CN102286623A - 一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，其原理是将叠氮溴化乙锭与环介导恒温核酸扩增技术相结合，根据结核分枝杆菌保守基因IS6100序列设计四条特异性引物，采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝，通过加入SYBRGreenI观察颜色变化来判断扩增与否。本发明方法检测时间短、特异性强、灵敏度高，对结核分枝杆菌死活菌的鉴定准确率达99%以上，可广泛应用于临床和疾控部门的检测鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种利用环介导等温核酸扩增技术快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法。
背景技术
结核病至今仍然是全球范围内对人类健康危害最严重的细菌性传染病之一，据世界卫生组织统计，全世界现有结核病人2 000万,每年新发生约900万例，每年死亡300万人，约1/ 3人群有潜伏性结核分枝杆菌感染。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病呈日益严重回升趋势。
至今，死菌活菌的鉴定，一直是微生物检测的重大难题之一。由于只有活性的结核分枝杆菌才具有传染性和侵袭力，但是目前对结核分枝杆菌的多种检测方法，从涂片镜检为主的微生物学诊断方法（国家标准 GB/T 14926.48-2001），到特异抗原的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法，都均难以进行结核分枝杆菌死活菌的鉴定。目前涂片技术为抗酸染色，死亡的结核分枝杆菌也能被着色，因此无法区分；免疫学检测技术是利用抗原抗体的特异性结合，死亡的结核分枝杆菌仍然具有抗原的一般特性；作为基因诊断的PCR技术，以DNA为检测靶点， DNA在死亡的结核分枝杆菌样本中仍然存在；培养技术虽然能够区分死菌与活菌，但是结核分枝杆菌培养周期长达56日，无法满足目前对快速检测的要求。
叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)是一种只能进入具有不完整细胞膜的死细胞中的DNA分子核酸染料。死细胞暴露于EMA仅需1min的时间，便可以渗透细胞壁或细胞膜与其中的DNA结合，使其不能发生扩增反应。
环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, 简称LAMP）克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异、高效、快速的核酸扩增，具有很多的优点，在63～65℃温度下进行循环链置换反应，0.5至1.5小时即可进行结果判断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将叠氮溴化乙锭与环介导恒温核酸扩增技术相结合快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，该方法检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高，适用于临床和疾控部门的检测鉴定。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，包括如下步骤：
（1）样品的预处理：取待检样品，加入终浓度为10至1000μg/mL的叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)，暗处放置1~100min；然后暴露在500~1000W的卤素灯下照射10秒~10分钟，此过程在冰浴上进行；所述待检样品为已鉴定含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；
（2）模板DNA制备：取上述处理过的样品，提取DNA；
（3）恒温基因扩增反应：反应体系为25μl，包括4条特异性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO4，1~10M的甜菜碱，1~5μl 模板DNA，1~8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl，混匀；于60～65℃下，扩增60～80分钟；
（4）结果判断：在上述反应产物中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌；
步骤（3）所述特异性引物选自以下5组引物中任一组，其中外引物1的浓度为0.1~10mM，外引物2的浓度为0.1~10mM，内引物1的浓度为1~10mM，内引物2的浓度为1~10mM：
引物组1：
外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ ID No.1）
外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ ID No.2）
内引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ ID No.3）
内引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ ID No.4）；
引物组2：
外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ ID No.5）
外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ ID No.6）
内引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ ID No.7）
内引物2：AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC（SEQ ID No.8）；
引物组3
外引物1：ACGATGGCCACCTCCA（SEQ ID No.9）
外引物2：CGGGTTTGATCAGCTCGG（SEQ ID No.10）
内引物1：CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA（SEQ ID No.11）
内引物2：CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA（SEQ ID No.12）；
引物组4
外引物1：ATCGATCCGGTTCAGCG（SEQ ID No.13）
外引物2：AGTAGGCAGCCTCGAGTTC（SEQ ID No.14）
内引物1：AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA（SEQ ID No.15）
内引物2：AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA（SEQ ID No.16）；
引物组5
外引物1：GAGTCGATCTGCACACAGC（SEQ ID No.17）
外引物2：GAGTTTGGTCATCAGCCGT（SEQ ID No.18）
内引物1：TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT（SEQ ID No.19）
内引物2：GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT（SEQ ID No.20）。
优选的，上述一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，步骤（2）中的反应体系包括0.2mM外引物1，0.2mM外引物2，1.6mM内引物1，1.6mM内引物2， 1.6mM的dNTPs，6mM的MgSO4，1M的甜菜碱，3μl 模板DNA， 8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl。
本发明将叠氮溴化乙锭与环介导恒温核酸扩增技术相结合，根据结核分枝杆菌保守基因IS6100序列设计四条特异性引物，采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109~1010个拷贝，通过加入SYBR Green I观察颜色变化来判断扩增与否。
本发明具有以下有益效果：
（1） 对设备的要求低：只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；
（2） 高特异性：根据结核分枝杆菌保守基因IS6100序列设计四条特异性引物，特异识别靶基因序列上的六个独立区域，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9％，假阳性率小于0.1％；
（3） 快速、高效扩增：扩增在不到2小时即可完成，且产率高；
（4） 灵敏度高：用于病原微生物的检测和传染病的诊断中，对结核分枝杆菌的最低检测极限达到10个细胞以内，标本的检出率达到97％；
（5） 鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤；
（6） 用途广：可广泛用于临床和疾控部门的检测鉴定。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所用样品是已鉴定为结核分枝杆菌患者的痰液或支气管灌洗液。当然，在实际操作中，也可以采用其他已鉴定含有结核分枝杆菌的样品，或者分离的结核分枝杆菌。
实施例1 引物设计
根据结核分枝杆菌保守基因IS6100序列设计引物，并通过实验筛选得到下列5组特异性引物：
引物组1：
外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ ID No.1）；
外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ ID No.2）；
内引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ ID No.3）；
内引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ ID No.4）。
引物组2：
外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ ID No.5）；
外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ ID No.6）；
内引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ ID No.7）；
内引物2：AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC（SEQ ID No.8）。
引物组3
外引物1：ACGATGGCCACCTCCA（SEQ ID No.9）；
外引物2：CGGGTTTGATCAGCTCGG（SEQ ID No.10）；
内引物1：CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA（SEQ ID No.11）；
内引物2：CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA（SEQ ID No.12）。
引物组4
外引物1：ATCGATCCGGTTCAGCG（SEQ ID No.13）；
外引物2：AGTAGGCAGCCTCGAGTTC（SEQ ID No.14）；
内引物1：AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA（SEQ ID No.15）；
内引物2：AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA（SEQ ID No.16）。
引物组5
外引物1：GAGTCGATCTGCACACAGC（SEQ ID No.17）；
外引物2：GAGTTTGGTCATCAGCCGT（SEQ ID No.18）；
内引物1：TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT（SEQ ID No.19）；
内引物2：GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT（SEQ ID No.20）。
以下实施例可选用上述5组引物的任一组对结核分枝杆菌的死活进行快速鉴定，均可达到本发明的技术效果。
实施例2 结核分枝杆菌死活鉴定
1、样品预处理
本实施例中所用样品是已鉴定为结核分枝杆菌患者的痰液，将样品按以下步骤进行处理：
（1）取2ml结核病患者痰液于管中，在痰样标本中加入1～2倍痰样体积的4%的NaOH；
（2）每隔2min涡旋振荡15s，处理15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中，12000r/min离心15min，去上清液；
（3）加入0.9%的NaCl 1ml，洗涤，12000r/min离心5min，去上清液；
（4）加入终浓度为100μg/mL的EMA样本处理液，暗处放置10min；
（5）随后整管暴露在650W的卤素灯下，照射90s。
2、模板DNA制备：
（1）沸水中煮上述处理过的样品20分钟后立即置于冰上冷却10分钟；
（2）10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。
3、环介导等温核酸扩增反应
反应体系为25μl，包括4条特异性引物，1.6mM的dNTPs，6mM的MgSO4，1M的甜菜碱，3μl模板DNA， 8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl，混匀；于63℃下，扩增60分钟。
所述4条特异性引物选自实施例1的引物组1，4条引物的序列如SEQ ID No.1~4所示。其中内引物1的浓度为1.6mM，内引物2的浓度为1.6mM，外引物1的浓度为0.2 mM，外引物2的浓度为0.2 mM。
4、结果判断
在反应产物中加入1μl 显色剂（1×SYBR Green I），混匀，静置5min。若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌。
在本实施例中，反应产物呈绿色，说明待检样品中存在活的结核分枝杆菌。
将待检样品接种于改良罗氏培养基上，37℃培养6周，观察结果，结果与LAMP检测结果相一致。
实施例3 结核分枝杆菌死活鉴定
1、样品预处理
本实施例中所用样品是已鉴定为结核分枝杆菌患者的支气管灌洗液作为样品，按以下步骤进行处理：
（1）取5ml结核病患者的支气管灌洗液于管中，1000rpm离心2分钟，去上清；
（2）加入终浓度为100μg/mL的EMA样本处理液，暗处放置10min；
（3）随后整管暴露在650W的卤素灯下，照射5min。
2、模板DNA制备：
（1）沸水中煮上述处理过的样品20分钟后立即置于冰上冷却10分钟；
（2）10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。
3、环介导等温核酸扩增反应
反应体系为25μl，包括4条特异性引物，2mM的dNTPs，10mM的MgSO4，2M的甜菜碱，5μl 模板DNA， 8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl，混匀；于63℃下，扩增60分钟。
所述4条特异性引物选自实施例1中的引物组2。 4条引物的序列如SEQ ID No.5~8所示。其中内引物1的浓度为2mM，内引物2的浓度为2mM，外引物1的浓度为0.5 mM，外引物2的浓度为0.5mM。
4、结果判断
在反应产物中加入2μl 显色剂（1×SYBR Green I），混匀，静置5min。若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌。
在本实施例中，反应产物呈橙色，说明待检样品中不存在活的结核分枝杆菌。
将待检样品接种于改良罗氏培养基上，37℃培养6周，观察结果结果与LAMP检测结果相一致。
<110> 广东省结核病控制中心
广州迪澳生物科技有限公司
<120> 一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法
<130>
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
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tcatcgccga tcatcagg 18
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<213> 人工引物
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cgagtttggt catcagccg 19
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<212> DNA
<213> 人工引物
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tggtcgtagt aggtcgatgg ggagtcgatc tgcacacagc t 41
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<213> 人工引物
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tgcgcgatgg cgaactcaag gcaccgtaaa caccgtag 38
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<213> 人工引物
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actacgacca catcaaccg 19
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<213> 人工引物
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tcagcgatcg tggtcct 17
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cgggcaccgt aaacaccgta cgatggcgaa ctcaaggag 39
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<212> DNA
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agtgtggcta accctgaacc gagtttggtc atcagccgtt c 41
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acgatggcca cctcca 16
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cgggtttgat cagctcgg 18
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ctcgctgaac cggatcgatg tggaaggcgt actcgacctg a 41
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caggcatcca accgtcggtt cgtctcggct agtgca 36
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atcgatccgg ttcagcg 17
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agggcttgcc gggtttgatc aatgcactag ccgagacga 39
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aggatgtcga gttggccacc tcgccgcagt actggta 37
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gagtcgatct gcacacagc 19
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gagtttggtc atcagccgt 19
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tgagttcgcc atcgcgcatg ccgatcgccc cat 33
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gtccacgccg ccaactacgc tcgatgccct cacggt 36
Claims (2)
1.一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品的预处理：取待检样品，加入终浓度为10至1000μg/mL的叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)，暗处放置1~100min；然后暴露在500~1000W的卤素灯下照射10秒~10分钟，此过程在冰浴上进行；所述待检样品为已鉴定含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；
（2）模板DNA的制备：取上述处理过的样品，提取DNA作为模板DNA；
（3）恒温基因扩增反应：反应体系为25μl，包括4条特异性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO4，1~10M的甜菜碱，1~5μl 模板DNA，1~8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl，混匀；于60～65℃下，扩增60～80分钟；
（4）结果判断：在上述反应产物中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌；
步骤（3）所述特异性引物选自以下5组引物中任一组，其中外引物1的浓度为0.1~10mM，外引物2的浓度为0.1~10mM，内引物1的浓度为1~10mM，内引物2的浓度为1~10mM：
引物组1：
外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ ID No.1）
外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ ID No.2）
内引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ ID No.3）
内引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ ID No.4）；
引物组2：
外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ ID No.5）
外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ ID No.6）
内引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ ID No.7）
内引物2：AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC（SEQ ID No.8）；
引物组3
外引物1：ACGATGGCCACCTCCA（SEQ ID No.9）
外引物2：CGGGTTTGATCAGCTCGG（SEQ ID No.10）
内引物1：CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA（SEQ ID No.11）
内引物2：CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA（SEQ ID No.12）；
引物组4
外引物1：ATCGATCCGGTTCAGCG（SEQ ID No.13）
外引物2：AGTAGGCAGCCTCGAGTTC（SEQ ID No.14）
内引物1：AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA（SEQ ID No.15）
内引物2：AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA（SEQ ID No.16）；
引物组5
外引物1：GAGTCGATCTGCACACAGC（SEQ ID No.17）
外引物2：GAGTTTGGTCATCAGCCGT（SEQ ID No.18）
内引物1：TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT（SEQ ID No.19）
内引物2：GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT（SEQ ID No.20）。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，其特征在于，步骤（2）中的反应体系包括0.2mM外引物1，0.2mM外引物2，1.6mM内引物1，1.6mM内引物2， 1.6mM的dNTPs，6mM的MgSO4，1M的甜菜碱，3μl 模板DNA， 8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105274193A (zh) * | 2014-08-12 | 2016-01-27 | 沈阳国际旅行卫生保健中心 | 一种结核杆菌lamp法恒温快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN105483214A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-04-13 | 北京博瑞立安生物技术有限公司 | 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用 |
| CN108277265A (zh) * | 2017-01-05 | 2018-07-13 | 周兰嗣 | 一种识别一样本中活菌细胞的方法 |
| CN112159836A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-01 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101157954A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-04-09 | 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 | 基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法 |
| CN101736081A (zh) * | 2008-11-24 | 2010-06-16 | 广州迪澳生物科技有限公司 | 结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN101935693A (zh) * | 2010-01-18 | 2011-01-05 | 广州华峰生物科技有限公司 | 结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法 |
| CN101942511A (zh) * | 2010-08-20 | 2011-01-12 | 华南理工大学 | 原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒 |
-
2011
- 2011-08-25 CN CN2011102463095A patent/CN102286623A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101157954A (zh) * | 2007-09-13 | 2008-04-09 | 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 | 基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法 |
| CN101736081A (zh) * | 2008-11-24 | 2010-06-16 | 广州迪澳生物科技有限公司 | 结核分枝杆菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN101935693A (zh) * | 2010-01-18 | 2011-01-05 | 广州华峰生物科技有限公司 | 结核分枝杆菌检测试剂盒及其使用方法 |
| CN101942511A (zh) * | 2010-08-20 | 2011-01-12 | 华南理工大学 | 原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KNUT RUDI等: "Use of Ethidium Monoazide and PCR in Combination for Quantification of Viable and Dead Cells in Complex Samples", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| YUXIA LU等: "Specific Detection of Viable Salmonella cells by an Ethidium Monoazide-Loop Mediated Isothermal Amplification(EMA-LAMP) Method", 《JOURNAL OF HEALTH SCIENCE》 * |
| 鲁玉侠等: "EMA-LAMP 方法快速检测死/ 活的食源性沙门氏菌", 《食品科学》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105274193A (zh) * | 2014-08-12 | 2016-01-27 | 沈阳国际旅行卫生保健中心 | 一种结核杆菌lamp法恒温快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN105483214A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-04-13 | 北京博瑞立安生物技术有限公司 | 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用 |
| CN108277265A (zh) * | 2017-01-05 | 2018-07-13 | 周兰嗣 | 一种识别一样本中活菌细胞的方法 |
| CN112159836A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-01 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种双发夹连接介导恒温扩增的核酸检测新方法 |
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