CN112159836B - 一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法。该检测体系由探针A链、探针B链和扩增引物组成，包括连接和扩增两步反应。与传统等温扩增检测方法不同，本发明方法适用于包括小RNA(例如miRNAs)在内的不同长度的核酸检测，具有较好的普适性，应用广泛；且该方法设计简单，针对不同的靶标检测，可通用一套扩增引物，有效避免了繁杂的条件优化过程，操作简单，具有零背景、高灵敏度和高选择性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测方法。
背景技术
高效精准的核酸检测技术在传染病原检测、食品安全检疫和致病基因筛查等方面具有极为重要的作用。其中，聚合酶链式反应(PCR)使用最为广泛，在循环温度和聚合酶的辅助下，其能将低至单分子的片段在一小时内复制109倍，达到仪器检出水平。近年来，为降低核酸检测对严苛控温和精密仪器的依赖，发生在恒定温度下的扩增反应被视为PCR的有力替代者，更有希望实现免仪器的便携性检测。这些方法被称为“等温核酸扩增技术”，包括依赖于核酸序列扩增(NASBA)、链替换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶替换扩增(HDA)、重组酶复制扩增(RPA)等。然后，以上这些等温扩增方法大多只能直接扩增DNA，在扩增RNA时必须要加入逆转录步骤，此外由于引物设计等因素，靶标仅限于较长片段(大于100bp)的DNA和RNA，小片段核酸例如microRNAs(miRNAs)由于序列较短，仅包含18-22nt，引物设计灵活性差，缺少相应的扩增方法。大量研究发现miRNAs在各种癌症当中表达异常，与肿瘤的发生，发展和治疗密切相关，因此，miRNAs成为肿瘤检测和预后的重要生物标记物，miRNAs的检测日益重要。
最近，有研究表明通过改良传统恒温扩增反应来检测miRNA，以增加其通用性。第一种方法直接将靶标用作传统等温扩增反应的引物。Yan等人巧妙地将miRNA用作LAMP的外部引物F3，并通过荧光信号定量检测miRNA。然而，由于LAMP模板一直存在于反应系统中，该方法的背景信号相对较高，导致信噪比较低。另一种方法是基于连接酶的扩增反应，其中最为代表性的是RCA反应，其通过连接反应环化与靶标杂交的锁式探针。这种类型的等温扩增反应可以检测不同长度的核酸，但是为了促进聚合酶与锁式探针结合，靶标的游离端必须靠近挂锁探针杂交的位置，否则扩增效率将大大降低，这大大限制了靶向范围。此外，未成环的锁式探针和未结合探针的靶标会产生较高的背景信号，导致信噪比低。尽管可以利用外切酶消除未成环的锁式探针和未结合探针的靶标，但核酸外切酶的引入不仅提高了操作繁琐程度，还大大增加了反应时间，导致其实用性降低。综上所述，亟需一种简单且实用的等温放大方法，使其能够高灵敏、零背景的检测包括小RNA片段在内的核酸。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种双发夹连接介导恒温扩增的检测新方法。该方法不仅适用于小RNA(miRNAs)，同时能用于长链RNA和DNA的检测，原始模板不存在于体系中，故背景泄露低，具有高选择性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种双发夹连接介导恒温扩增的检测探针及引物组，检测探针及引物组由探针A链、探针B链、扩增引物组成；
探针A链从5’端开始依次包括1域、2域、α域、3域、1*域、4域、5域、6域及β1域，3’端含OH；α域为信号位点，β1域为第一识别位点；
探针B链从5’端开始依次包括β2域、7域及5*域，5’端带磷酸基团；β2域为第二识别位点；
其中，1域与1*域碱基互补，5域与5*域碱基互补，探针A链与探针B链可通过上述碱基互补配对形成待连接的单发夹探针(Pre-Ligation Single Hairpin Probe,简称SHP)，该单发夹探针通过第一识别位点和第二识别位点与靶标RNA/DNA碱基互补，从而拉近5’端磷酸基团和3’端羟基形成缺口，在连接酶的作用下形成包含信号位点和识别位点的可扩增的双发夹结构(Amplifiable Double Hairpin Probe，简称DHP)；
扩增引物包括引物FP、引物RP和引物LP；但引物并非仅限于三条，还可以根据DHP的不同设计更多条引物用于扩增。
本发明设计了一种以双发夹结构为基础的等温扩增方法—双发夹连接介导核酸恒温扩增(Dual Hairpin Ligation Induced Isothermal Nucleic Acid AmplificationReaction简称DHLA)，其目的在于高灵敏、零背景的检测包括小RNA片段在内的核酸。如图1所示，在存在靶标时，两条单链探针在连接酶的作用下形成完整的双发夹结构可作为扩增的起始模板，在FP引物、RP引物、DNA聚合酶的作用下，形成一系列多发夹产物，最后对扩增产物进行表征，进而可对靶标进行定量分析；在不存在靶标时，体系中无法形成完整的起始模板，RP结合B链探针后不能进一步延伸形成多发夹产物，因此可以明显降低背景信号。此外，该方法不仅适用于小片段RNA(miRNAs)的扩增，同时通过设计探针或者改变连接酶种类等方式，可对长链RNA和DNA进行检测，在检测核酸分子时具有较高的通用性和灵活性，可以实现单元分析和多元分析。
更为具体的，本发明由两条DNA单链探针组成：如图2所示，较长的探针A链呈单发夹结构，并且发夹内含信号位点，3’端含OH及识别位点；较短的B链5’端带磷酸基团及识别位点。探针A、B先利用碱基互补配对杂交形成待连接单发夹探针(SHP)，当加入目标miRNA后，SHP中分别位于A链3’端和B链5’端的识别位点由于与靶标碱基互补配对而被拉近，在连接酶的作用下形成完整的双发夹结构—可扩增的双发夹探针(DHP)，在引物FP、RP、LP存在下进行扩增反应，生成包含信号位点的多发夹产物，此信号位点作为下游的靶标，可通过荧光、电化学、比色等进行表征，在本发明中选用荧光表征方法。
引物FP和RP均包含两个域，RP用于结合双发夹结构的5*和7域，FP用于结合1域和2域的互补区域，先后引发扩增；
引物LP用于结合双发夹结构上除去FP和RP结合之外的环及环的互补序列。
作为优选，探针A链从5’端开始依次包括SEQ ID NO：1序列或SEQ ID NO：3序列中任一序列，及第一识别位点；
探针B链从5’端开始依次包括第二识别位点和SEQ ID NO：2序列。
在本发明中探针A链中除识别位点外的序列并非限定于SEQ ID NO：1序列或SEQID NO：3，探针B链中除识别位点外的序列也并非限定于SEQ ID NO：2，本领域技术人员认可的、能够形成双发夹结构的探针序列均在本发明保护范围之内。
作为优选，靶标RNA为miRNA-21，探针A链序列如SEQ ID NO：4所示，探针B链序列如SEQ ID NO：5所示，引物FP序列如SEQ ID NO：6所示，引物RP序列如SEQ ID NO：7所示，引物LP序列如SEQ ID NO：8所示；
靶标RNA为Let-7d，探针A链序列如SEQ ID NO：9所示，探针B链序列如SEQ ID NO：10所示，引物FP序列如SEQ ID NO：6所示，引物RP序列如SEQ ID NO：7所示，引物LP序列如SEQ ID NO：11所示。
作为优选，靶标RNA为长链RNA中的片段1，探针A链序列如SEQ ID NO：12所示，探针B链序列如SEQ ID NO：15所示，引物LP序列如SEQ ID NO：18所示；
作为优选，靶标RNA为长链RNA中的片段4，探针A链序列如SEQ ID NO：13所示，探针B链序列如SEQ ID NO：16所示，引物LP序列如SEQ ID NO：19所示；
作为优选，靶标RNA为长链RNA中的片段6，探针A链序列如SEQ ID NO：14所示，探针B链序列如SEQ ID NO：17所示，引物LP序列如SEQ ID NO：20所示。
作为优选，检测探针及引物组还包括信号输出探针，信号输出探针为OSD探针。但信号输出探针方式并不限定于OSD，还包括电化学信号输出等等其它能够实现检测的输出方式。
作为优选，OSD探针序列5’端修饰有荧光基团。
作为优选，荧光基团为FAM、BHQ1或ROX中的一种。
本发明还提供了一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测方法，采用上述检测探针及引物组扩增靶标RNA/DNA，包括如下步骤：
针对RNA，将探针A链、探针B链混合，于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，用于形成SHP，向混合液中加入靶标RNA，于65℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，形成三链杂交体；
针对DNA，将探针A链、探针B链和靶标DNA混合，于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，形成三链杂交体；
随后将上述混合液加入连接反应体系中进行连接，然后失活连接酶；
将连接产物加入扩增反应体系中进行扩增，检测扩增的核酸含量。
作为优选，针对RNA，连接的反应体系为：连接酶3％～7％，连接酶缓冲液8％～12％，RNA inhibitor 2.0％～3.0％，三链杂交体15％～25％；
作为优选，针对DNA，连接反应体系为：连接酶3％～7％，连接酶缓冲液8％～12％，三链杂交体15％～25％；
连接反应程序为：于28～32℃反应25～35min。
在本发明提供的具体实施例中，连接反应体系为连接酶5％，连接酶缓冲液10％，三链杂交体20％，RNA inhibitor 2.5％(针对DNA，体系中可不加RNA inhibitor)。
作为优选，扩增反应体系如下：
探针A链，在体系中最终浓度为50～700pM；
探针B链，在体系中最终浓度为50～700pM；
2μL引物混合液，[FP]＝[RP]＝0.8μM＝2[LP])；
1μL 10mM dNTPs，0.5μL 100mM Mg2+，5μL 5M betaine；
2.5μL荧光探针混合液，包含50nM荧光探针和100nM猝灭探针；
反应缓冲液补足至25μL；
扩增反应程序为：于63℃反应。
在本发明提供的具体实施例中，所述扩增反应体系如下：
探针A链，在体系中最终浓度为80pM或者640pM；
探针B链，在体系中最终浓度为80pM或者640pM；
2μL引物混合液，[FP]＝[RP]＝0.8μM＝2[LP])；
1μL 10mM dNTPs，0.5μL 100mM Mg2+，5μL 5M betaine；
2.5μL荧光探针混合液，浓度分别为50nM FAM和100nM BHQ1；
反应缓冲液补足至25μL；
扩增反应程序为：于63℃孵育。
本发明提供了一种双发夹连接介导恒温扩增的检测引物及探针组合和核酸检测方法。该检测探针及引物组由探针A链、探针B链和一系列引物组成。本发明的积极进步效果在于：DHLA作为一种灵敏特异的等温扩增反应，使用酶连接以DNA/RNA为夹板的两条DNA链，用于形成双发夹结构，该方法不仅适用于小RNA(miRNAs)，同时能用于长链RNA和DNA的检测。并且与其他类似检测方法相比，原始模板不存在于体系中，背景泄露低，具有高选择性。DHLA除此之外，还具有以下优点：
1.设计简单：只需三个引物，一个识别探针和一个信号探针；对不同的靶标检测时只需更换识别探针的局部序列；
2.操作简单：只需两个步骤，即可进行恒温扩增；
3.普适性强：适用于二十至几百碱基的DNA和RNA；
4.应用广泛：适用于肿瘤标志物分析、基因分型和鉴定、突变点检测等；
5.灵敏度高：检测限(LOD)在aM水平；
6.灵活度高：支持多元分析和多元化信号输出；
7.优势独特：RNA检测无需反转录过程；对长序列了实施多靶点同时锚定，达到降低假阴性，提高灵敏度等目的。
附图说明
图1DHLA示意图；
图2基于DHP的指数扩增及荧光信号输出；
图3miRNA-21检测的动力学荧光曲线；
图4多探针靶向法；
图5DHLA检测COVID-19S RNA的片段1；
图6DHLA检测COVID-19S RNA的片段4；
图7DHLA检测COVID-19S RNA的片段6；
图8多探针靶向法用于抵抗长链RNA降解；
图9基于DHLA的多元分析示意图；
图10以FAM为信号输出的miRNA-21检测；
图11以ROX为信号输出的Let-7d检测；
图12MCF-7，HeLa和HEK293T细胞系中miRNA-21的检测；
图13健康组和癌变组血样中的miRNA-21检测。
具体实施方式
本发明公开了一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
miRNA-21的编码基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(vacuole membraneprotein-1,VMP1)编码区，VMP1基因的第十个内含子。VMP1也被称为跨膜蛋白49(transmenbrane protein-49，TMEM-49)。根据文献报道，多种肿瘤标本以及细胞系都检测出miRNA-21表达水平异常升高，包括乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、胶质瘤和胆管癌等，因此miRNA-21是一个公认的致癌性小RNA。
Let-7最早是在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现的miRNA之一。在C.elegans里，Let-7家族由Let-7、mir-48、mir-84和mir-241组成，编码了4个发育调控miRNA。Let-7长约21nt，它是从一个具有茎环折叠结构、70个核苷酸前体分子发展而来的。Let-7具有高度保守性、时序性、组织细胞特异性，受到发育和空间的调控，并参与细胞增殖、分化、死亡。Let-7是目前研究最多的miRNA分子之一，在多种疾病发生中表达下调。Let-7d作为Let-7家族的重要成员，参与胰腺癌、前列腺癌及头颈部癌等多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学过程。
本发明提供的双发夹连接介导恒温扩增的检测引物及探针组合和核酸检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
为了验证本发明引物探针组合及扩增方法的可行性，利用本发明体系对miRNA-21进行检测。
miRNA-21序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
检测miRNA-21所用的探针AmiRNA-21、BmiRNA-21链序列如下:
AmiRNA-21(SEQ ID NO：4)：
BmiRNA-21(SEQ ID NO：5)：
注：方框中碱基序列为与靶标序列互补的序列。
为了使DHLA反应高效发生，对引物浓度、引物组分、反应温度进行了优化，得到的最优条件如下：三种引物浓度：[FP]＝[RP]＝0.8μM＝2[LP]；扩增反应的最佳温度为63℃。优化所用的引物和OSD探针序列如下：
FP(SEQ ID NO：6)：
GTCCATCGAGGATGTCGAGTTGCCGCAGTACTGGTAGAGG
RP(SEQ ID NO：7)：
GGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGAC
LP(SEQ ID NO：8)：CAGTCAACATCAGTCTGA
OSD-F：(FAM)CGCGCTGGGTCGACTGGTTCAACCATCGCCG
OSD-Q：TGAACCAGTCGACCCAGCGCG(BHQ1)
在最优条件的基础上，对miRNA-21进行检测，反应过程如下：
首先，将AmiRNA-21、BmiRNA-21两探针的混合液于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，用于形成SHPmiRNA-21，向其中加入miRNA-21于65℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温。随后将上述混合液加入连接反应体系中，SplintR连接酶5％，连接酶缓冲液10％，RNAinhibitor2.5％，三链杂交体20％。将上述反应液于30℃反应30min，置于65℃孵育20min以失活SplintR连接酶。取2μL加入扩增反应中，反应体系如下：2μL引物混合液([FP]＝[RP]＝0.8μM＝2[LP])，1μL 10mM dNTPs，0.5μL 100mM Mg2+，5μL 5M betaine，2.5μL荧光探针混合液(50nM F和100nM Q)，最终体积为25μL反应缓冲液中(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，pH 8.8)。反应最终各组分浓度如下：[AmiRNA-21]＝[BmiRNA-21]＝640pM，[miRNA-21]＝0/4aM/40aM/400aM/4fM/40fM/400fM/4pM/40pM。于63℃孵育120min，每隔1.5min读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线(图3)，该反应体系在保证零背景情况下检测限可达4aM。
实施例2
本发明不仅适用于短链RNA，同样适用于长链RNA的检测，具有较好的通用性。传统的等温扩增如RT-LAMP，NASBA等均需要200-300nt的RNA模板，但即便在超低温条件下长链RNA也容易发生降解，最终导致检测灵敏度下降。DHLA仅用靶向长链RNA中约20nt左右的片段即可对其进行检测，通过在长链RNA上设计多个靶向位点，可有效抵抗由于RNA降解带来的检测损失，示意图见图4。
探针A链序列如下：
探针B链序列如下：
LP1：CAGGGATCTGAAAACTTT(SEQ ID NO：18)
LP4：CAGTGTTAGACTTCTCAG(SEQ ID NO：19)
LP6：CAGCTAGAATAAACTCTG(SEQ ID NO：20)
反应体系如下：将探针A1、B1混合液，探针A4、B4混合液，及探针A6、B6混合液分别于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，用于形成SHP。分别加入长链RNA于65℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温。其余条件同miRNA检测体系。反应最终各组分浓度如下：[A]＝[B]＝640pM，[RNA]＝0/7.2pM。扩增反应温度于63℃孵育90min，并每1.5min读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线(图5，6，7)。检测结果发现，探针SHP1、SHP4、SHP6均能产生荧光信号，可实现对长链RNA的检测，证明仅通过改变识别位点，DHLA即可以检测不同的靶标物质，具有较好的通用性。此外，本发明特有的优势在于，当遇到长链RNA中有某一待测片段被降解时，可以通过使用多探针靶向法进行检测。如图8所示，在保证检测零背景的情况下，反应体系中加入探针SHP1混合液、探针SHP4混合液、探针SHP6混合液，其中[A]＝[B]＝80pM，[RNA]＝0/7.2pM，当片段1被降解，片段4和6完整时，可在SplintR连接酶的作用下形成DHP4和DHP6，进而开启下游的扩增反应，避免了传统等温扩增对完整模板的依赖。
实施例3
本发明还具有灵活度高、支持多元化信号输出的特点。如图9所示，miRNA-21和Let-7d共存时可在SplintR连接酶作用下分别形成DHPmiRNA-21和DHPLet-7d，引发下游扩增反应，进而产生对应的FAM和ROX信号，实现单管多靶标检测。多元分析反应体系如下：
首先，将探针AmiRNA-21、BmiRNA-21混合液，及探针ALet-7d、BLet-7d混合液分别于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，用于形成SHPmiRNA-21和SHPLet-7d。然后，将SHPmiRNA-21和SHPLet-7d混匀，同时加入miRNA-21和Let-7d于65℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，其余条件同miRNA-21检测体系。在保证检测零背景的情况下，最终体系[AmiRNA-21]＝[BmiRNA-21]＝[ALet-7d]＝[BLet-7d]＝80pM，[miRNA-21]＝[Let-7d]＝0/40pM，扩增反应温度在63℃孵育90min，每隔1.5min读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线(图10，11)，由图可知对于miRNA-21和Let-7d检测互不干扰，可在单管中通过不同波长的荧光进行表征。综上所述，DHLA体系具有较强的灵活性，支持多元化信号输出。
Let-7d序列为：AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU
检测Let-7d的探针序列如下：
ALet-7d链(SEQ ID NO：9)：
BLet-7d链(SEQ ID NO：10)：
LP(SEQ ID NO：11)：CAGAACTATGCAACCT
OSD-ROX链：
(ROX)CGCGCTGGGTCGACTGGTTCACGTGCGCGAG
检测实例1
利用本发明分别对人胚胎肾细胞293(HEK293T)、宫颈癌细胞(Hela)、乳腺癌细胞(MCF-7)中的miRNA-21进行检测。反应体系如下：首先，将AmiRNA-21、BmiRNA-21两探针的混合液于95℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温，用于形成SHPmiRNA-21。然后加入384ng/μL总RNA提取液于65℃孵育5min后，以0.1℃/s降至室温。将上述混合液加入连接反应体系中，SplintR连接酶5％，连接酶缓冲液10％，RNA inhibitor 2.5％，三链杂交体20％。于30℃反应30min，65℃孵育20min以失活SplintR连接酶。取2μL加入扩增反应中，反应体系如下：2μL引物混合液([FP]＝[RP]＝0.8μM＝2[LP])，1μL 10mM dNTPs，0.5μL 100mM Mg2+，5μL 5M betaine，2.5μL荧光探针混合液(包括50nM F和100nM Q)，最终体积为25μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.8)。反应最终各组分浓度如下：[AmiRNA-21]＝[BmiRNA-21]＝640pM，总RNA提取液浓度均为2ng/μL。于63℃孵育90min，每隔1.5min读取一次荧光强度数值，最终获得荧光检测曲线(图12)，可知MCF-7和Hela相对于HEK293T均过度表达miRNA-21。
检测实例2
为了验证本发明的实用性，还利用其对血液中的miRNA-21进行检测，通过采集3组健康人和3组癌症患者的血液样本，利用本发明DHLA方法分别对以上6个样本进行检测，检测体系同miRNA-21，将荧光检测曲线进行处理，得到较为直观的柱状图(图13)，可看出健康组的POI(Point of Inflection)均晚于癌症组，证明相比于健康组，癌症组血液中的miRNA-21过度表达。
综上所述，本发明作为一种灵敏特异的等温扩增反应，可对真实样品(细胞系和血液)进行检测，有望用于临床研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法
<130> MP2022859
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg cggcgatggt tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
<210> 2
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 120
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
<210> 4
<211> 129
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg cggcgatggt tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
tcaacatca 129
<210> 5
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtctgataag ctaatcgtct cggctagtgc attgatcaaa cccggcaagc cc 52
<210> 6
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg 40
<210> 7
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggcttgccg ggtttgatca atgcactagc cgagac 36
<210> 8
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtcaacat cagtctga 18
<210> 9
<211> 129
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg ctcgcgcacg tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
aactatgca 129
<210> 10
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acctactacc tctatcgtct cggctagtgc attgatcaaa cccggcaagc cc 52
<210> 11
<211> 16
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagaactatg caacct 16
<210> 12
<211> 129
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg cggcgatggt tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
ggatctgaa 129
<210> 13
<211> 129
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg cggcgatggt tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
tgttagact 129
<210> 14
<211> 129
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtccatcgag gatgtcgagt tgccgcagta ctggtagagg cggcgatggt tgaaccagtc 60
gacccagcgc gcgaactcga catcctcgat ggaccgccag ggcttgccgg gtttgatcag 120
ctagaataa 129
<210> 15
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aactttgtca gggatcgtct cggctagtgc attgatcaaa cccggcaagc cc 52
<210> 16
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctcagtgga agcatcgtct cggctagtgc attgatcaaa cccggcaagc cc 52
<210> 17
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actctgaact cacatcgtct cggctagtgc attgatcaaa cccggcaagc cc 52
<210> 18
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagggatctg aaaacttt 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagtgttaga cttctcag 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagctagaat aaactctg 18
Claims (9)
1.一种双发夹连接介导恒温扩增的检测探针及引物组组合，其特征在于，所述检测探针及引物组由探针A链、探针B链、扩增引物组成；
所述探针A链从5’端开始依次包括1域、2域、α域、3域、1*域、4域、5域、6域及β1域，3’端含OH；所述α域为信号位点，所述β1域为第一识别位点；
所述探针B链从5’端开始依次包括β2域、7域及5*域，5’端带磷酸基团；所述β2域为第二识别位点；
其中，1域与1*域碱基互补，5域与5*域碱基互补；探针A链与探针B链可通过上述碱基互补配对形成待连接的单发夹探针，该单发夹探针通过第一识别位点和第二识别位点与靶标RNA碱基互补，从而拉近5’端磷酸基团和3’端羟基形成缺口，在连接酶的作用下形成包含信号位点和识别位点的可扩增的双发夹结构；
所述扩增引物包括引物FP、引物RP和引物LP；
引物FP和RP均包含两个域，RP用于结合探针B链的5*域和7域，FP用于结合1域和2域的互补区域，先后引发扩增；
引物LP用于结合探针A链和探针B链上除去FP和RP结合之外的环及环的互补序列。
2.根据权利要求1所述的检测探针及引物组组合，其特征在于，所述探针A链从5’端开始依次包括SEQ ID NO：1所述序列或SEQ ID NO：3所述序列中任一序列，及第一识别位点；
所述探针B链从5’端开始依次包括第二识别位点和SEQ ID NO：2所述序列。
3.根据权利要求1所述的检测探针及引物组组合，其特征在于，
靶标RNA为长链RNA中的片段1，探针A链序列如SEQ ID NO：12所示，探针B链序列如SEQID NO：15所示，引物LP序列如SEQ ID NO：18所示；
靶标RNA为长链RNA中的片段4，探针A链序列如SEQ ID NO：13所示，探针B链序列如SEQID NO：16所示，引物LP序列如SEQ ID NO：19所示；
靶标RNA为长链RNA中的片段6，探针A链序列如SEQ ID NO：14所示，探针B链序列如SEQID NO：17所示，引物LP序列如SEQ ID NO：20所示。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测探针及引物组组合，其特征在于，所述检测探针及引物组还包括信号输出探针序列，所述信号输出探针序列为OSD探针序列。
5.根据权利要求4所述的检测探针及引物组组合，其特征在于，所述OSD探针序列5’端修饰有荧光基团。
6.根据权利要求5所述的检测探针及引物组组合，其特征在于，所述荧光基团为FAM、BHQ1或ROX中的一种。
7.一种非诊断目的的双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测方法，其特征在于，采用权利要求1至6中任一项所述检测探针及引物组扩增靶标RNA，包括如下步骤：
针对RNA，将探针A链、探针B链混合，于95 ℃孵育5 min后，以0.1 ℃/s降至室温，用于形成SHP，向混合液中加入靶标RNA，于65 ℃孵育5 min后，以0.1 ℃/s降至室温，形成三链杂交体；
随后将上述三链杂交体混合液加入连接反应体系中进行连接，然后失活连接酶；
将连接产物加入扩增反应体系中进行扩增，检测扩增的核酸含量。
8.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于，针对RNA，所述连接反应体系包括：连接酶5%，连接酶缓冲液10%，RNA inhibitor2.5%，三链杂交体20%；
连接反应程序为：于30℃反应30min。
9.根据权利要求7或8所述的核酸检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系如下：
探针A链，在体系中最终浓度为80pM 或640 pM；
探针B链，在体系中最终浓度为80 pM或640pM；
2 μL引物混合液，[FP]=[RP]=0.8 μM=2[LP]；
1 μL 10 mM dNTPs，0.5 μL 100 mM Mg2+，5 μL 5 M betaine；
2.5 μL 荧光探针混合液，包含50 nM 荧光探针和100 nM 猝灭探针；
反应缓冲液补足至25 μL；
扩增反应程序为：于63 ℃反应。
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