CN113684289A - 一种利用lamp技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。本发明选用大肠杆菌O157:H7毒力基因fliC(NC_013008.1)作为其特异性靶标，设计了4条能在62‑68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过HNB染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测金黄色葡萄球菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规PCR高。本发明试剂盒可以快速、特异地检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，最低可检测浓度为10^‑5ng/μL的基因组核酸。其操作简单，结果易于判读，适合进出口检疫、食品卫生及临床样本检测。

Description

一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检 测方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，以O抗原分型，EHEC可分为O157、O26、O111血清型，主要致病菌株为O157:H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。肠出血大肠杆菌在1982年从出血性结肠炎患者中首次得到分离鉴定，该菌为革兰氏染色阴性的短杆菌，无芽孢、有周鞭毛，大多数菌株有荚膜。不同于其他血清型大肠埃希杆菌，大肠杆菌O157∶H7不含有一般肠毒素基因密码，用基因探针及动物试验检测均不产生LT、ST，不具侵袭性，不属于EPEC血清型。

目前针对食源性致病菌的检测主要有培养鉴定法、酶联免疫吸附法、PCR分析法。其中，细菌培养法是病原菌检测的金标准，但需4-7天出结果，操作繁琐、耗时费力，在敏感性与特异性方面存在局限性，只能检测活细菌，且需要熟练的操作经验。酶联免疫吸附法(ELISA)在特异性方面较好，但需要依赖于酶标仪等专业设备。各种PCR技术主要通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察或者荧光曲线等分析病原菌，检测敏感、准确、迅速，但仍依赖昂贵的PCR仪，检测成本较高，对实验技术要求较高，难以胜任现场化便携式快速检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组，引物序列如下：

fliC-F3：GTGGAAGCCAGGCATACG；

fliC-B3：ACCAGGGATTAACGGAGCT；

fliC-FIP：CTGCTTTGAGCAGCGCTTTCAT-TAGACGATGCAGGCAACTTG；

fliC-BIP：AGGTAGTGACGGTGCCTCTCT-AGTGGTTGTCGCAGGAGT。

本申请还披露了一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：2×LAMP反应缓冲液、Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶、20×Eva Green、HNB、上述的引物组。

进一步地，所述2×LAMP反应缓冲液包括：40mM Tris，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween-20，2.8mM dNTPs，1M甜菜碱，pH 8.8。

进一步地，还包括阳性对照样品大肠杆菌O157∶H7标准菌株或插入了大肠杆菌fliC基因的载体质粒。

进一步地，还包括阴性对照。

进一步地，外引物fliC-F3和fliC-B3与内引物fliC-FIP和fliC-BIP的浓度比例为8：1。

本申请还披露了一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的检测方法，包括：利用上述的LAMP检测试剂盒对样品DNA进行扩增，反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性；或用琼脂糖凝胶电泳检测出现梯形条带为阳性，没有梯形条带为阴性。

进一步地，LAMP反应体系为25μL，包括12.5μL 2×LAMP缓冲液、1μL内引物fliC-FIP、1μL内引物fliC-BIP、1μL外引物fliC-F3、1μL外引物fliC-B3、1μL HNB、1μL 20×EvaGreen、1μL Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶、3.5μL无酶水、2μL DNA样品。

进一步地，反应条件为65℃恒温60min，90℃灭活2min。

本申请还披露了如上述的引物组或检测试剂盒或检测方法在检测肠出血性大肠杆菌中的应用，主要用于食品等非医疗诊断行业中目标微生物的检测。

本发明选用大肠杆菌O157:H7毒力基因fliC(GeneID:NC_013008.1)作为其特异性靶标，设计了4条能在62-68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过HNB染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测肠出血性大肠杆菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规PCR高。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1、快速高效：从样品到结果在一小时内完成，扩增产物理论上是10⁸-10¹⁰个靶序列的拷贝。

2、操作简单，实用性强：反应体系被冻干只需加入对应体积的无酶水和DNA样品即可，不需要专业生物技术人员，反应不需要PCR仪器，简单的恒温装置即可比如水浴锅。

3、特异性强：根据LAMP反应原理只有当4条引物完全与靶序列匹配时才能快速高效进行扩增，使用上述引物组只能扩增肠出血性大肠杆菌，对其他致病菌比如沙门氏菌，志贺杆菌等结果均为阴性。

4、高灵敏度：对大肠杆菌O157∶H7菌液的最低检测限是：10^-5ng/μL。

5、在检测条件有限的地区，利用本申请试剂盒可较为便捷地通过肉眼观察而判定检测结果，操作相对简单、设备依赖度低。

附图说明

图1是大肠杆菌(O157：H7)引物特异性验证；A为对不同细菌核酸的扩增曲线；B为反应结束后照片；C为扩增产物的电泳条带分析；

图2是大肠杆菌O157:H7的fliC基因引物筛选；NC为阴性对照；

图3是大肠杆菌(O157：H7)检测限测试；A为不同浓度核酸的扩增曲线；B为扩增产物的电泳条带分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。本发明试剂盒可以快速(1h内)，特异地检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，最低可检测浓度为10^-5ng/μL的基因组核酸。其操作简单，结果易于判读，适合进出口检疫、食品卫生及临床样本检测。

本发明中涉及的菌种：金黄色葡萄球菌CMCC26003、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、肠出血性大肠杆菌(O157：H7)、沙门菌ATCC14028来自湖北海关，大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌均为本实验室保存。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1肠出血性大肠杆菌(O157：H7)特异性LAMP检测方法的建立

1、纯培养细菌DNA提取

将上述细菌接种于LB液体培养基，37℃有氧条件下过夜。取菌液1mL用商品化细菌基因组提取试剂盒严格按照步骤提取基因组DNA，样品存于-20℃。

2、粪便模拟样品制备及DNA提取

取新鲜培养细菌300μL与2g无菌正常饲养小鼠粪便用PBS缓冲液混均，取100μL混悬液接种于LB液体培养基37℃过夜，取培养液1mL按照1中方法提取基因组DNA，样品存于-20℃。

3、LAMP反应

标准LAMP反应体系25μL组成如下：12.5μL 2×LAMP缓冲液，内引物fliC-FIP及fliC-BIP各1μL，外引物fliC-F3及fliC-B3各1μL，1μL 120μM HNB，1μL Eva Green(20×)，1μL Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶，3.5μL无酶水，2μL DNA样品。

fliC-F3：GTGGAAGCCAGGCATACG；

fliC-B3：ACCAGGGATTAACGGAGCT；

fliC-FIP：CTGCTTTGAGCAGCGCTTTCAT-TAGACGATGCAGGCAACTTG；

fliC-BIP：AGGTAGTGACGGTGCCTCTCT-AGTGGTTGTCGCAGGAGT。

一个检测样品设置2个复孔，其中大肠杆菌(O157：H7)基因组DNA为阳性对照组，沙门菌ATCC14028、痢疾志贺氏菌ATCC 13313、肺炎克雷伯菌、2种非致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌CMCC26003为阴性对照组，无酶水为空白对照组。在Bio-rad实时荧光定量PCR仪上进行恒温扩增，扩增条件：65℃ 60min，90℃灭活2min终止反应。粪便模拟样品和纯菌液特异性实验重复3次结果一致。结果如表1所示：

表1.模拟样品及标准菌株检测结果

注：“+”：阳性反应为天蓝色；“-”：阴性反应为紫罗兰色。

4、结果判断

图1A反映了扩增样品中仅有大肠杆菌(O157:H7)出现明显扩增，而图1B显示反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性，仅有大肠杆菌(O157:H7)出现天蓝色结果；图1C表明阳性扩增产物出现梯形条带，其他阴性及空白对照均无扩增条带。上述结果表明，本申请引物组及试剂盒对大肠杆菌(O157:H7)有特异性扩增效果。

实施例2特异性引物筛选

针对大肠杆菌O157:H7的fliC毒力基因，本申请前期对多组引物进行筛选，总共涉及10组引物，以大肠杆菌O157:H7基因组为模板，在相同模板浓度条件下，分别独立检测不同引物的扩增效率。结果如图2所示，在10组fliC基因LAMP扩增引物组中，20min中即可出现检测结果，仅fliC5引物组具有阳性信号(天蓝色)，其他9种LAMP均不如fliC5。故本申请采用fliC5引物组进行扩增。

表2.筛选引物信息

实施例3试剂盒灵敏度测试

以大肠杆菌(O157：H7)基因组为模板，以fliC-F3、fliC-B3引物进行常规PCR扩增，所得产物用商业化回收，后用无酶水进行梯度稀释，从1ng/μL、10^-1ng/μL、10^-2ng/μL、10^{- 3}ng/μL、10^-4ng/μL、10^-5ng/μL。以此为模板进行LAMP反应，测试引物灵敏度，实时荧光扩增曲线图及颜色变化见图3。LAMP扩增产物用2-3％琼脂糖电泳分析条带情况。

图3A表明，不同浓度靶基因所需的扩增时间存在浓度依赖关系，浓度为10^-5ng/μL时仅需40min左右即可出现扩增曲线；图3B进一步证实了不同浓度核酸扩增后均有梯度条带。上述结果一致表明，本申请设计的LAMP引物组及试剂盒可检测低至10^-5ng/μL的基因组浓度，约相当于1000copies/μL。本发明可视化LAMP快速检测试剂盒使用简单，储存方便，检测条件要求低，可以在40min内完成对大肠杆菌(O157:H7)准确快速检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉海关技术中心

<120> 一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtggaagcca ggcatacg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accagggatt aacggagct 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgctttgag cagcgctttc attagacgat gcaggcaact tg 42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtagtgac ggtgcctctc tagtggttgt cgcaggagt 39

Claims (10)

1.一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的引物组，其特征在于：引物序列如下：

fliC-F3：GTGGAAGCCAGGCATACG；

fliC-B3：ACCAGGGATTAACGGAGCT；

fliC-FIP：CTGCTTTGAGCAGCGCTTTCAT-TAGACGATGCAGGCAACTTG；

fliC-BIP：AGGTAGTGACGGTGCCTCTCT-AGTGGTTGTCGCAGGAGT。

2.一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：2×LAMP反应缓冲液、Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶、20×Eva Green、HNB、权利要求1中所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述2×LAMP反应缓冲液包括：40mM Tris，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween-20，2.8mM dNTPs，1M甜菜碱，pH 8.8。

4.根据权利要求2所述的一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照样品大肠杆菌O157∶H7标准菌株或插入了大肠杆菌fliC基因的载体质粒。

5.根据权利要求2所述的一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括阴性对照。

6.根据权利要求2所述的一种快速检测肠出血性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物fliC-F3和fliC-B3与内引物fliC-FIP和fliC-BIP的浓度比例为8：1。

7.一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的检测方法，其特征在于，包括：利用权利要求2-6任一所述的LAMP检测试剂盒对样品DNA进行扩增，反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性；或用琼脂糖凝胶电泳检测出现梯形条带为阳性，没有梯形条带为阴性。

8.根据权利要求7所述的一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的检测方法，其特征在于：LAMP反应体系为25μL，包括12.5μL 2×LAMP缓冲液、1μL内引物fliC-FIP、1μL内引物fliC-BIP、1μL外引物fliC-F3、1μL外引物fliC-B3、1μL HNB、1μL 20×Eva Green、1μL Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶、3.5μL无酶水、2μL DNA样品。

9.根据权利要求7所述的一种利用LAMP技术快速检测肠出血性大肠杆菌的检测方法，其特征在于：反应条件为65℃恒温60min，90℃灭活2min。

10.如权利要求1所述的引物组或权利要求2-6任一所述的检测试剂盒或权利要求8或9所述的检测方法在检测肠出血性大肠杆菌中的应用。

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