CN108531624A - 结核分枝杆菌环介导等温扩增引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于病原分子检测领域，涉及结核分枝杆菌的环介导等温扩增引物、检测方法及试剂盒。检测方法其步骤包括：引物设计：根据结核分枝杆菌特异性基因gyrB的序列的六个区域设计三对特异引物；结核分枝杆菌总DNA提取；环介导等温扩增反应；环介导等温扩增反应产物分析。若扩增产物变为蓝绿色则为结核分枝杆菌阳性，若扩增产物为黄褐色则为结核分枝杆菌阴性。本发明的内容还包括含有上述扩增引物及试剂盒。本发明灵敏度高，检测下限为10个拷贝的阳性质粒；检测速率高，仅需1小时即可得到结果；实用性高，不需要昂贵的精密仪器。

Description

结核分枝杆菌环介导等温扩增引物、检测方法及试剂盒

技术领域

属于病原分子检测领域，涉及结核分枝杆菌的环介导等温扩增检测方法及试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，早期诊断、及时治疗是有效控制结核病传播蔓延，恢复结核病患者健康的关键。

目前，结核病的临床诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等结果。其中传统检测方法存在灵敏度低、耗时长等不足，容易对部分患者造成误诊或漏诊。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定的单克隆抗体，否则准确性不够，仅能作为辅助检测手段。因此能否提供快速、高敏、特异、简便、可靠、适合临床应用的检测技术已成为国内外研究的重点。

环介导等温扩增，英文名称为loop-mediatedisothermal amplification，是2000年由日本科学家Notomi T. 首次在Nucleic Acids Research 杂志上报道的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法具有以下特点：具有较强的特异性，只有当引物组与靶序列的6-8个区域都同时匹配上时才能有效扩增；反应体系稳定可靠且有良好的抗干扰能力，在室温下放置2周后仍然有效，对于样品中原有的或被污染的干扰片段不敏感，而这是其它核酸扩增技术无法做到的；敏感性较高，扩增快速、高效，1h内扩增产物量可达约10¹⁰拷贝数，扩增效率和检测灵敏度可比普通PCR高10-100倍左右；结果鉴别相对简便，多样化，如检测反应管的沉淀浊度、检测反应管颜色变化等方法能判断扩增与否。LAMP技术对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，更适宜现场检测或条件较差的基层使用。

发明内容

本发明提供一种快速检测、特异性好、结果直观准确的结核分枝杆菌环介导等温扩增法检测方法和试剂盒

本发明技术方案如下：

用于结核分枝杆菌环介导等温扩增引物，根据该菌特异性基因gyrB的序列的六个区域设计三对特异引物，所述引物如下：

FIP、BIP引物，序列分别为： SEQ ID NO.1～2;

F3、B3引物，序列分别为：SEQ ID NO.3～4;

LF、BF引物，序列分别为：SEQ ID NO.5～6.

进一步地，本发明的结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，还包括以下试剂：DNA快速提取试剂、阴性对照品、阳性对照品、显色试剂、Bst DNA聚合酶及反应液。

进一步地，所述DNA快速提取试剂为Easy Extract（重庆威斯腾生物有限公司提供）。

进一步地，所述阴性对照品为生理盐水，所述阳性对照品为含有gyrB基因质粒，所述目的基因序列为SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述显色试剂为钙黄绿素与氯化锰混合物，其配方为50 μM钙黄绿素溶液与500 μM氯化锰溶液等比例混合。

进一步地，所述反应液含有以下试剂：1.4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×Isothermal Amplification Buffer ⅡFIP/BIP引物各1.6 μM, F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4μΜ。

进一步地，结核分枝杆菌环介导等温扩增检测方法，其步骤包括：

(1) 结核分枝杆菌总DNA提取：取1ml 液化的痰液( 或拭子冲洗液) 样本转移到离心管中，12,000r/min离心5min 去除上清液收集沉淀，加入DNA快速提取液80μL，56℃水浴10min，98℃水浴2min，-20℃保存；

(2) 环介导等温扩增反应体系为：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 2. 5μL 10×Isothermal Amplification Buffer Ⅱ, 8U Bst 3.0 NDA Polymerase，2μL模板，FIP/BIP引物各1.6 μM ，F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4μM，显色试剂1μL，ddH2O补齐至25μL；将上述所有试剂置于PCR 管中，65℃水浴40min扩增，80℃水浴10min终止反应；

(3) 环介导等温扩增反应产物分析：若扩增产物变为蓝绿色则为结核分枝杆菌阳性，若扩增产物为黄褐色则为结核分枝杆菌阴性。

附图说明

图1 为结核分枝杆菌基因组经过环介导等温扩增后的琼脂糖凝胶电泳图（M：DL2000 DNA Marker；CK-：阴性对照样本；CK+：阳性对照样本；gyrB为结核分枝杆菌扩增基因）。

图2 为不同菌种基因组经过环介导等温扩增后的反应管内颜色图（CK-：阴性对照样本；CK+：阳性对照样本；编号1-5分别为：结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡糖球菌、粪肠球菌和白念珠菌）。

具体实施例

【实施例 1】标片段、引物设计

通过NCBI数据库查找结核分枝杆菌的基因序列，选择gyrB基因的保守序列作为靶标（Gene ID: 887081），通过LAMP 在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/e/index.html)设计六个区域的三对引物具体序列如下：

FIP、BIP引物，序列分别为： SEQ ID NO.1～2;

F3、B3引物，序列分别为：SEQ ID NO.3～4;

LF、BF引物，序列分别为：SEQ ID NO.5～6.

【实施例 2】结核分枝杆菌环介导等温扩增检测方法

1、基因组提取

本试剂盒提供的DNA快速提取试剂为重庆威斯腾生物有限公司提供的Easy Extract，提取步骤如下：取1ml 液化的痰液( 或拭子冲洗液) 样本转移到离心管中，12,000r/min离心5min 去除上清液收集沉淀，加入DNA快速提取液80μL，56℃水浴10min，98℃水浴2min，-20℃保存；

2、扩增体系

组分及反应条件如下：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 2. 5μL 10×IsothermalAmplification Buffer Ⅱ, 8U Bst 3.0 NDA Polymerase，2μL模板，FIP/BIP引物各1.6 μM ，F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4μM，显色试剂1μL，ddH2O补齐至25μL；将上述所有试剂置于PCR 管中，65℃水浴40min扩增，80℃水浴10min终止反应。

3、扩增结果分析：

扩增产物变为蓝绿色则为结核分枝杆菌阳性，若扩增产物为黄褐色则为结核分枝杆菌阴性。

【实施例 3】特异性、准确性验证

采用本发明的试剂盒分别对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测，并通过琼脂糖凝胶电泳对结果进行验证。

琼脂糖凝胶电泳检测方法：取4μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液(购自TAKARA 公司)，混匀，在1.5% (w/v) 琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min ，用溴化乙锭(EB) 染色后，在凝胶成相系统上成像，观察是否有梯形条带。

分别收集培养的结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡糖球菌、粪肠球菌和白念珠菌，按照本试剂盒提供的方法，提取菌液基因组，进行环介导等温扩增检测，分别进行颜色观察检测以及琼脂糖凝胶电泳检测。

检测结果：结果显示是有结核分枝杆菌经过扩增之后反应管有颜色的变化，并且与琼脂糖凝胶电泳结果相符，说明本发明有较好的特异性及准确性。

序列表

<110> 重庆高圣生物医药有限责任公司

<120> 结核分枝杆菌环介导等温扩增引物、检测方法及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

cttcttcccg gccttcagcc ttttgcagtg acccggaatt cg 42

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

aaggaagacg gcattcagcg gttttgtctc ccacaactcc ttagc 45

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

gccgctgtac aaactcaagt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

accgagggat ccatggtg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

gcagtgaccc ggaattcg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

gtctcccaca actccttagc 20

<210> 7

<211> 220

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

gtgtttttgg cacaaccgcc gctgtacaaa ctcaagtggc agcgcagtga cccggaattc 60

gcatactccg accgcgagcg cgacggtctg ctggaggcgg ggctgaaggc cgggaagaag 120

atcaacaagg aagacggcat tcagcggtac aagggtctag gtgaaatgga cgctaaggag 180

ttgtgggaga ccaccatgga tccctcggtt cgtgtgttgc 220

Claims (7)

1.用于结核分枝杆菌环介导等温扩增引物，其特征在于：根据该菌特异性基因gyrB的序列的六个区域设计三对特异引物，所述引物如下：

FIP、BIP引物，序列分别为： SEQ ID NO.1～2;

F3、B3引物，序列分别为：SEQ ID NO.3～4;

LF、BF引物，序列分别为：SEQ ID NO.5～6 。

2.结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及以下试剂：DNA快速提取试剂、阴性对照品、阳性对照品、显色试剂、Bst DNA聚合酶及反应液。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述DNA快速提取试剂为Easy Extract（重庆威斯腾生物有限公司提供）。

4.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为生理盐水，所述阳性对照品为含有gyrB基因的质粒，所述目的基因序列为SEQID NO.7所示。

5.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述显色试剂为钙黄绿素与氯化锰混合物，其配方为50 μM钙黄绿素溶液与500 μM氯化锰溶液等比例混合。

6.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述反应液含有以下试剂：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×Isothermal AmplificationBuffer Ⅱ, FIP/BIP引物各1.6 μM, F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ。

7.结核分枝杆菌环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

(1) 结核分枝杆菌总DNA提取：，取1ml 液化的痰液( 或拭子冲洗液) 样本转移到离心管中，12,000r/min离心5min 去除上清液收集沉淀，加入DNA快速提取液80μL，56℃水浴10min，98℃水浴2min，-20℃保存；

(2) 环介导等温扩增反应体系为：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×IsothermalAmplification Buffer Ⅱ, 8U Bst 3.0 DNA Polymerase，2 μL模板，FIP/BIP引物各1.6μM ，F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4μM，显色试剂1μL，ddH₂O补齐至25μL；将上述所有试剂置于PCR 管中，65℃水浴40min扩增，80℃水浴10min终止反应；

(3) 环介导等温扩增反应产物分析：若扩增产物变为蓝绿色则为结核分枝杆菌阳性，若扩增产物为黄褐色则为结核分枝杆菌阴性。