negative Probe

<400>11

gactataaac atgctttccg tggca 25

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>12

cactttcttc actggtcagc tcct 24

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>13

ctggtcagct cctccccc 18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>14

cagctcctcc ccccacat 18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>15

cctcccccca catcttca 18

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>16

tttcttcact ggtcagctcc t 21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>17

gacactttct tcactggtca g 21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

tcaaagacac tttcttcact g 21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

agacttcaaa gacactttct t 21

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F3 Primer

<400>20

gctgaaggac tactacctct tctacc 26

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Flc of FIP Primer

<400>21

cggtttggtt ctcccgagag 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F2 of FIP Primer

<400>22

gctgctgaag atgtgggggg 20

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B3 Primer

<400>23

gcacaggatg gggaagtc 18

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Blc of BIP Primer

<400>24

gtgagtgatg ctggagtggg 20

<210>25

<211>15

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B2 of BIP Primer

<400>25

agctggggtc aggcc 15

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LFc Primer

<400>26

gtaaagaaca aagacttcaa agacac 26

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LBc Primer

<400>27

ccctggttca tcccctg 17

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Negative Probe

<400>28

gactataaac atgctttccg tggca 25

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>29

aggagctgac cagtgaagaa a 21

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>30

ctgaccagtg aagaaagtgt c 21

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>31

cagtgaagaa agtgtctttg a 21

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>32

aagaaagtgt ctttgaagtc t 21

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>33

aggagctgac cagtgaagaa a 21

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>34

ctgaccagtg aagaaagtgt c 21

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>35

cagtgaagaa agtgtctttg a 21

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>36

aagaaagtgt ctttgaagtc t 21

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Negative Probe

<400>37

gactataaac atgctttccg tggca 25

<210>38

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>38

tttcttcact ggtcagctcc t 21

<210>39

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>39

gacactttct tcactggtca g 21

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>40

tcaaagacac tttcttcact g 21

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positive Probe

<400>41

agacttcaaa gacactttct t 21

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>42

atagtaaggg atccatcacc agg 23

<210>43

<211>26

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>43

aaatagtaag ggattcatca ccaggt 26

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F3 Primer

<400>44

gtgggcttca tcctcac 17

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Flc of FIP Primer

<400>45

agcacttctt caacctcttc ctc 23

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>F2 of FIP Primer

<400>46

taaagacaat acagatctgg tcg 23

<210>47

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B3 Primer

<400>47

tgataattag tgagttgggt gat 23

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Blc of BIP Primer

<400>48

ggggagaaat ctcgtgccca a 21

<210>49

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>B2 of BIP Primer

<400>49

gggtttattt tgttccttat tc 22

<210>50

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LFc Primer

<400>50

agtgagagtt ttaaactcga cc 22

<210>51

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LBcG Primer

<400>51

ctggtgatgg atcccttac 19

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>LBcA Primer

<400>52

cctggtgatg aatcccttac 20

<210>53

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Negative Probe

<400>53

gactataaac atgctttccg tggca 25

<210>54

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positve G Probe

<400>54

cctggtgatg gatcccttac tat 23

<210>55

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Positve A Probe

<400>55

acctggtgat gaatccctta ctattt 26

Claims

1.一种扩增产物的检测方法，其为使利用多个引物通过LAMP法将目标核酸扩增而得到的扩增产物与探针核酸发生杂交，其中，

所述目标核酸从5’末端侧开始依次具有F3区域、F2区域和F1区域，并从3’末端侧开始依次具有B3c区域、B2c区域和B1c区域，在从所述F2区域至F1区域的部分上具有FP区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有BPc区域，并进一步在从所述F2区域至F1区域的部分上具有LF区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有LBc区域；

所述探针核酸是具有与选自所述FP区域的序列、所述BPc区域的序列以及它们的互补序列中的序列相互补的碱基序列的大于等于一种的探针核酸；

当所述多个引物为在3’末端侧具有与所述F2区域相同序列且在5’末端侧具有与所述F1区域互补序列的FIP引物、具有与所述F3区域相同序列的F3引物、在3’末端侧具有与所述B2c区域互补序列且在5’末端侧具有与所述B1c区域相同序列的BIP引物、以及具有与所述B3c区域互补序列的B3引物、以及具有与所述LF区域互补序列的环引物LFc和/或具有与所述LBc区域相同序列的环引物LBc时，

按照下述方式将各引物设计为各区域：所述FP区域和所述F2区域、和/或所述BPc区域和所述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基，并且所述FP区域和所述LF区域、和/或所述BPc区域和所述LBc区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。

2.一种目标核酸的检测方法，其具备使用多种引物通过LAMP法来扩增目标核酸而得到扩增产物的工序和通过使所述扩增产物与探针核酸发生杂交而检测所述目标核酸的工序，其中，

所述FP区域和所述F2区域、和/或所述BPc区域和所述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基，并且FP区域和所述LF区域、和/或所述BPc区域和所述LBc区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。

3.权利要求2所述的检测方法，其中，所述探针核酸固定在固相基质上。

4.权利要求3所述的检测方法，其中，所述固相基质为DNA芯片。

5.一种单碱基突变的检测方法，其为使利用多个引物通过LAMP法将含有单碱基突变的目标核酸扩增、并使所述扩增产物与探针核酸发生杂交，其中，

所述目标核酸从5’末端侧开始依次具有F3区域、F2区域和F1区域，并从3’末端侧开始依次具有B3c区域、B2c区域和B1c区域，在从所述F2区域至F1区域的部分上具有含有所述单碱基突变的FP区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有含有所述单碱基突变的BPc区域，并进一步在从所述F2区域至F1区域的部分上具有LF区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有LBc区域；

将引物设计为：所述F2区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述B2c区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复，并且所述LF区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述LBc区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复。

6.一种单碱基突变的检测方法，其具备使用多种引物通过LAMP法来扩增含有单碱基突变的目标核酸而得到扩增产物的工序和通过使所述扩增产物与探针核酸发生杂交而检测所述目标核酸的单碱基突变的工序，其中，

所述目标核酸从5’末端侧开始依次具有F3区域、F2区域和F1区域，并从3’末端侧开始依次具有B3c区域、B2c区域和B1c区域，在从所述F2区域至F1区域的部分上具有含有单碱基突变的FP区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有含有单碱基突变的BPc区域，并进一步在从所述F2区域至F1区域的部分上具有LF区域、和/或在从所述B2c区域至B1c区域的部分上具有LBc区域；

所述F2区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述B2c区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复，并且所述LF区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述LBc区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复。

7.权利要求6所述的单碱基突变的检测方法，其中，所述探针核酸固定在固相基质上。

8.权利要求7所述的单碱基突变的检测方法，其中，所述固相基质为DNA芯片。

9.一种用于检测扩增产物的检测试剂盒，所述检测为使利用多个引物通过LAMP法将目标核酸扩增而得到的扩增产物与探针核酸发生杂交，所述试剂盒含有探针、各引物、缓冲液、链置换型DNA聚合酶和dNTP，其中，

按照下述方式将各引物设计为各区域：所述FP区域和所述F2区域、和/或所述BPc区域和所述B2c区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基，并且FP区域和所述LF区域、和/或所述BPc区域和所述LBc区域具有至少大于等于10个碱基的非重复部分且重复部分小于等于10个碱基。

10.一种用于检测单碱基突变的检测试剂盒，所述检测为使利用多个引物通过LAMP法将含有单碱基突变的目标核酸扩增、并使所述扩增产物与探针核酸发生杂交，所述试剂盒含有探针、各引物、缓冲液、链置换型DNA聚合酶和dNTP，其中，

按照下述方式将各引物设计为各个区域：所述F2区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述B2c区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复，并且所述LF区域与所述FP区域中的单碱基突变不重复、和/或所述LBc区域与所述BPc区域中的单碱基突变不重复。