CN113444826B - 一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用，属于环境细菌检测与鉴定技术领域。一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。所述引物仅能对微球菌属内物种准确扩增，而对属外物种无法扩增，因此，所述引物对微球菌属内物种具有较强的扩增特异性。本发明还提供了一种鉴定环境中微球菌的方法，通过荧光等温扩增技术，对环境中微球菌进行快速鉴定，操作简单，对微球菌鉴定范围广，且对微球菌的最低检测限可达60fg/μL，具有较高的检测灵敏度。

Description

一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于环境细菌检测与鉴定技术领域，具体涉及一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用。
背景技术
微球菌属于革兰氏阳性菌，是条件致病菌，能在极端环境下生长，且在一定条件下可引起皮肤局部组织感染，甚至严重感染，造成心内膜炎等疾病。微球菌属有多个分类，其不同的分类在不同的领域有不同的应用。在不同的条件下，不同的微球菌种类可能会对人类生活造成或好或坏的影响，而无论是为了对微球菌的预防还是利用，都需要合适的方法对其进行检测和鉴定。
16S rDNA基因是细菌中编码rRNA的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，具有良好的进化保守性以及与进化距离相匹配的变异性，是细菌分子鉴定的标准标识序列。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rDNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便的分类鉴定和检测。
等温扩增技术是近年来发展起来的新型核酸扩增技术，该技术可以在恒定温度下快速有效地扩增核酸序列。与需要复杂的热循环以介导变性，退火和随后的延伸的PCR方法相比，等温扩增可以在恒温条件下利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶实现对双链DNA的解链、复性和延伸，在5~30分钟即可完成DNA扩增，操作简单，反应时间短，可用于对细菌的快速检测。
目前，还没有利用等温扩增技术在属水平鉴定环境微球菌的方法，现有方法主要是利用PCR技术对藤黄微球菌的鉴定，鉴定范围小，技术要求高，灵敏度低，不利于推广。因此，提供一种基于等温扩增技术鉴定环境微球菌的引物、探针和方法具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，能够特异性鉴定微球菌属物种，且具有检测灵敏度高的特点。
本发明的目的还在于提供一种检测环境中微球菌的试剂盒及其应用，具有鉴定范围大、技术要求低的特点，有利于推广应用。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌属的引物探针组，包括所述引物和标记有荧光基团和淬灭基团的探针；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了一种鉴定环境中微球菌的试剂盒，包括所述引物或所述引物探针组。
优选的，所述试剂盒包括检测试剂；
所述检测试剂包括recA重组酶蛋白、SSB 蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶III、2×反应缓冲液。
优选的，所述2×反应缓冲液包括以下浓度的组分：200mmol/L的Tricine、220mmol/L 醋酸镁、10mmol/L 二硫苏糖醇、10% PEG、6mmol/L ATP、200ng/μL 肌酸激酶和20mmol/L dNTP。
优选的，所述试剂盒包括采样液、基因组DNA提取试剂。
本发明提供了所述引物、所述引物探针组、所述试剂盒在鉴定环境中微球菌中的应用。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，包括以下步骤：
1）采集环境样品后，培养获得待检测菌液；
2）以提取检测菌液的基因组DNA为模板，在所述引物探针组中的引物和探针的作用下进行等温扩增，采集实时荧光信号，得到荧光扩增曲线；
3）根据所述荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌；
阴性样品和阳性样品判定标准：荧光阈值设定为0.3，当Ct值＞39时，判定为阴性样品，当Ct值≤39时，判定为阳性样品。
优选的，所述等温扩增的反应体系如下：在39℃下保持35s，重复40个循环。
优选的，所述等温扩增的反应程序如下：
recA重组酶蛋白 2~3μg
SSB 蛋白 1.5~2μg
Bsu DNA 聚合酶 0.5~1μg
核酸外切酶III 0.8~1.6U
2×反应缓冲液 10μL
10μM正向引物/10μM反向引物 0.8μL/0.8μL
5μM探针 0.5μL
DNA模板 2μL
ddH2O 补足至20μl。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。所述引物仅能对微球菌属内物种准确扩增，而对属外物种无法扩增，因此，所述引物对微球菌属内物种具有较强的鉴定特异性，实现微球菌的鉴定。同时灵敏度检测实验结果表明，所述引物对微球菌的最低检测限可达60fg/μL，具有较高的检测灵敏度。
本发明还提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，基于上述方案的引物和探针进行等温扩增，采用荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌，具有反应时间短、操作简单，对样品检测快速的特点，并且在微球菌属内实现鉴定，鉴定范围广，检测灵敏度可达60fg/μL，检测灵敏度高，推广应用性强。
附图说明
图1为本发明提供的基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的技术流程图；
图2为微球菌扩增序列比对结果；
图3A为环境中分离的各菌种的特异性检测结果；
图3B为各标准菌株的特异性检测结果；
图4A为藤黄微球菌灵敏度检测结果；
图4B为环境分离的微球菌灵敏度检测结果；
图5为混合菌鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:1（5'-GATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATC-
3'）所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2（5'- GTGCTTCTTCTGCA
GGTACCGTCACTTTCGC-3'）所示的反向引物。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物人工合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物委托生工生物工程股份有限公司合成。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物探针组，包括所述引物以及标记有荧光基团和淬灭基团的探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3（5'-CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC/dT-FAM/C/
THF//dT-BHQ1/ACGGGAGGCAGCAGTGG-3'-Spacer）所示。本发明对所述探针的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的探针人工合成方法即可。在本发明实施例中，所述探针委托湖州河马生物科技有限公司合成。
本发明提供了一种鉴定环境中微球菌的试剂盒，包括所述引物或所述引物探针组。所述试剂盒优选包括检测试剂；所述检测试剂包括recA重组酶蛋白、SSB蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶III、2×反应缓冲液。所述2×反应缓冲液优选包括以下浓度的组分：200mmol/L的Tricine、220mmol/L 醋酸镁、10mmol/L 二硫苏糖醇、10% PEG、6mmol/L ATP、200ng/μL 肌酸激酶、20mmol/L dNTP。本发明对所述检测试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂即可。
在本发明中，所述试剂盒优选包括采样液。所述采样液优选为肉汤培养基。本发明对所述肉汤培养基的配方没有特殊限制，采用本领域所熟知的肉汤培养基即可。
在本发明中，所述试剂盒优选包括基因组DNA提取试剂。本发明对所述基因组DNA提取试剂的来源和具体组成没有特殊限定，采用本领域常规的基因组DNA提取试剂即可，在本发明具体实施过程中，所述基因组DNA提取试剂优选的采用基因组DNA提取试剂盒。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性标准品。所述阳性标准品优选为包含微球菌的基因组DNA。
本发明提供了所述引物、所述引物探针组、所述试剂盒在鉴定环境中微球菌中的应用。所述微球菌包括微球菌属内所有物种。本发明实施例中，所述微球菌的特异性鉴定时以藤黄微球菌CMCC(B)28001为标准菌株进行的检测。
本发明提供了一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，见图1，包括以下步骤：
1）采集环境样品后，培养获得待检测菌液；
2）以提取检测菌液的基因组DNA为模板，在所述引物探针组中的引物和探针的作用下进行等温扩增，采集实时荧光信号，得到荧光扩增曲线；
3）根据所述荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌；
阴性样品和阳性样品判定标准：荧光阈值设定为0.3，当Ct值＞39时，判定为阴性样品，当Ct值≤39时，判定为阳性样品。
本发明采集环境样品后，培养获得待检测菌液。
在本发明中，所述采集环境样品优选的用拭子进行；本发明对所述环境样品没有特殊限定，常规环境中的样品均可，例如打印机、桌子、窗户、玻璃、垃圾桶、门把手、地板、实验台、仪器表面等。在本发明具体实施过程中，优选的将拭子浸泡在所述采样液中使其充分湿润，随后进行采样，采样后对采集的样品进行培养，在本发明具体实施过程中，优选的将采样后的拭子置于肉汤培养基中进行培养，所述培养的温度优选为35~39℃，更优选为37℃，所述培养的转速优选为200~250rpm，更优选为210~230rpm，所述培养的时间优选为8~14h，更优选为10~12h。
本发明在获得所述待检测菌液后，提取所述待检测菌液的基因组DNA，以提取获得的基因组DNA为模板，在所述引物探针组中的引物和探针的作用下进行等温扩增，采集实时荧光信号，得到荧光扩增曲线。
本发明对于提取所述待检测菌液的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用本领域常规的基因组DNA提取方法即可。
在本发明中，所述等温扩增优选在荧光定量PCR仪中进行。所述采集实时荧光信号优选用荧光定量PCR仪完成。所述等温扩增的反应程序优选如下：在39℃下保持35s，重复40个循环。所述等温扩增的反应体系优选如下：
recA重组酶蛋白 2~3μg
SSB 蛋白 1.5~2μg
Bsu DNA 聚合酶 0.5~1μg
核酸外切酶III 0.8~1.6U
2×反应缓冲液 10μL
10μM正向引物/10μM反向引物 0.8μL/0.8μL
5μM探针 0.5μL
DNA模板 2μL
ddH2O 补足至20μl。
在本发明中，根据荧光扩增曲线确定环境样品中是否含有微球菌，阴阳性样品判定标准优选如下：荧光阈值设定为0.3，当Ct值＞39时，判定为阴性样品，当Ct值≤39时，判定为阳性样品。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
微球菌属特异引物和探针的设计
具体步骤如下：
A、采集环境样品，通过平板划线分离环境细菌。
B、用16S rDNA通用引物对环境分离细菌的基因组DNA进行测序，通过序列比对确定所分离细菌的种属。
C、根据分离到的微球菌16S rDNA测序结果以及NCBI数据库中云南微球菌、内生微球菌、藤黄微球菌等微球菌的16S rDNA基因序列，在保守区设计微球菌属特异引物对，引物序列如下：
F:5'-GATTTATCGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATC-3'（SEQ ID NO:1）；
R:5'- GTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGC-3'（SEQ ID NO:2）；
D、对引物所针对的扩增区域的序列在NCBI中进行比对，比对结果均为微球菌属细菌的基因片段，而未出现与其它属菌株配对的现象；图2为引物扩增片段与不同种微球菌序列比对结果，扩增片段在不同种微球菌中保守，故针对该片段设计的引物适用于对微球菌属细菌的检测。
E、针对扩增片段设计相应的探针，用于对微球菌属细菌进行荧光检测。探针序列如下：
5'-CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC/dT-FAM/C/THF//dT-BHQ1/ACGGGAGGCAGCAGTGG-3'-Spacer（SEQ ID NO:3）；
其中，序列第30位碱基T修饰FAM，第32位用THF荧光基团替换原32位碱基，第33位T上修饰BHQ1淬灭基团。
实施例2
微球菌的特异性检测
A、将标准菌株以及从环境中分离的不同属的细菌过夜摇菌培养。
其中，标准菌株包括大肠杆菌ATCC25922(从Microbiologics公司购买)；藤黄微球菌CMCC(B)28001、铜绿假单胞菌ATCC15442、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303（购买自北京生物保藏中心）；金黄色葡萄球菌NCTC8325、金黄色葡萄球菌ATCC6538（从上海保藏生物技术中心购买）。
从环境中分离的不同属的细菌包括葡萄球菌2株（记为P-1、P-2），泛菌1株（记为F-1），芽孢杆菌1株（记为Y-1），假单胞菌1株（记为J-1），微球菌2种（记为W-1、W-2）。
B、提取过夜培养的细菌基因组DNA。
C、以不同细菌的基因组DNA为模板，阴性对照为ddH2O，利用实施例1中设计的微球菌属特异引物对和探针进行等温扩增，并实时采集荧光信号。
核酸扩增反应体系：
recA重组酶蛋白 2.5μg
SSB 蛋白 1.8μg
Bsu DNA 聚合酶 0.8μg
核酸外切酶III 1U
2×反应缓冲液 10μL
引物F/R(10μM) 0.8μL/0.8μL
探针（5μM） 0.5μL
DNA模板 2μL
ddH2O 补足至20μL。
核酸扩增反应程序：
39℃，35s，重复40个循环。
荧光扩增曲线见图3A和图3B。从图3A和图3B中可以看出，设计的引物和探针只能对微球菌基因组DNA进行正常扩增，表明所设计的引物和探针特异性良好。
实施例3
灵敏度检测实验
具体步骤如下：
A、将藤黄微球菌CMCC(B)28001和从环境分离的一种微球菌（从环境分离的微球菌属细菌中随机挑选一种）过夜摇菌培养。
B、提取过夜培养的微球菌基因组DNA。
C、对提取的藤黄微球菌和环境分离的微球菌基因组DNA进行10倍梯度稀释。
D、以不同浓度梯度的微球菌基因组DNA为模板进行等温扩增，并实时采集荧光信号（阴性对照为ddH2O），其中藤黄微球菌100～10-5各梯度基因组DNA的工作浓度分别为13.7×100ng/μL、13.7×10-1ng/μL、13.7×10-2ng/μL、13.7×10-3ng/μL、13.7×10-4ng/μL、13.7×10-5ng/μL。
环境微球菌（W-1）100～10-5各梯度基因组DNA的工作浓度分别为0.6×100ng/μL、0.6×10-1ng/μL、0.6×10-2ng/μL、0.6×10-3ng/μL、0.6×10-4ng/μL、0.6×10-5ng/μL；
荧光扩增曲线见图4A和图4B。藤黄微球菌在13.7×10-3ng/μL下产生阳性荧光扩增曲线，而从环境中分离的微球菌（W-1）在0.6×10-4ng/μL下产生阳性荧光扩增曲线。可以看出，微球菌的最低检测限可达到0.6×10-4ng/μL，即60 fg/μL，表明本发明的反应体系检测具有良好的灵敏度。
实施例4
混合菌的鉴定
A、将从环境中分离的不同属的细菌（从各属细菌中随机挑选，葡萄球菌2种，泛菌1种，芽孢杆菌1种，假单胞菌1种，微球菌2种）以及藤黄微球菌CMCC(B)28001采用常规方法进行过夜摇菌培养。
B、随机挑选不同的菌液进行等体积混合，制备成5组混合菌液，分别编号为1-5，其中1号为芽孢杆菌（记为Y-1）、葡萄球菌（记为P-1）、微球菌（记为W-1）和假单胞菌（记为J-1）的混合菌液，2号为泛菌（F-1）、芽孢杆菌（记为Y-1）和假单胞菌（记为J-1）的混合菌液，3号为芽孢杆菌（记为Y-1）、葡萄球菌（记为P-2）和假单胞菌（记为J-1）的混合菌液，4号为芽孢杆菌（记为Y-1）、葡萄球菌（记为P-2）、泛菌（记为F-1）、微球菌（记为W-2）和假单胞菌（记为J-1）的混合菌液，5号为芽孢杆菌（记为J-1）、葡萄球菌（记为P-1）和藤黄微球菌CMCC(B)28001的混合菌液。
C、提取各组混合菌液的基因组DNA。
D、分别以不同混合菌的基因组DNA为模板，阴性对照为ddH2O，利用设计的微球菌属特异引物对和探针进行等温扩增，并实时采集荧光信号，方法参见实施例2。
荧光扩增曲线见图5。从图5中可以看出，当模板为混合菌基因组DNA时，设计的引物对和探针依旧能对其中的微球菌基因组DNA进行正常检测，说明设计的引物对和探针能够对混合细菌中的微球菌进行鉴定，适用于对环境微球菌的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 至善时代智能科技（北京）有限公司
至微生物智能科技（厦门）有限公司
<120> 一种基于等温扩增技术鉴定微球菌的引物、探针和试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatttatcgg ttttggatgg actcgcggcc tatc 34
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgcttcttc tgcaggtacc gtcactttcg c 31
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n=FAM修饰的dT
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n=THF
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n=BHQ1修饰的dT
<400> 3
ccacactggg actgagacac ggcccagacn cnnacgggag gcagcagtgg 50

Claims (2)

1.一种基于等温扩增技术鉴定环境中微球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采集环境样品后，培养获得待检测菌液；
2）以提取检测菌液的基因组DNA为模板，在鉴定微球菌属的引物探针组中的引物和探针的作用下进行等温扩增，采集实时荧光信号，得到荧光扩增曲线；
所述引物探针组，包括引物和标记有荧光基团和淬灭基团的探针；
所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的反向引物；
所述等温扩增的反应体系如下：
recA重组酶蛋白2 ~ 3μg
SSB蛋白1.5 ~ 2μg
BsuDNA聚合酶0.5 ~ 1μg
核酸外切酶III 0.8 ~ 1.6U
2×反应缓冲液10μL
10μM正向引物/10μM反向引物0.8μL/0.8μL
5μM探针0.5μL
DNA模板2μL
ddH2O补足至20μl；
3）根据所述荧光扩增曲线判断环境样品中是否含有微球菌；
阴性样品和阳性样品判定标准：荧光阈值设定为0.3，当Ct值＞39时，判定为阴性样品，
当Ct值≤39时，判定为阳性样品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述等温扩增的反应程序如下：在39℃下保持35s，重复40个循环。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988144A (zh) * 2015-06-26 2015-10-21 南开大学 检测土壤中10种常见病原微生物的基因液相芯片及其检测方法
CN112961930A (zh) * 2021-05-18 2021-06-15 至善时代智能科技(北京)有限公司 一种在属的水平鉴定环境细菌的引物组、试剂盒及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104988144A (zh) * 2015-06-26 2015-10-21 南开大学 检测土壤中10种常见病原微生物的基因液相芯片及其检测方法
CN112961930A (zh) * 2021-05-18 2021-06-15 至善时代智能科技(北京)有限公司 一种在属的水平鉴定环境细菌的引物组、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TwistAmp DNA扩增试剂盒分析设计手册;TwistDx Limited;《TwistDx Limited twistdx.co.uk》;20181231;第1-26页 *
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用;杜亚楠等;《上海农业学报》;20181130;第34卷(第6期);第117-122页 *
重组酶聚合酶扩增技术研究进展;景志刚等;《生物技术通报》;20160627;第32卷(第6期);第47-53页 *

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