CN101157954A - 基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法 - Google Patents

基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法 Download PDF

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赵金伟
钱志娟
房超
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Abstract

本发明属于临床医学领域，公开了一种基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法。是一种基于环介导的等温扩增技术原理对痰液中的结核分枝杆菌进行核酸检测。通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在一系列质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对痰掖中的结核分枝杆菌进行筛查或检测。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。

Description

基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法
技术领域
本发明属于临床医学领域，涉及一种结核分枝杆菌核酸筛查方法。更具体地说是一种基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法。
背景技术
结核病是由于感染结核杆菌引起的慢性传染病，在人类历史上，结核病和天花、鼠疫、霍乱等烈性传染病一样，曾经在全世界广泛流行。20世纪50年代，随着抗结核的化疗药物问世，结核病的流行趋势在发达国家得到一定控制。但近年来由于种种原因，有的国家和地区结核病疫情大幅回升，严重危害人类健康，成为全球重大公共卫生问题。1993年4月23日，在伦敦召开的第46届世界卫生大会上，世界卫生组织(WHO)史无前例地宣布“全球结核病处于紧急状态”。1998年，WHO再次发出“遏制结核病行动刻不容缓”的呼声，号召全球紧急行动起来，加强对结核病的预防控制工作。世界卫生组织还将3月24日定为世界防治结核病日。
有资料显示，一个未经治疗的排菌的活动性肺结核患者，一年内可传染15～20名健康人。在2004年的“世界防治结核病日座谈会”上，专家们疾呼采取切实有效措施，及早发现并彻底治愈传染性病人，遏制结核病的传播。
目前肺结核的诊断方法主要是临床症状加上痰结核菌检查。痰结核菌检查方法目前主要有三种：(1)痰涂片检查。痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核的″金指标″，但阳性率低是其主要缺陷。(2)痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6-8周，应用受到限制，同时由于肺结核结合属于呼吸道传播的烈性传染病，对实验室安全要求较高，不利于结核杆菌的普遍筛查。(3)聚合酶链反应(PCR)，特异性较差，优点是敏感性可达98％～100％，同时其需要PCR扩增仪、凝胶电泳等相关贵重设备，不利于基层医疗防疫机构及现场快速测定。
21世纪初，Notomi T等开发了一种新颖的恒温核酸扩增理论，即所谓的环介导恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率可达到109-1010个拷贝。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速、廉价(不需要特定的贵重检测设备，只需要简单结构的恒温箱)、易检测(直接进行目测判断)等特点。
通过该项技术可以达到以下目的：一是检测能力进一步提高，LAMP检测技术的检测限高于涂片法100-200倍，这样就有力地解决了传统的的抗酸染色阳性检出率较底的问题(有关文献表明：30％左右)；二是由于经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术对仪器设备要求较高(如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等)、技术较为复杂，不利于其在基层医疗防疫、检验检疫机构的普遍应用，而LAMP检测技术具有仪器设备要求检测(只需要简单结构的恒温箱)、检测时间短(0.5-1.0小时)、特异性高(针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，)等特点，可以使用基因扩增技术在基层医疗防疫机构及现场监测中广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，能迅速、简便、经济的筛查检测结核分枝杆菌核酸。
本发明是这样实现的：一种基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，利用环介导等温扩增技术LAMP来进行，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对痰液中结核分枝杆菌进行核酸筛查或检测。
所述的用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域是指结核分支杆菌的特定靶核酸序列区域。
进一步地，在本发明所述的筛查检测方法中，在LAMP痰液筛查过程中引入了引阳性对照检测系统，阳性对照质控品为相同于扩增靶基因的DNA，阴性对照质控品为不相同于扩增靶基因的DNA，并使用时间分辨浊度法或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法(波长302nm)同时检测内对照和结核分枝杆菌靶基因扩增产物。
进一步地，本发明所述的特异性引物选自：结核分枝杆菌引物：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
在现有的关于LAMP技术的公开文献中，没有将LAMP(含上述结核分枝杆菌引物)用于痰液中结核分枝杆菌筛查的报道。本发明通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在一系列质控检测体系的帮助下，从分子水平对痰液中结核分枝杆菌进行核酸筛查或检测。
本发明具有严格的鉴别筛查诊断体系，以保证检测结果的准确性。该鉴别筛查诊断系统由阳性和阴性质控品，内对照质控品以及相关扩增和检测体系组成。
本发明中鉴别筛查诊断系统的阳性和阴性质控品是每批实验检测结果是否有效的重要标志。对于每批实验，必须引入一个阴性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果；对于每批实验，必须引入一个结核分枝杆菌阳性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性反应。针对结核分枝杆菌的阳性质控品是人工构建的包含结核分枝杆菌待检靶序列的质粒DNA。
本发明鉴别诊断系统中的特异性扩增产物均通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可选用不同厂家，不同型号的产品，也可委托相关的基因公司合成。所有引物按照LAMP引物设计原则，通过日本荣研化学网站(www.eiken.co.jp)上引物设计软件设计。本发明鉴别诊断系统中的LAMP体系及反应程序均由发明人设计，结核分枝杆菌的核酸特异性引物序列、LAMP反应体系及反应程序如下：
一、结核分枝杆菌特征性引物，共5套。
1.
  名称   序列1     长度
  F3B3FIPBIPLoop FLoop B   CCACGCCTCCGGCATAAGGGGTTCCGACTTCTCATCATACGCGTCCGAGTCGAACTT-GACCGTCGACGTGGTGACTGGTGGTCTGCACGGCGT-CCGTCGCGCTTGATCTCGCCGGCATGTAGTTGTGTCAGTGTCGGTGGTTAACGCGCTAT     161939362022
2.
  名称   序列2     长度
  F3B3FIPBIPLoop B   GACGTGGTGATGACACAACTCTTGCTTGAGGCCCAGGGACGCCGTGCAGACCACCAG-CATGCCGGCGGCAAGTGCGTGTCGGTGGTTAACGCG-CTGAGACCACTCGTACCCGTCTATCCACCCGGCTCGAA     2017364018
3.
  名称   序列3     长度
  F3B3FIP8IPLoop FLoop B   GACGTGGTGATGACACAACTGAACCGCACCGTTGACCTAACCACCGACACGCCGACG-GCAAGTTCGACTCGGACGCTCGAGATCAAGCGCGACGGG-CCTTGCTTGAGGCCCAGGGCAGACCACCAGATATCGCATACTACGAGTGGTCTCAGGTTTATGA     201739382323
4.
  名称   序列4     长度
  F3B3FIPBIPLoop FLoop B   CTGGGCCTCAAGCAAGGCGACGTCGCTGACCACTTCGGGCGACGGTTTCGAAGTCG-GAAGACGGGGTCAACGGTCGGCTGCAAGAGATGGCGT-CTTGGGTCACCCTCTCGTTATTCCGTGGTTTCGAAAACAGCGGGCTGACCATCAACCTGAC     171839372320
5.
 名称   序列5     长度
 F3B3FIPBIPLoop FLoop B   GCGATATCTGGTGGTCTGCCCGTGGTTTCGAAAACAGCAGACCACTCGTACCCGTCGCTTTTCGGTGGTTAACGCGCTATATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGTTTTACCGTTGACCCCGTCTTCTTGATCTCGACTTCGAGCCCCTCAAGCAAGGGGCG     191941441916
二、本发明包括的结核分枝杆菌核酸的LAMP反应体系组成及反应程序如下：
反应体系：
 序号     组份   加入量(μl)
  12 ddH2O(双蒸水)10×Bst buffer(10倍浓缩的Bst DNA     8.02.0
3456789    聚合酶反应体系)10mM dNTP(脱氧核糖核苷酸)25mM MgCl2(氯化镁)PCR Enhancer(PCR反应增强剂)引物混合物Bst DNA聚合酶模板合计 1.04.81.21.01.01.020
三、扩增程序：65℃ 1小时→80℃ 5分钟→4℃保存
四、检测：荧光显色：LAMP扩增的每个管中加入1.0μl 20×Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影。也通过LA-200以及配套的LA-200 Program Ver0.18软件，获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果。
本发明的优点是：方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示了LAMP反应在Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影，肉眼观察结果。模板浓度：10-110-210-310-410-510-610-7空白10-110-210-310-410-510-610-7空白。
图2显示了通过可以通过LA-200以及配套的LA-200 Program Ver0.18软件，获得实时的反应液中浊度的变化数据。
具体实施方式
鉴别诊断系统的检测方法，依次按下述步骤进行：
(1)核酸提取：将病人痰液一部分用于Ziehl-Neelse染色，剩余痰液中加入等量4％NaOH和2.94％Tri-SodiumCitrate(含1％的N-乙酰-L-半胱胺酸)，室温静置20min使之充分液化至清亮，之后将痰液最终制成在20ml磷酸缓冲液中，4000r/min离心20min，洗涤2次，沉淀悬浮于2ml相同缓冲液中，取出处理好的痰液标本，在14000r/min下离心15min，将沉淀中加入100ul裂解液，100℃下温育30min，在14000r/min下离心3min，上清保存于-20℃，直到使用为止。
(2)LAMP反应：准备上述反应体系(10人份，不含结核分枝杆菌DNA提取物)，将反应体系混允，分装到0.2ml的PCR反应管中，每管19ul，PCR反应管中分别加入(1)步骤抽提的模板，每管1ul，阳性对照品和阴性对照品各1ul，分别作阳性对照、阴性对照，混合均匀。放入实时浊度仪或恒温水浴箱，设定反应条件：65℃，60分钟，80℃ 5分钟终止反应，4℃保存，加Smartgreen荧光染料紫外灯下显色(波长302nm)。
(3)结果判定：本发明扩增产物的检测采用浊度法。在Mg2+作用下，LAMP扩增产成的长链核酸分子能相互交联成絮状沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。因此实验结果的判定有如下两种方法：
定性观察：在反应结束后，实验结果可以通过肉眼观察Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影(见图1)。
实时检测：可以通过LA-200以及配套的LA-200 Program Ver0.18软件，获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果(见图2)
图1显示了LAMP反应在Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下(波长302nm)显影，肉眼观察结果。
图2显示了通过可以通过LA-200以及配套的LA-200 Program Ver0.18软件，获得实时的反应液中浊度的变化数据。

Claims (6)

1.一种基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，利用环介导等温扩增技术LAMP来进行，其特征在于，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对痰液中结核分枝杆菌进行核酸筛查或检测。
2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，其特征在于所述的用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域是指结核分支杆菌的特定靶核酸序列区域。
3.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，其特征在于所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控品为相同于扩增细菌靶基因的DNA，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用时间分辨浊度法或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测阴阳对照和结核分枝杆菌靶基因扩增产物。
4.根据权利要求1或3所述的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，其特征在于，荧光染色紫外灯显色波长为302nm。
5.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，其特征在于，所述的特异性引物均选自：结核分枝杆菌引物：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6，结核分枝杆菌特征性引物，共5套。
6.根据权利要求1、或2所述的基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法，其特征在于，所用的LAMP反应体系是由下述一系列通过优化的反应成分组成：
双蒸水ddH2O                    8.0μL
10倍浓缩的Bst DNA聚合酶反应体系10×Bst buffer  2.0μL
10mM脱氧核糖核苷酸dNTP         1.0μL
氯化镁25mM MgCl2               4.8μL
PCR Enhancer(PCR反应增强剂)    1.2μL
引物混合物                     1.0μL
Bst DNA聚合酶                  1.0μL
模板                           1.0μL。
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