CN116287324B - 一种检测空间芽孢杆菌的引物、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测空间芽孢杆菌的引物、试剂盒及应用，针对以空间环境中广泛存在的芽孢杆菌作为研究对象，采用环介导等温扩增检测技术(LAMP)，来实现对空间环境微生物的检测。建立环介导等温扩增(LAMP)反应体系，设计了芽孢杆菌引物并验证了引物特异性，优化了扩增体系中甜菜碱、镁离子和dNTP浓度，并确定了最优的LAMP反应体系。

Description

一种检测空间芽孢杆菌的引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及微生物鉴定技术领域，具体涉及一种检测空间芽孢杆菌的引物、试剂盒及应用。

背景技术

空间站具有恒温密闭的条件，为微生物的生长繁殖提供了有利条件。通过对和平号空间站、国际空间站以及中国空间站的研究可以得知，微生物在空间站中广泛存在，会危害航天员的健康和空间站设备的稳定运行，对航天安全具有巨大威胁。有研究表明，芽孢杆菌是中国空间站微生物群落中的优势细菌属，具有抗逆性强的特性，会腐蚀航天器材料，部分芽孢杆菌还具有致病性。因此，需要对空间站中的芽孢杆菌进行检测，为空间芽孢杆菌的预防和控制奠定基础。

目前空间站采用的微生物检测方法为生化培养法，首先通过棉签或培养基接触碟对空间站表面进行采样，通过空气采样器对空间站中的空气进行采样，通过水收集器对空间站中的水体进行采样，然后进行微生物培养以及后续的分析检测。传统的生化检测具有耗时、费力的弊端，需要将空间站中的样品送回地面分析，检测周期长；并且可培养的微生物种类十分有限，导致检测结果有局限性；此外，使用培养基接触碟进行在轨检测，需要在空间站中培养微生物，有可能造成二次污染。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)作为目前应用最广泛的核酸扩增技术，可在短时间内对核酸进行大量扩增，理论上适用于空间站中微生物的在轨检测。但是PCR需要在变温条件下进行，对仪器要求较高，在空间站条件下难以实现，因此目前并未广泛应用于空间微生物检测。环介导等温扩增技术(Loop-mediated IsothermalAmplification,LAMP)是现有的等温扩增技术之一，在2000年被日本学者Notomi提出。这种技术可在60-65℃恒温条件下，通过外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及Bst DNA聚合酶的作用，对模板DNA进行大量快速的扩增，并且具有特异性好、灵敏度高、体系简单、检测方式多样等优点。LAMP技术不需要变温条件，仅需要简单的恒温装置，相较于PCR技术更为方便快捷，降低了应用于空间站的难度，有望用于空间站中微生物的在轨检测。

基于国际空间站(International Space Station，ISS)之前的研究报道和本实验室对中国空间站环境的生态调研得知，空间环境中芽孢杆菌的丰度最高，抗逆性最强，且大多变异后具有腐蚀空间材料的特性。因此开发一种适用于空间环境的芽孢杆菌快速定量检测技术，非常有必要。但由于地面环境中芽孢杆菌不属于重点关注微生物，也不是医学领域的常见条件致病菌，所以并没有报道针对芽孢杆菌设计LAMP扩增的引物。本发明设计了一套适用于空间芽孢杆菌的LAMP引物，可以特异性检测空间站中的芽孢杆菌，适用于在轨检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测芽孢杆菌的内标准基因。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测芽孢杆菌的LAMP引物及试剂盒。

一种用于检测芽孢杆菌的基因是16S rRNA基因序列中的部分保守性序列，具体为SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明提供了上述基因序列在检测芽孢杆菌中的应用。

本发明提供一种检测空间芽孢杆菌的引物组合，引物组合选择以下a)-e)之一：

a)

b)

c)

d)

e)

本发明提供一种检测空间芽孢杆菌的检测试剂盒，包括下述引物组合和辅助检测试剂。

引物组合1：

引物组合2：

引物组合3：

引物组合4：

引物组合5：

所述辅助检测试剂包括：甜菜碱、镁离子、dNTP、Bst DNA聚合酶和10×ThemopolBuffer中的一种或多种。

所述10×Themopol Buffer包括MgSO₄、KCl、Tris-HCl、Tween 20、(NH₄)₂SO₄。

其中检测芽孢杆菌的靶标检测序列如SEQ ID NO：1所示。

本申请提供一种空间环境中的芽孢杆菌的检测方法，使用引物组合1或上述试剂盒对待测芽孢杆菌样本进行环介导等温扩增。

所述环介导等温扩增的扩增温度为60～65℃，扩增时间为40～80min。

本申请的引物组合在检测芽孢杆菌中的应用，以及本申请开发的检测试剂盒及检测方法在芽孢杆菌检测及鉴定中的应用。上述芽孢杆菌可以是空间芽孢杆菌。

本发明具有的技术效果为：

(1)本申请解决了目前空间站中使用生化培养的方法检测微生物耗时费力的弊端，开发了LAMP恒温扩增技术检测芽孢杆菌；

(2)本申请不需要将空间站中的样品送回地面分析，大大缩短了检测周期；

(3)本申请解决了可培养的微生物种类受限的难题，本方法无需培养，可直接检测；同时避免了使用培养基替代装置，需要在空间站中培养微生物，有可能造成的二次污染。

(4)本申请的引物组合具有强特异性和空间芽孢杆菌的适用性，可以严格区分空间微生物的种属。

附图说明

图1五对LAMP引物的荧光扩增曲线，0为阴性对照，1-5分别代表设计的五对引物)。

图2甜菜碱浓度优化。M：Marker III；1:0mM；2:100mM；3:200mM；4:300mM；5:400mM；6:500mM；7:600mM；8:700mM；9:800mM。

图3Mg²⁺浓度优化。M：Marker III；1：空白阴性对照；2：0mM；3：2mM；4：4mM；5：6mM；6：8mM；7：10mM；8：12mM；9：14mM；10：16mM。

图4dNTP浓度优化.M：Marker III；1：空白阴性对照；2：0mM；3：0.4mM；4：0.8mM；5：1.2mM；6：1.4mM；7：1.6mM；8：2.0mM；9：2.4mM；10：2.8mM。

图5引物组合1检测不同空间菌株LAMP扩增结果。M：Marker；0：Nuclease-freeWater；1：Bacillus sp.；2：Kytococcus sp.；3：Staphylococcus aureus strain；4：Acinetobacter sp.；5：Bacillus flexus strain；6：Paenibacillus agaridevoransstrain；7：Staphylococcus pasteuri strain；8：Staphylococcus sp.；9：Micrococcusluteus strain。

图6引物组合1对9株不同空间芽孢杆菌LAMP扩增适应性结果。1：Bacilluspumilus strain HN-30；2：Bacillus flexus strain HN-27；3：Bacillusamyloliquefaciens strain HN-26；4：Bacillus amyloliquefaciens strain HN-24；5：Bacillus sp.HN-15；6：Bacillus circulans strain HN-13；7：Bacillus pumilus strainHN-10；8：Bacillus aryabhattai strain HN-9；9：Bacillus altitudinis strain HN-8。

图7引物组合1对7株不同空间芽孢杆菌LAMP扩增适应性结果。1：Bacillusaltitudinis strain HN-8；2：Bacillus aryabhattai strain HN-9；3：Bacillus pumilusstrain HN-10；4：Bacillus circulans strain HN-13；5：Bacillus sp.HN-15；6：Bacillusamyloliquefaciens strain HN-24；7：Bacillus flexus strain HN-27。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 LAMP引物设计

LAMP反应的两个关键点分别是目标基因的选取和特异性引物的设计，目的基因的选取是特异性引物设计的基础，也为后期可否重复检测，确保一类菌属特异性检测密切相关。利用LAMP特异性扩增的特点，针对空间站中常见的9种芽孢杆菌(表1)进行特异性引物设计，针对其16S rRNA基因区域序列设计出具有高度特异性的引物片段，从而实现对目标菌属的LAMP扩增，在选取目的过程中，要避免所选的16S rRNA基因序列与其它菌属出现较高同源情况，防止发生非特异扩增，具体设计过程如下：

可从NCBI GeneBank数据库中找到空间站中常见菌种的16S rRNA基因序列，然后利用MEGA7.0软件将芽孢杆菌的16S rRNA基因序列与空间站中其它出现的常见菌种的16SrRNA基因序列进行同源性对比，从中挑选出较保守的序列作为鉴定芽孢杆菌的靶基因，经筛选后的目标片段长度为225bp，具体序列如下表2所示。依据筛选出的芽孢杆菌保守序列，通过PrimerExplorer V5在线引物设计网页(网址为http://primerexplorer.jp/e/)设计了5组引物，引物序列如表3所示。

表1 空间站中常见的9种芽孢杆菌

表2 芽孢杆菌目标片段

表3 空间芽孢杆菌LAMP引物组合

实施例2 LAMP扩增引物的筛选

1.基因组提取

取-80℃保藏的菌种溶液10μL，在LB固体培养基上划线，置于37℃培养箱中培养12～24h。待长出单菌落后，在超净台中挑取少量菌落，放置于PCR管底，加入10μL的无菌水，反复吹吸使菌体重悬。将PCR管放置于100℃水浴中煮沸10分钟，然后立即冰水浴5分钟，最后置于4℃预冷的离心机中，12000rpm离心5分钟，得到的上清液即为基因组溶液。

2.引物筛选

通过荧光LAMP反应对实施例1种设计的5对引物进行筛选，扩增体系如表4所示，程序设为三步扩增反应：63℃，10s不采集信号；60个循环，50s/循环，采集信号；90℃5min不采集信号。

表4 荧光LAMP扩增体系

实验结果如图1所示，结果显示，加入引物组合1的LAMP体系反应较另外四种引物组合的荧光强度高，可知引物组合1对芽孢杆菌LAMP扩增效果最好。

实施例3 LAMP检测体系的优化

目前，一些文献中已经报道了有关LAMP反应体系的配比和反应条件，但对于不同的实验条件，在实验细节方面还是有所差别的，为了保证后续的检测具有良好的实验条件，有必要对LAMP反应体系进行一系列优化。本文选择引物组合1对其中的甜菜碱、镁离子和dNTP浓度进行优化，确保LAMP扩增的最优条件。

1.甜菜碱是一种碱性物质，在LAMP反应过程中，甜菜碱的作用主要有两点：一是在LAMP反应中起促解旋和保护酶的作用，使反应更容易发生；二是序列GC含量过高时容易形成二级结构，甜菜碱可降低这种二级结构的形成几率。甜菜碱的浓度含量会影响LAMP扩增的结果，设计了9个甜菜碱浓度：0mM，100mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM，700mM，800mM，900mM，利用芽孢杆菌基因组作为模板及设计的引物进行实验，恒温63℃反应1h，扩增结果用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果如图2所示。根据凝胶电泳结果，0mM-400mM时，随着甜菜碱浓度的增加，LAMP扩增产物逐渐增加，500mM～800mM时，随着甜菜碱浓度的增加，LAMP扩增产物出现受抑制的现象，根据凝胶电泳条带的结果，甜菜碱最适浓度为400mM。

2.镁离子作为Bst DNA聚合酶的辅基，当Bst DNA聚合酶结合镁离子才会有活性，对LAMP扩增的特异性和产量有很重要的作用，镁离子除了影响酶的活性，还会影响反应中间产物的链解离温度、引物二聚体的形成等。Mg²⁺浓度主要影响Bst DNA聚合酶的活性和引物的退火温度，选取了以下9种Mg²⁺浓度来进行试验：0mM，2mM，4mM，6mM，8mM，10mM，12mM，14mM，16mM。利用芽孢杆菌基因组作为模板及设计的引物进行实验，63℃恒温反应1h，利用琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测，电泳结果如图3所示。根据电泳图结果，当Mg²⁺浓度在2mM以下时，扩增反应不发生，说明Bst DNA聚合酶需要结合镁离子才具有活性。随着Mg²⁺浓度的增加，LAMP反应产物开始增加，当Mg²⁺浓度为6mM时，LAMP的反应效果最好，随着浓度继续升高，LAMP反应效果开始出现减弱的趋势，这可能是过高浓度的镁离子抑制了酶的活性，降低了LAMP反应的效率，可知Mg²⁺最适浓度为6mM。

3.dNTP是核酸扩增的基本物质，作为LAMP反应的原料，根据碱基互补配对原则，在Bst DNA聚合酶作用下会不断形成新链，同时会产生大量的焦磷酸离子，并与游离的镁离子结合产生沉淀物，进而影响LAMP反应的进行。dNTP作为LAMP反应的原料，其浓度会影响LAMP的反应效率。设计了以下9个dNTP浓度：0mM，0.4mM，0.8mM，1.2mM，1.4mM，1.6mM，2.0mM，2.4mM，2.8mM，利用芽孢杆菌基因组作为模板及设计的引物进行实验，63℃恒温反应1h，利用琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测，电泳结果如图4所示。根据凝胶电泳图检测结果，我们可以得到，当dNTP浓度为0mM，即在缺失底物的情况下，LAMP反应无法进行；随着dNTP浓度的增加，LAMP扩增产物增加，当dNTP浓度为1.4mM时，扩增反应效果最好，可认为此时底物的利用率最高；但当dNTP浓度超过1.4mM时，随着dNTP浓度的增加，扩增产物开始逐渐减少，说明过高的dNTP浓度会抑制LAMP反应的效率，可能的原因是在LAMP扩增过程中，过多的dNTP会与游离的Mg²⁺产生拮抗作用，使酶的活性降低，进而影响扩增反应的效率，因此dNTP最适浓度为1.4mM。

4、LAMP反应体系

通过上述条件优化实验，对LAMP反应体系中甜菜碱、Mg²⁺和dNTP浓度进行了调整，优化后的LAMP反应体系如表5所示，扩增程序为63℃恒温反应1h，后续扩增实验均采用此扩增体系进行扩增实验。

表5 优化后LAMP扩增体系

实施例3 引物组合1检测不同空间菌株的特异性

阴性对照组以海南文昌卫星发射基地采集到的8株菌株DNA作为模板，空白对照组以Nuclease-free Water作为模板，实验组以海南文昌卫星发射基地采集到的芽孢杆菌DNA作为模板，共同进行扩增PCR。

如图5所示，实验结果表明：以空间芽孢杆菌(Bacillus sp.)DNA作为模板出现阳性结果，以其他8株空间菌株(Kytococcus sp.、Staphylococcus aureus strain、Acinetobacter sp.、Bacillus flexus strain、Paenibacillus agaridevorans strain、Staphylococcus pasteuri strain、Staphylococcus sp.、Micrococcus luteus strain)DNA作为模板均得到阴性结果。

因此，本发明提供的空间芽孢杆菌LAMP引物具有良好的特异性，适用于空间芽孢杆菌的在轨检测。

实施例4 引物组合1检测空间芽孢杆菌的灵敏性

提取Bacillus sp.HN-15芽孢杆菌基因组，将浓度进行梯度稀释后，选取扩增反应的模板浓度分别为：0ng/μL、8.63×10^-1ng/μL、8.63×10^-2ng/μL、8.63×10^-3ng/μL、8.63×10^-4ng/μL、8.63×10^-5ng/μL、8.63×10^-6ng/μL、8.63×10^-7ng/μL、8.63×10^-8ng/μL。

以引物组合1为引物，表5中的优化LAMP扩增条件进行扩增。最终发现，上述检测体系的芽孢杆菌检测灵敏度至少可达到8.63×10^-8ng/μL。

实施例5 引物组合1检测空间芽孢杆菌的适用性

以表1中海南文昌卫星发射基地采集到的9种芽孢杆菌菌株DNA作为模板，共同进行扩增PCR。

如图6所示，实验结果表明：引物组合1通过上述LAMP扩增体系可以扩增9种芽孢杆菌菌株，具有良好的空间芽孢杆菌的适用性。

图7再次进行了验证，鉴于Bacillus amyloliquefaciens strain HN-24和Bacillus amyloliquefaciens strain HN-26属于同种同属亲缘关系非常相近，Bacilluspumilus strain HN-10和Bacillus pumilus strain HN-30属于同种同属亲缘关系非常相近。为了简略展现引物对地面航天器组装发射环境中代表性芽孢杆菌各不同种属的扩增效果，直接扩增了7株代表性菌株，得到了同样的空间芽孢杆菌适用性的结果。

因此，本发明提供的空间芽孢杆菌LAMP引物具有良好的特异性和适用性，能够实现空间芽孢杆菌的在轨检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种检测空间站芽孢杆菌的方法，其特征在于，使用LAMP引物组合对空间站环境中待测芽孢杆菌样本进行环介导等温扩增，环介导等温扩增的引物组合由F3-1、B3-1、FIP-1和BIP-1构成，序列如下所示：

扩增体系中还包括辅助检测试剂：甜菜碱、镁离子、dNTP、Bst DNA聚合酶和10×Themopol Buffer；

扩增体系中甜菜碱终浓度400mM、Mg²⁺终浓度6mM、dNTP终浓度1.4mM；

扩增温度为63℃，扩增时间为1h。