CN101892299B - 产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的产气荚膜梭菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。

Description

产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典型的食物中毒。美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人。产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，易于形成芽胞。该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，芽胞的热抵抗力很强。该菌也经常被发现在人和动物的肠道中存在。从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒。此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。

虽然传统产气荚膜梭菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。

以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real timePCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。

因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的产气荚膜梭菌检测试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关；较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。Woese与Olsen基于对16SrDNA的分析构建了现已被分认的全生命系统进化树，越来越多的细菌依据16SrDNA被正确分类或重分类，尤其是许多环境中的细菌。同时，16S rDNA也被广泛应用于各类生物的核酸检测中。

对nt库(所有已经测序的核酸序列数据库)进行BLAST搜索，除产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)外，无其它高同源性序列。故假阳性可能性极低，该序列适合作为LAMP扩增的靶标序列。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 5)

TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 6)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(3)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(3)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(3)：(SEQ ID NO 9)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(3)：(SEQ ID NO 10)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT

或

外引物F3(4)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(4)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(4)：(SEQ ID NO 11)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(4)：(SEQ ID NO 12)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳性对照。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶：酶浓度7-10U/μL；

所述的缓冲液含：0.18-0.25mol/L Tris-HCl，0.10-0.15mol/L KCl，0.07-0.15mol/L(NH₄)₂SO₄，15-30mmol/L MgSO₄，1-2％ TritonX-100；

所述的dNTPs：每种核苷酸浓度10-20mmol/L；

所述的甜菜碱：浓度3-6mol/L；

所述的硫酸镁：浓度100-200mmol/L；

所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；

所述稳定液为石蜡油；

所述的阳性对照为产气荚膜梭菌基因组DNA。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/μL；

所述的缓冲液含：0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/L MgSO₄，1％TritonX-100；

所述的dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L；

所述的甜菜碱：浓度5mol/L；

所述的硫酸镁：浓度150mmol/L。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。

作为本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。

环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其扩增效率超强，表现在两个方面：(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个μg，但过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，容易出现气溶胶污染。而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除。本发明的反应管通过隔板和稳定液的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。

本发明还提供一种使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；

(2)将样品增菌液提取样品模板DNA；

(3)在反应容器中加入Bst DNA聚合酶1.8～2.4体积份数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15～20体积分数、甜菜碱15～20体积分数、硫酸镁15～20体积分数、稳定液25～35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积分数，恒温反应；

(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；

所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以产气荚膜梭菌的16SrDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。

作为本发明使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对引物可以为

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 5)

TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 6)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(3)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(3)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(3)：(SEQ ID NO 9)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(3)：(SEQ ID NO 10)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT

或

外引物F3(4)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(4)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(4)：(SEQ ID NO 11)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(4)：(SEQ ID NO 12)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。

作为本发明使用产气荚膜梭菌检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min。

本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)快速检测产气荚膜梭菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的16S rDNA基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测产气荚膜梭菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

下列缩略语适用于本发明：

LAMP：loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增

dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸

Bst酶：Bst DNA polymerase(large fragment)，Bst DNA聚合酶(大片段)

EDTA：ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸

DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸

Betaine：甜菜碱

Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚

实施例1试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3(1)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(1)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(1)：(SEQ ID NO 3)

TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(1)：(SEQ ID NO 4)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制缓冲液：缓冲液按0.18mol/L Tris-HCl，0.10mol/L KCl，0.07mol/L(NH₄)₂SO₄，15mmol/L MgSO₄，1体积％TritonX-100配制，置于容器；

(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按10mmol/L配制，置于容器；

(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按3mol/L配制，置于容器；

(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按100mmol/L配制，置于容器；

(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(8)购置显色液：SYBR Green I，置于容器；

(9)提取阳性对照：提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；

(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；

制备工艺简述如下：

1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液[即上述(2)-(6)步骤配制的液体]无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

实施例2试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3(2)：(SEQ ID NO 1)

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(2)：(SEQ ID NO 2)

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(2)：(SEQ ID NO 5)

TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(2)：(SEQ ID NO 6)

CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制缓冲液：缓冲液按0.25mol/L Tris-HCl，0.15mol/L KCl，0.15mol/L(NH₄)₂SO₄，30mmol/L MgSO₄，2体积％TritonX-100配制，置于容器；

(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按20mmol/L配制，置于容器；

(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按6mol/L配制，置于容器；

(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按200mmol/L配制，置于容器；

(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(8)购置显色液：Eva Green，置于容器；

(9)提取阳性对照：提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；

(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；

其他同实施例1。

实施例3试剂盒的制备

(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物：

外引物F3(3)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(3)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(3)：(SEQ ID NO 9)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(3)：(SEQ ID NO 10)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT。

(2)购置DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶置于容器；

(3)配制缓冲液：缓冲液按0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/L MgSO₄，1体积％TritonX-100配制，置于容器；

(4)配制dNTPs：每种核苷酸浓度按10mmol/L配制，置于容器；

(5)配制甜菜碱：甜菜碱浓度按5mol/L配制，置于容器；

(6)配制硫酸镁溶液：硫酸镁浓度按150mmol/L配制，置于容器；

(7)购置稳定液：石蜡油，置于容器；

(8)购置显色液：Eva Green，置于容器；

(9)提取阳性对照：提取产气荚膜梭菌基因组DNA，置于容器；

(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；

其他条件与实施例1相同。

在本发明的其他实施例中，可以针对产气荚膜梭菌的16S rDNA基因，根据LAMP技术的引物设计原则设计得到其他的引物，例如：

外引物F3(4)：(SEQ ID NO 7)

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(4)：(SEQ ID NO 8)

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(4)：(SEQ ID NO 11)

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(4)：(SEQ ID NO 12)

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。

上述引物对均能达到本发明产气荚膜梭菌检测试剂盒的检测效果。

实施例4产气荚膜梭菌检测试剂盒的应用

本方法的主要技术要点是：

1)样品的制备和选择性增菌：依据GB/T 4789.13《食品微生物学检验  产气荚膜梭菌检验》方法进行样品制备和选择性增菌。

2)提取增菌液模板DNA进行环介导等温扩增后进行快速筛选。

3)阴性结果可以直接出报告，阳性结果采用传统方法分离鉴定后确认。

本发明建立体系如下表示：

表1产气荚膜梭菌菌LAMP反应体系

1.1特异性

特异性试验采用菌株来自各检验检疫局并经过GB方法确认。

1.1.1对上述菌株按照GB/T 4789.13标准方法进行培养获得菌液，采用本发明方法进行LAMP检测：

1)提取细菌DNA模板：

a)取增菌培养液1.5ml于2ml离心管，10000rpm，离心2min，去上请；

b)加入1ml TE洗涤菌体一次，10000rpm，离心2min，去上请；

c)加入500μL TE(pH8.0)充分振荡，重悬菌体；

d)往管中加入10～15μL溶菌酶溶液(50mg/ml，20000U/mg)至终浓度1mg/ml，混匀，37℃，反应2～3h，并每10min振荡一次；

e)再加入10μL蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，37℃，反应1h；

f)接着加入52μL 10％SDS至终浓度1％，混匀，37℃，温浴30min；

g)加入100μL 5M NaCl，80μL CTAB/NaCl，混匀，65℃，温浴10min；

h)加入等体积(约750μL)氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀，12000rmp，离心5min；

i)小心移取上清至新的无菌2ml离心管中，加入等体积(约650μL)酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，12000rmp，离心5min；

j)小心移取上清液至另一新的无菌2ml离心管中，加入1/10体积的3MNaOAc(pH6.0)以及2倍体积(1ml)的冰冻无水乙醇，混匀，观察是否有絮状沉淀，-20℃放置30min或者更长时间；

k)12000rmp，4℃离心，10min，去上清；

l)加入冰冻70％乙醇洗涤沉淀，12000rmp，4℃离心，10min，去上清；

m)沉淀置通风厨处风干(约30min)，加入200μL TE(pH8.0)溶解沉淀；

n)加入20g RNase A，37℃，反应30min；

o)再加入400μL TE(pH8.0)和等体积(600μL)酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀，12000rmp，离心5min；

p)小心移取上清至新的无菌2ml离心管中，加入1/10体积的3M NaOAc(pH6.0)和2倍体积(1ml)的冰冻无水乙醇，混匀，-20℃放置30min或者更长时间；

q)12000rmp，4℃离心，10min，去上清；

r)加入冰冻70％乙醇洗涤沉淀，12000rmp，4℃离心，10min，去上清；

s)沉淀置通风厨处风干后，加入适量TE(pH8.0)或者无菌水溶解，可立即使用。

2)按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。

反应管中加入22μL的反应液+0.5μL的DNA聚合酶+30μL的稳定液+2.5μL待检模板；65℃环介导等温反应60min；往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为产气荚膜梭菌阳性，呈橙色则为阴性。所述的反应液为反应体系中的缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水混合而成。

产气荚膜梭菌ATCC13124检测结果阳性，6株产气荚膜梭菌分离株为阳性。乙型溶血性链球菌为阴性，副溶血弧菌为阴性，李斯特氏菌为阴性，金黄色葡萄球菌为阴性，志贺氏菌为阴性，大肠杆菌为阴性，沙门氏菌为阴性。

1.1.2干扰实验

1)取产气荚膜梭菌ATCC13124、沙门氏菌CCTCCAB94006、乙型溶血性链球菌CMCC(B)32210、副溶血弧菌ATCC17802、李斯特氏菌CCTCCAB97021、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、志贺氏菌51334-20、大肠杆菌CCTCCAB200068共八株菌，液体培养到OD₆₀₀为0.4左右，此时菌液浓度大约为10⁸CFU/mL，进行10倍梯度逐倍稀释到浓度为10⁷-10²CFU/mL。

2)准备8个锥形瓶，每个盛有100mL肉汤培养基，8个瓶中接入终浓度分别为(1)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL沙门氏菌；(2)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL乙型溶血性链球菌；(3)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL副溶血弧菌；(4)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL李斯特氏菌；(5)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL金黄色葡萄球菌；(6)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL志贺氏菌；(7)10²CFU/mL产气荚膜梭菌+10⁴CFU/mL大肠杆菌；(8)七种菌(沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和大肠杆菌)的混合菌液(每种菌终浓度均为10³CFU/mL)。

3)按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。

反应管中加入22μL的反应液+0.5μL的DNA聚合酶+30μL的稳定液+2.5μL待检模板；65℃环介导等温反应60min；往反应管中加入2μL显色液，封管后轻轻摇匀观察，反应管液体呈绿色，为产气荚膜梭菌阳性，呈橙色则为阴性。

产气荚膜梭菌分别与乙型溶血性链球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌混合液为阳性。干扰菌株混合菌液为阴性。

综合以上实验结果，表明本发明方法对产气荚膜梭菌检测具有良好的特异性与抗干扰性。

1.2灵敏度

取目标菌菌液定量到约0.4麦氏浊度，然后进行10倍梯度稀释，获得10^-1～10^-10浓度的菌液；取其中的10^-5～10^-7浓度的菌液1ml按GB/T4789.2进行平板计数(厌氧培养)，另取10^-1～10^-10浓度的菌液用于本发明方法做提取核酸及检测，比较等温扩增结果与菌落计数结果判断灵敏度。步骤如下：

(1)取编号为ATCC13124菌液，用生理盐水稀释至约0.4麦氏浊度；

(2)取0.5ml步骤1的稀释菌液加入4.5ml无菌生理盐水中，混匀，获得10-1菌液，如此类推获取10^-1～10^-10浓度的菌液；

(3)取其中的10^-5～10^-7浓度的菌液1ml按GB/T4789.2进行平板计数(厌氧培养)；

(4)另取10^-1～10^-10浓度的菌液按本发明方法步骤进行提取及检测；

(5)比较等温扩增结果与菌落计数结果判断灵敏度。

对10^-4～10^-6浓度的菌液按GB/T4789.2做菌落计数结果见下表。

综合上述结果，在本次实验中判断本发明方法灵敏度可达到1.4×10⁴CFU/mL。

实施例5实施例1的产气荚膜梭菌检测试剂盒对人工模拟样品的试验

1样品制备、增菌培养

1)接种和培养

取标准待测菌株接入适当的培养基中，培养至600nm波长处吸光度在0.35-0.45之间，取菌液做10倍梯度稀释，分别标记为10^-1～10^-10。

2)菌落计数

取25g(mL)食品，按GB/T 4789.13方法进行匀浆；分别取1mL不同稀释度的菌液进行食品样品人工污染。

3)增菌

按GB/T 4789.13方法作增菌处理。增菌后按GB/T 4789.2方法进行菌落计数。

2细菌模板DNA的制备(具体方法参照实施例4)

3采用本发明实施例1的试剂盒进行LAMP方法检测

1)反应过程

a)在反应管中分别加入相应反应液22.5μL、Bst酶0.5μL，混匀，然后加入30μL稳定液，最后在管中加入2.5μL上述核酸摸板；

b)反应管置65℃温育60min；

2)阴性对照、阳性对照设置

以样品预处理液代替DNA模板作为阴性对照；

以已知浓度的标准菌株DNA模板作为阳性对照。

4结果观察

在反应管中分别加入2μL显色液后观察结果；在阴性对照反应管为橙色，阳性对照反应管呈绿色的条件下：

待检样品反应管呈绿色，则为阳性；

待检样品反应管呈橙色，则可报告为阴性。

若与上述条件不符，则本次检测结果无效，重新检测。

5实验结果

采用5类食品，每类食品分别以3种浓度水平接种进行人工模拟。每个样品重复3次试验，确定结果。

在阴性质控和阳性质控正常的情况下，当人工污染样品的菌落计数为2000CFU/mL时被检出阳性。

实施例6实施例2的产气荚膜梭菌检测试剂盒对自然样品的试验

抽取市场食品样品180份，其中肉制品50份、水产品50份、调味品30份、乳制品30及蛋制品20份，分别采用本发明实施例2的试剂盒、实施例5的方法及GB/T 4789.13传统方法检测产气荚膜梭菌。

本标准方法与GB/T 4789.13传统培养方法结果一致性较好。

实施例7采用反应管的产气荚膜梭菌检测试剂盒

本实施例的产气荚膜梭菌检测试剂盒，采用的试剂和引物与实施例1相同，试剂盒还包括反应管，反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中：空腔A内装有22.0μL的LAMP反应液和0.5μL的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2.0μL的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20℃保存。

本实施例采用反应管作为容器，对产气荚膜梭菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，具体包括如下步骤：

取上述制备的反应管三支，采用移液枪分别加入阴性对照样品、待检测样品和阳性对照样品各2.5μL，加样时枪头穿透保护液层，样品加至反应管A腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。

将上述反应管均于65℃恒温反应1h。

反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均匀后观察。

若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。

在LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>广州华峰生物科技有限公司

<120>产气荚膜梭菌检测试剂盒及其使用方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

aaccttcatc actcacgcg               19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gcaatccgct atgagatgga              20

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tgatcggcca cattgggact gattttggtt tcccccattg tgca         44

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

caggtcggct acgcatcgtc ttttcggcgc attagctagt tgg          43

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

tgatcggcca cattgggact gaggtttccc ccattgtgca              40

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

caggtcggct acgcatcgtc cggcgcatta gctagttgg     39

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ggggtaacgg cctaccaa

18

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

cctccttggg taccgtcatt                          20

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

agtctgggcc gtgtctcagt ttttgatgcg tagccgacct ga        42

<210>10

<211>46

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

caatggggga aaccctgatg catttttctt ccccaaagac agagct    46

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

agtctgggcc gtgtctcagt gatgcgtagc cgacctga             38

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

caatggggga aaccctgatg catcttcccc aaagacagag ct        42

Claims (6)

1.一种产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒包括以产气荚膜梭菌的16S rDNA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的两对引物为

外引物F3(1)：

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(1)：

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(1)：

TGATCGGCCACATTGGGACTGATTTTGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(1)：

CAGGTCGGCTACGCATCGTCTTTTCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(2)：

AACCTTCATCACTCACGCG

外引物B3(2)：

GCAATCCGCTATGAGATGGA

内引物FIP(2)：

TGATCGGCCACATTGGGACTGAGGTTTCCCCCATTGTGCA

内引物BIP(2)：

CAGGTCGGCTACGCATCGTCCGGCGCATTAGCTAGTTGG

或

外引物F3(3)：

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(3)：

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(3)：

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTTTTTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(3)：

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATTTTTCTTCCCCAAAGACAGAGCT

或

外引物F3(4)：

GGGGTAACGGCCTACCAA

外引物B3(4)：

CCTCCTTGGGTACCGTCATT

内引物FIP(4)：

AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTGATGCGTAGCCGACCTGA

内引物BIP(4)：

CAATGGGGGAAACCCTGATGCATCTTCCCCAAAGACAGAGCT。

2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、显色液、稳定液和阳性对照。

3.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度7-10U/μL；

所述的缓冲液含：0.18-0.25mol/L Tris-HCl，0.10-0.15mol/L KCl，0.07-0.15mol/L(NH₄)₂SO₄，15-30mmol/L MgSO₄，1-2体积％TritonX-100；

所述的dNTPs：每种核苷酸浓度10-20mmol/L；

所述的甜菜碱：浓度3-6mol/L；

所述的硫酸镁：浓度100-200mmol/L；

所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green；

所述稳定液为石蜡油；

所述的阳性对照为产气荚膜梭菌基因组DNA。

4.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，

所述的Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/μL；

所述的缓冲液含：0.2mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/L MgSO₄，1体积％TritonX-100；

所述的dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L；

所述的甜菜碱：浓度5mol/L；

所述的硫酸镁：浓度150mmol/L。

5.根据权利要求2、3或4所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。

6.根据权利要求5所述的产气荚膜梭菌检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为缓冲液、dNTPs、甜菜碱、硫酸镁、水和Bst DNA聚合酶的混合而成。