CN103451309B - 分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种分枝杆菌属检测试剂盒，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的分枝杆菌属检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。

Description

分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法
本申请为申请日：2012年9月19日，申请号：201210352230.5，发明名称：分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长的趋势，因而得名。本菌属种类较多，可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。
结核分枝杆菌（M.tuberculosis），俗称结核杆菌或结核菌，是引起结核病的病原菌。结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。
与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86.4%，牛结核分枝杆菌占2.5%，非结核分枝杆菌占11.1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4.9%，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需1～2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌属的快速鉴定对结核病及非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
传统分枝杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应（PCR）技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应（realtimePCR）技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增（IsothermalAmplification）核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术（LAMP）具有很多的优越性。
因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的分枝杆菌属检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的分枝杆菌属检测试剂盒。
本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种分枝杆菌属检测试剂盒，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的两对引物为
外引物F3：（SEQIDNO1）
TCATCACCGTCGAGGAGTC
外引物B3：（SEQIDNO2）
CGGCTCCGATGACCTTCTC
内引物FIP：（SEQIDNO3）
GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
内引物BIP：（SEQIDNO4）
AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG；
或
外引物F3’：（SEQIDNO5）
AGTCCATCGGTGACCTGATC
外引物B3’：（SEQIDNO6）
AGGACCGCCTCCTGAC
内引物FIP’：（SEQIDNO7）
GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA
内引物BIP’：（SEQIDNO8）
GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT；
或
外引物F3”：（SEQIDNO1）
TCATCACCGTCGAGGAGTC
外引物B3”：（SEQIDNO9）
AGCGGCAGCAGRTCCT
内引物FIP”：（SEQIDNO10）
CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC
内引物BIP”：（SEQIDNO4）
AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG；
其中，V代表A/C/G，R代表A/G。
本发明针对分枝杆菌属的hsp65基因设计引物，所述hsp65基因为65kDa热休克蛋白（heatshockprotein）基因，由于该基因高度保守并广泛存在于各分枝杆菌属菌种中，因此其引物能够扩增并检测出结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌所有菌种，包括：结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、田鼠分枝杆菌（M.microti）、非洲分枝杆菌（M.africanum）、牛分枝杆菌（M.bovis）、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）、胞内分枝杆菌（M.intracellulare）、龟分枝杆菌（M.chelonae）、偶发分枝杆菌（M.fortuitum）、戈登分枝杆菌（M.gordonae）、海分枝杆菌（M.marinum）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）、土分枝杆菌（M.terrae）、鸟分枝杆菌（M.avium）、草分枝杆菌（M.phlei）、瘰疠分枝杆菌（M.scrofulaceum）、脓肿分枝杆菌（M.abscessus）、溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）、施氏分枝杆菌（M.shimoidei）、亚洲分枝杆菌（M.asiaticum）、蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）、胃分枝杆菌（M.gastri）。
作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的优选实施方式，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的更优选实施方式，
所述的BstDNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL；
所述的反应液含：1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-HCl、10～12.5mmol/LKCl、10～12.5mmol/L（NH4）2SO4、8～10mmol/LMgSO4、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；
所述的样品预处理液含：10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2体积%TritonX-100；
所述的显色液为SYBRGreenI或EvaGreen；
所述稳定液为石蜡油；
所述的阳性对照为BCG基因组DNA；
所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.2～2.0μmol/L。
作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的最优选实施方式，
所述的BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL；
所述的反应液含：2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L（NH4）2SO4、10mmol/LMgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；
所述的样品预处理液含：20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、2mmol/LEDTA和1.2体积%TritonX-100；
所述的显色液为SYBRGreenI；
所述的内引物FIP/BIP的浓度为0.2μmol/L；
所述的外引物F3/B3的浓度为1.6μmol/L。
作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的优选实施方式，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
作为本发明分枝杆菌属检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。
环介导恒温扩增技术（LAMP）是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效率超强，表现在两个方面：（1）灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；（2）扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μg，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极其容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。
本发明还提供一种分枝杆菌属检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：
（1）将待测样品离心，去上清，得到沉淀；
（2）将步骤（1）的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；
（3）在反应容器中加入BstDNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；
（4）在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤（3）中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
作为本发明使用分枝杆菌属检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤（3）中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。
本发明所说的基于环介导恒温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,简称LAMP）快速检测分枝杆菌属的方法，是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物（即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63～65℃）条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的hsp65基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测分枝杆菌属的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
下列缩略语适用于本发明：
LAMP：loop-mediatedisothermalamplification，环介导恒温扩增
dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸
Bst酶：BstDNApolymerase(largefragment)，BstDNA聚合酶（大片段）
EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸
DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸
Betaine：甜菜碱
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚
hsp65：65kDa热休克蛋白
BCG：卡介苗
实施例1试剂盒的制备
（1）按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
外引物F3：（SEQIDNO1）
TCATCACCGTCGAGGAGTC
外引物B3：（SEQIDNO2）
CGGCTCCGATGACCTTCTC
内引物FIP：（SEQIDNO3）
GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
内引物BIP：（SEQIDNO4）
AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
（V代表A/C/G）
（2）购置DNA聚合酶：BstDNA聚合酶置于容器；
（3）配制反应液和引物：反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L（NH4）2SO4、10mmol/LMgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.2μmol/L和外引物F3/B3各0.25μmol/L，置于容器；
（4）配制样品预处理液：样品预处理液含有20mmol/LTris-HCl（pH80）、2mmol/LEDTA和1.2体积%TritonX-100，置于容器；
（5）购置稳定液：石蜡油，置于容器；
（6）购置显色液：SYBRGreenI，置于容器；
（7）提取阳性对照：提取BCG基因组DNA，置于容器；
（8）将上述7个容器装成试剂盒，封装。
制备工艺简述如下：
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将上述（2）～（4）步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。
实施例2试剂盒的制备
（1）按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：
外引物F3：（SEQIDNO1）
TCATCACCGTCGAGGAGTC
外引物B3：（SEQIDNO2）
CGGCTCCGATGACCTTCTC
内引物FIP：（SEQIDNO3）
GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
内引物BIP：（SEQIDNO4）
AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
（V代表A/C/G）
（2）购置DNA聚合酶：BstDNA聚合酶置于容器；
（3）配制反应液和引物：反应液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/LKCl、10mmol/L（NH4）2SO4、8mmol/LMgSO4、0.1体积％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.2μmol/L和外引物F3/B3各0.25μmol/L，置于容器；
（4）配制样品预处理液：样品预处理液含有10mmol/LTris-HCl（pH8.0）、1mmol/LEDTA和1.0体积%TritonX-100，置于容器；
（5）购置稳定液：石蜡油，置于容器；
（6）购置显色液：EVAGreenI，置于容器；
（7）提取阳性对照：提取BCG基因组DNA，置于容器；
（8）将上述7个容器装成试剂盒，封装。
其他同实施例1。
实施例3试剂盒的制备
其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤（1）中的引物为：
外引物F3’：（SEQIDNO5）
AGTCCATCGGTGACCTGATC
外引物B3’：（SEQIDNO6）
AGGACCGCCTCCTGAC
内引物FIP’：（SEQIDNO7）
GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA
内引物BIP’：（SEQIDNO8）
GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT
实施例4试剂盒的制备
其他条件与实施例1相同，其不同仅在于步骤（1）中的引物为：
外引物F3”：（SEQIDNO1）
TCATCACCGTCGAGGAGTC
外引物B3”：（SEQIDNO9）
AGCGGCAGCAGRTCCT
内引物FIP”：（SEQIDNO10）
CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC
内引物BIP”：（SEQIDNO4）
AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
（V代表A/C/G，R代表A/G）
实施例5分枝杆菌属检测试剂盒的应用
一、方法和材料
1、菌株
本发明采用菌株有29株，主要来源于美国标准生物品收藏中心、中国药品生物制品检定所。详见表1。
表1菌株名称及来源
2、样品处理（模板DNA提取）
（1）吸取培养菌液1mL，12000rpm离心2min，获得菌体沉淀；
（2）在上述菌体沉淀中加入100μLDNA提取液I，沸水浴10min，加入12.5μLDNA提取液II，稍混匀；12000rpm离心2min，上清即为即为样品模板DNA。
3、环介导恒温扩增技术的反应过程
（1）在200μL反应管配制反应体系：反应液和引物共22μL，BstDNA聚合酶0.5μL（4U），稳定液30μL，模板DNA2.5μL。
（2）将配制好的反应管于65℃恒温反应1小时。
4、反应后处理
向上述反应产物中加入2μLSYBRGreenI，混匀，同时也向阳性对照管（BCG基因组DNA）和阴性对照管（去离子水）中加入SYBRGreenI混匀，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。
5、电泳
配制0.2%琼脂糖凝胶电泳。以SYBRGreenI作为染料进行显色反应观察结果。
6、特异度试验
纯菌株LAMP检测用LAMP方法对29株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。
7、灵敏度试验
将M.bovisBCG精提核酸，用TE做10倍倍比连续梯度稀释至10-10，进行LAMP检测。
8、重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。
二、结果
1、特异度试验
4株结核分枝杆菌复合群检测结果阳性，17株非结核分枝杆菌检测结果阳性，结核疫苗BCG阳性，7株非分枝杆菌均为阴性，如表2所示。结果显示试剂盒具有高特异性。
表2检测结果
检测样品 结果
M.tuberculosisH37Rv（ATCC27294） 阳性
M.microti（ATCC19422） 阳性
M.africanum（ATCC25420） 阳性
M.bovis（ATCC19210） 阳性
M.kansassi（ATCC12478） 阳性
M.intracellulare（ATCC13950） 阳性
M.chelonae（ATCC14472） 阳性
M.fortuitum（ATCC6481） 阳性
M.gordonae（ATCC14470） 阳性
M.marinum（ATCC927） 阳性
M.smegmatis（ATCC19420） 阳性
M.terrae（ATCC19619） 阳性
M.avium（ATCC25291） 阳性
M.phlei（ATCC11758） 阳性
M.scrofulaceum（ATCC19981） 阳性
M.abscessus（ATCC19977） 阳性
M.ulcerans（ATCC19423） 阳性
M.shimoidei（ATCC27962） 阳性
M.asiaticum（ATCC25276） 阳性
M.xenopi（ATCC19250） 阳性
M.gastri（ATCC15754） 阳性
M.bovisBCG 阳性
金黄色葡萄球菌 阴性
志贺氏菌 阴性
副溶血弧菌 阴性
沙门氏菌 阴性
单核增生李斯特菌 阴性
小肠结肠炎耶尔森氏菌 阴性
乙型溶血链球菌 阴性
阳性对照 阳性
阴性对照 阴性
2、灵敏度试验
细菌原液浓度为1.26×106CFU/mL，LAMP方法可检测到第4个稀释度，为1.26×102CFU/mL。
电泳结果也符合上述结果。
3、重复性试验
特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。
实施例6采用反应管的分枝杆菌属检测试剂盒
本实施例的分枝杆菌属检测试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试剂盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中：空腔A内装有22.0μL的LAMP反应液和0.5μL的BstDNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2.0μL的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20℃保存。
本实施例采用反应管作为容器，对分枝杆菌属进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤：
取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2.5μL，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。
将上述反应管均于65℃恒温反应1h。
反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均匀后观察。
若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。
在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒包括以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP’/BIP’和外引物F3’/B3’，所述的两对引物为
外引物F3’：
AGTCCATCGGTGACCTGATC
外引物B3’：
AGGACCGCCTCCTGAC
内引物FIP’：
GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA
内引物BIP’：
GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT。
2.根据权利要求1所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
3.根据权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，
所述的BstDNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL；
所述的反应液含：1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-HCl、10～12.5mmol/LKCl、10～12.5mmol/L(NH4)2SO4、8～10mmol/LMgSO4、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；
所述的样品预处理液含：10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2体积％TritonX-100；
所述的显色液为SYBRGreenI或EvaGreen；
所述稳定液为石蜡油；
所述的阳性对照为BCG基因组DNA；
所述的内引物FIP’/BIP’各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3’/B3’的浓度各为1.2～2.0μmol/L。
4.根据权利要求3所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，
所述的BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL；
所述的反应液含：2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/LMgSO4、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；
所述的样品预处理液含：20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、2mmol/LEDTA和1.2体积％TritonX-100；
所述的显色液为SYBRGreenI；
所述的内引物FIP’/BIP’的浓度各为0.2μmol/L；
所述的外引物F3’/B3’的浓度各为1.6μmol/L。
5.根据权利要求2、3或4所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的分枝杆菌属检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
6.根据权利要求5所述的分枝杆菌属检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。
7.一种使用如权利要求2所述的分枝杆菌属检测试剂盒的用于非疾病诊断目的的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；
(2)将步骤(1)的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；
(3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA4.5～9体积份数、内引物FIP’/BIP’各2体积份数、外引物F3’/B3’各4体积份数，恒温反应；
(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤(3)中的内引物FIP’/BIP’和外引物F3’/B3’为以分枝杆菌属的hsp65基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
8.根据权利要求7所述的使用分枝杆菌属检测试剂盒的用于非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。
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