CN107988327A - 志贺氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了志贺氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的6条引物对应志贺氏菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全卫生领域中的志贺氏菌快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对志贺氏菌的快速检测，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化志贺氏菌核酸快速检测试剂盒.
背景技术
志贺氏菌属(Shigella)即通称的痢疾杆菌，是一类革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科，根据其抗原构造的不同分为四个种，分别为痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)、宋内志贺氏菌(S.sonnei)。志贺氏菌属的四个种均是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌属，在人体中产生溃疡性结肠感染。该病原菌一般通过排泄物污染的食物或水传播的。每年全球可见大量因志贺氏菌感染肠道疾病的报道，夏秋两季患者最多，我国也深受其害，因此在食品安全领域如何快速准确对志贺氏菌进行快速的鉴定具有重要的意义。
目前对致病微生物的检测有多种方法，传统方法以病原微生物分离培养鉴定、形态学鉴定和生化鉴定为主。目前志贺氏菌的检测以选择性培养基为主，其原理是利用志贺氏菌不利用乳糖、蔗糖等糖类物质产酸的特性而与其它肠杆菌相区别。显色培养基方面，目前暂未发现志贺氏菌表达的特异性酶，使得志贺氏菌的显色培养基开发受到了限制。因此目前志贺氏菌显色培养基大多利用特异性酶使其它细菌显色，从而与不显色的志贺氏菌相区分。但是由于志贺氏菌的生物学特性与肠杆菌科其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等非常相似，从而导致大量假阳性和假阴性结果。近年来免疫学检测、以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的生物学检测方法相继应用于微生物检测，这些技术突破了传统的微生物学检测模式，无需繁琐的培养和分离提纯过程，而直接对样品或者样品增菌液中的致病菌进行分离和快速核酸抽提，结合分子生物学技术进行快速检测，辅以生物信息等手段进行分析，具有快速准确、灵敏度高、特异性强的特点。另一方面，这些方法也有其天然的缺陷，普通的PCR检测需要专门的仪器，检测过程相对繁琐，样品容易污染出现假阳性的情况，这使得其应用受到了限制。Real-time PCR需要更为昂贵的检测仪器，并且成本比较高。免疫学的检测方法依赖高质量的单克隆抗体，否则无法提供准确的结果。
LAMP技术是在2000年由日本研究人员Notomi等人开发的一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术。该技术利用2对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法尚未在食品安全、医药等领域推广开来，且作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的志贺氏菌快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
发明内容
本发明的目的在于针对现有志贺氏菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化志贺氏菌快速诊断试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。
本发明所采取的技术方案是：
一种志贺氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：
志贺氏菌-F3：agcagacgaaatgtggcac
志贺氏菌-B3：tcgctagtgacagtgatgta
志贺氏菌-FIP：cgatgcgtagggacgcaggtagcatctgggagcattggtacg
志贺氏菌-BIP：agtgcgcagagttagcccagctgacttgtggctgacgccag
志贺氏菌-LF：cgcacaggcaggcctgcctgacg
志贺氏菌-LB：gccgtggccattagtgtgcctg。
一种志贺氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其LAMP引物组如上所示。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。冻干复合保护剂优选含3％～5％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白。特别的，冻干复合保护剂为：3％海藻糖(w/v)、0.01％甘氨酸(w/v)、0.1％牛血清白蛋白。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，裂解液含有：10～20mmol/LTris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为无菌石蜡油。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，阳性对照干粉为提纯的志贺氏菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非志贺氏菌基因组DNA冻干粉。
作为上述干粉化LAMP快速检测试剂盒的进一步改进，使用方法包括如下步骤：
(1)参照GB/T4789.5-2016《食品微生物学检验志贺氏菌检验》，取25g待检食品样品置于225mL志贺氏菌增菌肉汤中进行增菌10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；
(2)增菌液6000r/min离心，去上清；
(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；
(4)取n个冻干粉管(n＝待检测样品数+1管阳性对照+1管阴性对照)，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的志贺氏菌基因组DNA作为阳性对照，以溶解的非志贺氏菌基因组DNA为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置64℃恒温反应；
(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应后呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
本发明的有益效果是：
本试剂盒基于LAMP技术快速检测志贺氏菌，利用3对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，并实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需5～7天，但采用本试剂盒检测从收集样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒采用钙黄绿素显色液，使得通过肉眼即可判读结果，更加直观清晰。
①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，且便于常温运输，节约运输成本；②该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；③该反应过程在恒温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；④反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至16CFU/Test；⑤利用靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45min内完成，高效而快速；⑥反应前加入显色液，可通过肉眼颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
引物的筛选
表1、不同的引物组序列表
引物序列的编号如下：
表2、引物组的序列编号表
对以上6组引物采取统一的优化反应体系测试，经琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，发现引物组6仅需反应30min即可出现明显扩增条带，而引物组1、引物组3和引物组4需40min左右，引物组2和引物组5需45min左右。
试剂盒的制备
(1)引物合成：按照引物组6提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制。
(2)制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后可得到干粉化的检测试剂。
表3
(3)制备复溶液：按照表4所示在无菌环境下混合复溶液混合液，置于容器中。
表4
| 组分 | 终浓度 |
| KCl | 8mmol/L |
| Tris-HCl,，pH 8.8 | 16mmol/L |
| (NH4)2SO4 | 9mmol/L |
| MgSO4 | 6mmol/L |
| Triton X-100 | 0.2％ |
| 甜菜碱 | 1.2mol/L |
(4)制备阳性对照干粉：向提纯的志贺氏菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阳性对照干粉。
(5)制备阴性对照干粉：向提纯的非志贺氏菌基因组DNA溶液分别加入3％的海藻糖(w/v)，分装后经上述冻干程序制备阴性对照干粉。
(6)配制显色液：由0.3mmol/L钙黄绿素和7.2mmol/LMnCl2等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/L，MnCl2的终浓度为360μmol/L，置于容器中。
(7)将封闭液液体石蜡油无菌分装，置于容器；
(8)配制裂解液：含有10～20mmol/L Tris-HCl，pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS，置于容器中。
(9)组装试剂盒，提供使用说明书，封装。
稳定性试验
根据上述试剂冻干粉制备获取9例不同组分的试剂冻干粉，并相应地组装成9种不同的试剂盒，存放于2～8℃环境中，每隔3个月对该9种试剂盒产品进行灵敏度试验，结果见表5。
表5
采用例9复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期时间为21～24个月，远高于同类型产品的12个月保质期，在保存12个月后，其检验限略有下降，部分试剂样品有失活情况。除含5％海藻糖的复合保护剂有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。
最低检验限和灵敏度的比较
(1)用无菌接种环分别挑取福氏志贺氏菌CMCC(B)51572的纯菌菌落，用无菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分别取各个稀释菌液100μL螺旋接种到TSA平板进行培养和计数；
(2)分别取以上稀释菌液100μL，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μL裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；
(3)以上粗提DNA为模板进行PCR和LAMP反应，志贺氏菌PCR引物为：PF-5’-atacactccatcgccccctggc-3’(SEQ ID NO：37)，PR-5’-gcgagcatggtctggaaggc-3’(SEQ IDNO：38)；
(4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，72℃延伸10min，35个循环；
(5)以上粗提DNA为模板进行LAMP反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提DNA模板2.5μL，无菌超纯水2.5μL，充分混匀后加入20μL/管封闭液，紧盖，设置64℃恒温反应50min；
(6)以上PCR与LAMP扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。
结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示志贺氏菌PCR的最低检验限在105倍数稀释处，LAMP最低检验限制在106倍数稀释处。并参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》，测定对应的菌落计数，结果志贺氏菌在106倍数稀释处为16CFU，显示LAMP检测的灵敏度远高于PCR。
纯菌的检测
(1)样品处理
用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取各菌的单菌落半环，转移到含有30μL裂解液的无菌PCR管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组DNA，选用的菌株见表6。
表6
(2)恒温扩增反应
取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的DNA模板2.5μL。另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，Biometra professional PCR仪设置64℃恒温反应50min。
(3)反应后判读
反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照结果与上述任一情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表7。
表7
结果显示，经本发明检测，以上所选的志贺氏菌和非志贺氏菌的核酸快速检测中，志贺氏菌的标准菌株和分离株在各自的反应液中出现明显荧光绿，而非志贺氏菌属各菌反应前后均未出现颜色变化，仍为淡橙色，可见本发明具有极好的特异性，能有效检出志贺氏菌。
常规食品中志贺氏菌的快速检测
(1)样品处理，参照GB/T4789.5-2016《食品微生物学检验志贺氏菌检验》，取25g待检食品样品置于225mL志贺氏菌增菌肉汤中，37±1℃条件下增菌10h±2h；吸增菌液1mL到1.5mL规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清；加入30μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的DNA；
(2)恒温扩增反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的DNA模板2.5μL；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，设置Biometra professional PCR仪至64℃恒温反应50min；
(3)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有志贺氏菌检出，如颜色无变化，表示无检出。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东环凯微生物科技有限公司
广东粤微食用菌技术有限公司
广东环凯生物科技有限公司
<120> 志贺氏菌干粉化LAMP快速检测试剂盒
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<213> 人工引物
<400> 26
gatgcacccg gtctctggcc 20
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 27
gtgatagtgc gtgctaggcc cggcggccga gtcgggccga a 41
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 28
tggctggccc gagtattgtc gagtcccggt gccggactca gg 42
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 29
gtgtgttcga gacgcgggcc gc 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 30
ataaggccgg cgcgcctgcg c 21
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 31
agcagacgaa atgtggcac 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 32
tcgctagtga cagtgatgta 20
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 33
cgatgcgtag ggacgcaggt agcatctggg agcattggta cg 42
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 34
agtgcgcaga gttagcccag ctgacttgtg gctgacgcca g 41
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 35
cgcacaggca ggcctgcctg acg 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 36
gccgtgccat tagtgtgcct g 21
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 37
atacactcca tcgccccctg gc 22
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 38
gcgagcatgg tctggaaggc 20
Claims (10)
1.一种志贺氏菌的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其特征在于：其序列如下：
志贺氏菌-F3：agcagacgaaatgtggcac
志贺氏菌-B3：tcgctagtgacagtgatgta
志贺氏菌-FIP：cgatgcgtagggacgcaggtagcatctgggagcattggtacg
志贺氏菌-BIP：agtgcgcagagttagcccagctgacttgtggctgacgccag
志贺氏菌-LF：cgcacaggcaggcctgcctgacg
志贺氏菌-LB：gccgtggccattagtgtgcctg。
2.一种志贺氏菌的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。
3.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。
4.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。
5.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/L MgSO4、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。
6.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。
7.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。
8.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：封闭液为无菌石蜡油。
9.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：阳性对照干粉为提纯的志贺氏菌基因组DNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非志贺氏菌基因组DNA冻干粉。
10.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：使用方法包括如下步骤：
(1)参照GB/T4789.5-2016《食品微生物学检验志贺氏菌检验》，取25g待检食品样品置于225mL志贺氏菌增菌肉汤中进行增菌10h±2h，对增菌液中的菌体富集用于LAMP快速检测；
(2)增菌液6000r/min离心，去上清；
(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；
(4)取冻干粉管，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的志贺氏菌基因组DNA作为阳性对照，以溶解的非志贺氏菌基因组DNA为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置64℃恒温反应；
(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下，将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应后呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
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