CN101942508B - 大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌检测试剂盒，所述的大肠杆菌检测试剂盒包括以大肠杆菌的fliC基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的大肠杆菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。

Description

大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

H7大肠杆菌是数百种大肠杆菌中的一个亚型。虽然生长在健康人类和动物的肠道内的绝大多数菌种都是无害的，但这一菌种却会产生强烈的毒素，并引发严重的疾病。因此准确、快速地检测H7大肠杆菌具有十分重要的意义。

传统大肠杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。

目前，中国200610035691.4号发明专利申请也是涉及采用环介导恒温扩增技术检测O157大肠杆菌。但在环境中，带有O157抗原，而非O157:H7的大肠杆菌占有一定比例，因此容易出现假阳性，特异性不高。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的大肠杆菌检测试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种大肠杆菌检测试剂盒，所述的大肠杆菌检测试剂盒包括以大肠杆菌的fliC基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。

大肠杆菌有两个重要抗原：H抗原与O抗原。本专利检测的是fliC基因。该flic基因为大肠杆菌鞭毛抗原H7型的编码基因，相比起传统PCR方法中检测O157抗原形成基因rfbE，具有更高特异性。因为在环境中，带有O157抗原，而非O157:H7的大肠杆菌占有一定比例，所以检测H7基因的大肠杆菌具有重要意义。

与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除大肠杆菌H7外，无其它菌带有该基因。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG

或

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 5)

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 6)

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 7)

GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 8)

GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG

或

外引物F3(3)：(SEQ ID NO 1)

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(3)：(SEQ ID NO 2)

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(3)：(SEQ ID NO 9)

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(3)：(SEQ ID NO 10)

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG

或

外引物F3(4)：(SEQ ID NO 5)

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(4)：(SEQ ID NO 6)

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(4)：(SEQ ID NO 11)

GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(4)：(SEQ ID NO 12)

GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的大肠杆菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL；

所述的反应液含：1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、8～10mmol/L MgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：10～20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2体积％Triton X-100；

所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；

所述稳定液为石蜡油；

所述的阳性对照为大肠杆菌基因组DNA；

所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.2～2.0μmol/L。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的最优选实施方式，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/μL；

所述的反应液含：2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/L MgSO₄、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和1.2体积％Triton X-100；

所述的显色液为SYBR Green I；

所述的内引物FIP/BIP的浓度为0.2μmol/L；

所述的外引物F3/B3的浓度为1.6μmol/L。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的大肠杆菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。

作为本发明大肠杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和Bst DNA聚合酶的混合而成。

本发明还提供一种大肠杆菌检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：

(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；

(2)将步骤(1)的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；

(3)在反应容器中加入Bst DNA聚合酶0.9～1.8体积份数、反应液38～40体积份数、稳定液52～54.5体积份数、样品模板DNA 4.5～9体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；

(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；

所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以大肠杆菌的fliC基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。

作为本发明使用大肠杆菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对引物为

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG

或

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 5)

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 6)

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 7)

GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 8)

GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG

或

外引物F3(3)：(SEQ ID NO 1)

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(3)：(SEQ ID NO 2)

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(3)：(SEQ ID NO 9)

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(3)：(SEQ ID NO 10)

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG

或

外引物F3(4)：(SEQ ID NO 5)

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(4)：(SEQ ID NO 6)

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(4)：(SEQ ID NO 11)

GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(4)：(SEQ ID NO 12)

GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。

作为本发明使用大肠杆菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。

本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测大肠杆菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的fliC基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测大肠杆菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

下列缩略语适用于本发明：

LAMP：loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增

dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸

Bst酶：Bst DNA polymerase(large fragment)，Bst DNA聚合酶(大片段)

EDTA：ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸

DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸

Betaine：甜菜碱

Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚

fliC：大肠杆菌鞭毛抗原H7型的编码基因

实施例1试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制反应液和引物：反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/L MgSO₄、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.2μmol/L和外引物F3/B3各2.0μmol/L，置于容器；

(4)配制样品预处理液：样品预处理液含有20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、2mmol/L EDTA和1.2体积％Triton X-100，置于容器；

(5)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(6)购置显色液：SYBR Green I，置于容器；

(7)提取阳性对照：提取大肠杆菌基因组DNA，置于容器；

(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将上述(2)～(4)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

在本发明大肠杆菌检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物F3(3)：

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3(3)：

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP(3)：

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP(3)：

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG。

实施例2试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 5)

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 6)

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 7)

GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 8)

GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制反应液和引物：反应液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-Cl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、8mmol/L MgSO₄、0.1体积％TritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.25μmol/L和外引物F3/B3各1.2μmol/L，置于容器；

(4)配制样品预处理液：样品预处理液含有10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1mmol/L EDTA和1.0体积％Triton X-100，置于容器；

(5)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(6)购置显色液：EVA Green I，置于容器；

(7)提取阳性对照：提取大肠杆菌基因组DNA，置于容器；

(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。

其他同实施例1。

在本发明大肠杆菌检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物F3(4)：

CTTTGAGCAGCGCTTTCA

外引物B3(4)：

GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT

内引物FIP(4)：

GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC

内引物BIP(4)：

GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。

实施例3大肠杆菌检测试剂盒的应用

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

本发明采用菌株有28株，主要来源于心广州出入境检验检疫局、临床分离菌株和环境分离菌株。详见表1。

表1菌株名称及来源

菌株来源	菌株及编号
		广州CIQ	大肠杆菌(H7B)
临床分离株	来源于检测样品中的大肠杆菌H716株；
		其它菌株	金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、单增李斯特菌氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、乙型溶血链球菌各1株。

1.1.2主要仪器和试剂

1.2分离菌株的鉴定

1.2.1大肠杆菌H7的培养大肠杆菌H7穿刺培养的菌种用营养肉汤复苏，36℃，培养18-24小时。于普通营养琼脂平板37℃培养18-24小时分离出单菌落。

1.2.2临床分离株的分离鉴定临床分离株增菌后，于EMB平板上分离出单菌落，接种于三糖铁(TSI)斜面培养基观察是否产酸、产气和产硫化氢等项目，同时接种于硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验，培养于25℃，观察是否有动力且成伞形状或月牙状生长。挑可疑单菌落作革兰氏染色，采用广东环凯微生物科技有限公司的致泻大肠埃希氏菌生化鉴定盒进行生化确认。

1.3样品处理(模板DNA提取)

1.3.1取1mL液体培养的菌液样品，10000rpm离心2分钟，获得菌体沉淀；

1.3.2在上述菌体沉淀中加入100μL样品预处理液混合均匀，沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟，10000rpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。

1.4、采用实施例1或实施例2的试剂盒进行环介导等温扩增技术的反应过程

1.4.1在200μL反应管配制反应体系：反应液和引物共22μL，Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)，稳定液30μL，模板DNA 2.5μL。

1.4.2将配制好的反应管于65℃恒温反应1小时。

1.5反应后处理

向上述反应产物中加入2μL SYBR Green I，混匀，同时也向阳性对照管(单增大肠杆菌H7基因组DNA)和阴性对照管(去离子水)中加入SYBR Green I混匀，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。

1.6电泳

配制0.2％琼脂糖凝胶电泳。以SYBR Green I作为染料进行显色反应观察结果。

1.7特异度试验

1.7.1纯菌株LAMP检测用LAMP方法对25株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。

1.7.2几种菌株混合DNA检测用LAMP对大肠杆菌H7及沙门氏、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的DNA等体积混合液取2.5ul作LAMP检测。

1.8灵敏度试验将大肠杆菌H7于普通营养琼脂平板上纯培养18-24小时后，挑两满环菌落混悬于5mL无菌生理盐水中，用生理盐水10倍倍比稀释至10^-10。选择适宜的3个浓度级取100ul平铺于普通营养琼脂平板上，分别作3个平板，37℃培养48h，取菌落数在30～300之间的平板作平板计数，该浓度级的3个平板的菌落数的均数推算细菌浓度，为菌落平均数×稀释倍数×10；同时，各浓度级取1mL，提取DNA，作LAMP检测。

1.8重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。

2结果

2.1大肠杆菌H7LAMP检测方法的建立

2.2特异度试验大肠杆菌H7(H7B)检测结果阳性，7株非大肠杆菌H7均阴性，大肠杆菌H7的17例样品及大肠杆菌H7、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌4种细菌DNA混合液为阳性，如表2所示。结果显示试剂盒具有高特异性。

检测样品	结果	检测样品	结果	检测样品	结果
						阴性对照	阴性	H7大肠杆菌1	阳性	H7大肠杆菌10	阳性
阳性对照	阳性	H7大肠杆菌2	阳性	H7大肠杆菌11	阳性
						金黄色葡萄球菌	阴性	H7大肠杆菌3	阳性	H7大肠杆菌12	阳性
志贺氏菌	阴性	H7大肠杆菌4	阳性	H7大肠杆菌13	阳性
						副溶血弧菌	阴性	H7大肠杆菌5	阳性	H7大肠杆菌14	阳性
沙门氏菌	阴性	H7大肠杆菌6	阳性	H7大肠杆菌15	阳性
						单增李斯特菌氏菌	阴性	H7大肠杆菌7	阳性	H7大肠杆菌16	阳性
小肠结肠炎耶尔森氏菌	阴性	H7大肠杆菌8	阳性	H7大肠杆菌17	阳性
						乙型溶血链球菌	阴性	H7大肠杆菌9	阳性	细菌DNA混合液	阳性

2.3灵敏度试验

经菌落平板计数，选择第9个稀释度进行读数，平均菌落数为126cfu，推算细菌原液浓度为1.26×10¹¹cfu/mL，LAMP方法可检测到第4个稀释度，为1.26×10⁷cfu/mL。

电泳结果也符合上述结果。

2.4重复性试验特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。

实施例5采用反应管的大肠杆菌检测试剂盒

本实施例的大肠杆菌检测试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试剂盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中：空腔A内装有22.0μL的LAMP反应液和0.5μL的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2.0μL的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20℃保存。

本实施例采用反应管作为容器，对大肠杆菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤：

取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2.5μL，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。

将上述反应管均于65℃恒温反应1h。

反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均匀后观察。

若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。

在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>广州华峰生物科技有限公司

<120>大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

caggagttgc ttttgcga                                               18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

aaacggattc agcaggta                                               18

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gaaagcgctg ctcaaagcag tttttgtgcc attgaatgtc aga                   43

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ctgcgctacc agcgttgtta ttttatatca ccatcggtgg aag                   43

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ctttgagcag cgctttca                                               18

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

gggtaaatct gttaatggtt ctt                                         23

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

gcatacgtag acgatgcagg cttttcagct ttagctgcgc tac                   43

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

ggcttccacc gatggtgata ttttacacca caaaagatgg tactg                 45

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

gaaagcgctg ctcaaagcag tgtgccattg aatgtcaga                        39

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

ctgcgctacc agcgttgtta atatcaccat cggtggaag                        39

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

gcatacgtag acgatgcagg ccagctttag ctgcgctac                        39

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

ggcttccacc gatggtgata acaccacaaa agatggtact g                     41

Claims (6)

1.一种大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，所述的大肠杆菌检测试剂盒包括以大肠杆菌的fliC基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物∶内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的两对引物为

外引物F3：

CAGGAGTTGCTTTTGCGA

外引物B3：

AAACGGATTCAGCAGGTA

内引物FIP：

GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA

内引物BIP：

CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，所述的大肠杆菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度4-10U/μL；

所述的反应液含：1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-HCl、10～12.5mmol/L KCl、10～12.5mmol/L  (NH₄)₂SO₄、8～10mmol/L MgSO₄、0.1～0.125体积％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：10～20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2体积％Triton X-100；

所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；

所述稳定液为石蜡油； 

所述的阳性对照为大肠杆菌基因组DNA；

所述的内引物FIP/BIP各为0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.2～2.0μmol/L。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，

所述的BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL；

所述的反应液含：2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12.5mmol/L KCl、12.5mmol/L(NH₄)₂SO₄、10mmol/L MgSO₄、0.125体积％TritonX-100、1mol/L甜菜碱；

所述的样品预处理液含：20mmol/L pH 8.0的Tris-HCl、2mmol/L EDTA和1.2体积％Triton X-100；

所述的显色液为SYBR Green I；

所述的内引物FIP/BIP的浓度为0.2μmol/L；

所述的外引物F3/B3的浓度为1.6μmol/L。

5.根据权利要求2、3或4所述的大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，所述的大肠杆菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。

6.根据权利要求5所述的大肠杆菌H7检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶的混合而成。