CN101153326A - 志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种志贺氏菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH－GenBank登陆号：M32063，所述引物与所述靶基因的1095－1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在志贺氏菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在志贺氏菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli O157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种志贺氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH---GenBank登陆号：M32063，所述引物与所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
正向内引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
反向内引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
可以扩增志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述引物组还可以包括：
正向环引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
反向环引物LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种志贺氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在志贺氏菌，其特征在于，以志贺氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物或引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；
2)志贺氏菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约65℃条件下恒温保温约40--90分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul～100ul)：
| 成分 | 终浓度或量 | |
| 待检模板 | 核酸模板 | 1-10ul |
| 扩增反应液 | 正向内引物FIP-ipa反向内引物BIP-ipa正向外引物F3-ipa反向外引物B3-ipa甜菜碱betainedNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10× | 1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M1.0-1.6mM2-6mM1/10反应体积(ul) |
| 酶 | Bst DNA Polymerase | 0.16-0.64U/ul |
| 双蒸水 | ddH2O | 加至预定反应体积(ul) |
3)LAMP反应产物的检测：
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在170bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括：
正向环引物LF-ipa 0.6-1.0uM
反向环引物LB-ipa 0.6-1.0uM
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测志贺氏菌的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物或引物组的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
| 成分 | 终浓度或量 | |
| 扩增反应液 | 正向内引物FIP-ipa反向内引物BIP-ipa正向外引物F3-ipa反向外引物B3-ipa甜菜碱betainedNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10× | 1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M1.0-1.6mM2-6mM1/10预定反应体积(ul) |
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8个活性单位的Bst DNA酶。
特别地，为了加快扩增反应速度，所述扩增反应液还可以包括：
正向环引物LF-ipa 0.6-1.0uM
反向环引物LB-ipa 0.6-1.0uM
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为志贺氏菌基因组DNA(1～100nM)。
本发明通过提供一种对志贺氏菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在志贺氏菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在志贺氏菌。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性强、敏感性比PCR高或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即可完成)等优点。
附图说明
图1本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后可通过肉眼观察的结果。图例：1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。
图2本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)的后加入染料观察的结果。图例：1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。
图3本发明所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)的结果的电泳图：
1图例：1：100bp marker；2：痢疾志贺菌；3-14：分别为肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素A菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株、大肠杆菌0157：H7、变形杆菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、阴性对照上述细菌均为标准菌株。
具体实施方式
下面通过具体的志贺氏菌检测过程来对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例一 对已知菌株的ipaH基因的扩增
一)引物组的设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出志贺氏菌特异性基因ipa H的1095---1299bp核酸序列，针对该片段的六个位点(1095-1112bp、124-1141bp、1173-1194bp、1207-1227bp、1261-1279bp、1280-1299bp)设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物；引物设计通过LAMP专用引物设计软件结合分子生物学分析软件Advance Vector NTI完成。
序列编号1
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
序列编号2
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
序列编号3
正向内引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
序列编号4
反向内引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
所述6个位点的序列分别为：
1095-1112bp：ataccgtctctgcacgca
1124-1141bp ttccgtgaacaggtcgct
1173-1194bp agcttcgacagcagtctttcgc
1207-1227bp tgccactgagagctgtgagga
1261-1279bp aaccctcctggtccatcag
1280-1299bp gcatcagaaggccttttcga
其中，
所述正向外引物F3：扩增始于1095-1112bp(ataccgtctctgcacgca)
所述正向内引物FIP：扩增始于1173-1194bp(agcttcgacagcagtctttcgc)的互补序列和1124-1141bp(ttccgtgaacaggtcgct)；
所述反向外引物B3：扩增始于1280-1299bp(gcatcagaaggccttttcga)的互补序列；
反向内引物BIP：扩增始于1207-1227bp(aaccctcctggtccatcag)和1261-1279bp(aaccctcctggtccatcag)的互补序列。
上述引物组中各引物的共性在于：与志贺氏菌特异性基因ipaH的1095---1299bp核酸序列互补。
二)本实施例实验的菌株与各菌株的扩增结果如下表一
表一(为了便于理解，本申请人将下列序号与图1中编号设置成一致)
| 序号 | 分子量标准品供试菌株 | 有无扩增 |
| 1 | 100bp marker | |
| 2 | 痢疾志贺菌(CMCC-51252) | 阳 |
| 3 | 肠炎沙门菌(ATCC-13076) | 阴 |
| 4 | 鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115) | 阴 |
| 5 | 伤寒沙门菌(CMCC-50071) | 阴 |
| 6 | 金黄色葡萄球菌标准株(CMCC-26003-25) | 阴 |
| 7 | 金黄色葡萄球菌产肠毒素A菌株(ATCC-13565) | 阴 |
| 8 | 金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株(ATCC-14458) | 阴 |
| 9 | 金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株(ATCC-19095) | 阴 |
| 10 | 大肠杆菌O157:H7(CMCC-44050-3) | 阴 |
| 11 | 副溶血性弧菌(VPL 4-90) | 阴 |
| 12 | 奇异变形杆菌(CMCC-49005) | 阴 |
| 13 | 霍乱弧菌(569B) | 阴 |
| 14 | 阴性对照 | 阴 |
上述供试菌株均为标准菌株，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。“阴”表示无扩增反应，“阳”表示有扩增反应。
三)上述各菌株基因DNA的提取
细菌待检标本(除金黄色葡萄球菌以外)用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒(如TIANamp Bacteria DNA Kit)提取模板DNA或加30ul三蒸水煮沸5分钟，直接取2ul上清液作模板DNA；金黄色葡萄球菌标本需用肠道增菌液增菌培养8-12小时后用基因组DNA提取试剂盒(TIANampBacteria DNA Kit)提取DNA。
四)基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液14.6ul，加2.0ul待检模板，加1ul酶，再加7.4ul ddH2O，形成如下表总体积为25ul的反应体系，在温度为65℃的恒温水浴锅保温约60分钟，然后升温至80℃、2分钟灭活酶。
反应体系为：(反应总体积为25ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipabetaine | 40uM40uM10uM10uM5M | 2.01.01.00.50.55.0 | 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM1M |
| dNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 10mM150mM10×8U/ul | 3.50.62.51.07.4 | 1.4mM3.6mM0.32U/ul |
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含1/10预定反应体积10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-ipa、1.6uM反向内引物BIP-ipa、0.2uM的正向外引物F3-ipa、0.2uM的反向外引物B3-ipa、1.4mM dNTP和1M甜菜碱(betaine)；
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
五)扩增产物的检测
随着扩增反应的进行，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应液中存在的镁离子将形成焦磷酸镁沉淀。因此，只有在发生核酸扩增的反应液中才会出现白色浑浊。这样可以通过如下方式进行判断。
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；(参见图1) 或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(Invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；(参见图2)或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在170bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。(参见图3)
经对扩增产物的检测，表明上述引物组对痢疾志贺菌出现LAMP扩增反应，对照菌未出现扩增反应，显示了良好的特异性。
6)灵敏度比较：
以痢疾志贺菌作为检测菌，将1×106CFU/mL的菌液做一系列稀释：106、105、104、103、102、101、100，分别用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分别为F3-ipa、B3-ipa)来检测，检测结果表明LAMP反应敏感性达100CFU/mL；PCR反应敏感性达101CFU/mL；结果显示LAMP反应敏感性比PCR反应敏感10倍。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增阶段，为了加快扩增反应速度，在所述扩增反应液还包括有：
序列编号5
正向环引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
序列编号6
反向环引物LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG
此时：
所述正向环引物LF-ipa：扩增始于1144-1165bp(atggctggaaaaactcagtgcc)的互补序列；
所述反向环引物LB-ipa：扩增始于1236-1258bp序列(cgctcacatggaacaatctccgg)。
此时反应体系为：(反应总体积为25ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipaLF-ipaLB-ipabetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 40uM40uM10uM10uM20uM20uM5M10mM150mM10×8U/ul | 1.01.01.00.50.51.01.05.03.50.62.51.06.4 | 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM0.8uM0.8uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul |
在加入上述正向环引物LF-ipa和反向环引物LB-ipa后只需在温度为65℃的恒温水浴锅保温约40分钟，然后升温至80℃、2分钟灭活酶。
实施例三
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipaLF-ipaLB-ipabetaine | 25uM25uM7.5uM7.5uM20uM20uM4M | 1.01.01.00.50.50.750.755.0 | 1.0uM1.0uM0.15uM0.15uM0.6uM0.6uM0.8M |
| dNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 10mM100mM10×8U/ul | 2.50.52.50.58.5 | 1.0mM2.0mM0.16U/ul |
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含1/10预定反应体积10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、2mM硫酸镁、1.0uM正向内引物FIP-ipa、1.0uM反向内引物BIP-ipa、0.15uM的正向外引物F3-ipa、0.15uM的反向外引物B3-ipa、1.0mM dNTP、0.6uM正向环引物LF-ipa、0.6uM反向环引物LB-ipa和0.8M甜菜碱(betaine)；
酶：Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
反应条件：在温度为60℃的恒温水浴锅保温约40分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
实施例四
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipaLF-ipaLB-ipa | 50uM50uM15uM15uM25uM25uM | 1.01.01.00.50.51.01.0 | 2.0uM2.0uM0.3uM0.3uM1.0uM1.0uM |
| betainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 7.5M10mM150mM10×16U/ul | 5.04.01.01.01.07.0 | 1.5M1.6mM6.0mM0.64U/ul |
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、6mM硫酸镁、2.0uM正向内引物FIP-ipa、2.0uM反向内引物BIP-ipa、0.3uM的正向外引物F3-ipa、0.3uM的反向外引物B3-ipa、1.6mM dNTP、1.0uM正向环引物LF-ipa、1.0uM反向环引物LB-ipa和1.5M甜菜碱(betaine)；
酶：BstDNA聚合酶(每微升含16个活性单位)，终浓度0.64U/ul。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
反应条件：在温度为65℃的恒温水浴锅保温约40分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
实施例五
本实施例与实施例二的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
此时反应体系为：(反应总体积为20ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipa | 40uM40uM10uM10uM | 1.00.80.80.40.4 | 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM |
| LF-ipaLB-ipabetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 20uM20uM5M10mM150mM10×8U/ul | 0.80.84.02.80.482.00.84.92 | 0.8uM0.8uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul |
实施例六
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
此时反应体系为：(反应总体积为100ul)
| 成分 | 储存液浓度 | 量(ul) | 终浓度 |
| 核酸模板FIP-ipaBIP-ipaF3-ipaB3-ipaLF-ipaLB-ipabetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O | 40uM40uM10uM10uM20uM20uM5M10mM150mM10×8U/ul | 10.04.04.02.02.04.04.020.0142.4104.019.6 | 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM0.8uM0.8uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul |
实施例七从呕吐物中分离的菌株的检测
菌株基因DNA的提取及扩增、检测
取食物中毒者呕吐物25g，用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，加30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液。另用前述肠道增菌培养液接种分离培养平板，菌落用生物-梅里埃GNI+卡及VITEC 32全自动微生物分析仪进行分离株的鉴定。
对上述提取的基因DNA与实施例一同样的通过LAMP法进行核酸扩增和扩增产物的检测。扩增结果与VITEC鉴定结果比对，如下表二。
| 菌株序号 | 有无扩增 | 鉴定结果 |
| 菌株1 | 有 | 痢疾志贺菌 |
| 菌株2 | 无 | 大肠杆菌 |
如表二所示，鉴定结果表明分离的菌株含有志贺氏菌和大肠杆菌，基于VITEC 32全自动微生物分析仪的鉴定结果与使用引物组合的检测结果一致，只有在鉴定为志贺氏菌的标本中观察到上述引物组合产生的扩增。
序列表
<110>珠海市疾病预防控制中心
<120>志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
<160>7
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ATACCGTCTCTGCACGCA 18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
TCGAAAAGGCCTTCTGATGC 20
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT 40
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT 40
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT 22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
CGCTCACATGGAACAATCTCCGG 23
<210>7
<211>205
<212>DNA
<213>志贺氏菌
<400>7
1095 ataccg tctctgcacg caatacctcc ggattccgtg aacaggtcgc
1141 tgcatggctg gaaaaactca gtgcctctgc ggagcttcga cagcagtctt tcgctgttgc
1201 tgctgatgcc actgagagct gtgaggaccg tgtcgcgctc acatggaaca atctccggaa
1261 aaccctcctg gtccatcagg catcagaagg ccttttcga 1299
Claims (13)
1.一种志贺氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为志贺氏菌的ipaH---GenBank登陆号：M32063，所述引物与所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
2.一种志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
正向内引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
反向内引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
可以扩增志贺氏菌的ipaH基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链。
3.根据权利要求2所述的志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组还包括：
正向环引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
反向环引物LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG。
4.根据权利要求3所述的志贺氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组可以扩增志贺氏菌的如下片断或互补链：
所述正向外引物F3：扩增始于1095-1112bp；
所述正向内引物FIP：扩增始于1173-1194bp的互补序列和1124-1141bp；
所述反向外引物B3：扩增始于1280-1299bp的互补序列；
所述反向内引物BIP：扩增始于1207-1227bp，和1261-1279bp的互补序列；
所述正向环引物LF-ipa：扩增始于1144-1165bp的互补序列；
所述反向环引物LB-ipa：扩增始于1236-1258bp序列。
5.一种志贺氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在志贺氏菌，其特征在于，以志贺氏菌的ipaH基因序列的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物或引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
6.根据权利要求5所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，具体检测方法为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；
2)志贺氏菌的环介导等温扩增
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约65℃条件下恒温保温约40--90分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。
7.反应总体积20ul～100ul的反应体系为：
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶。
3)LAMP反应产物的检测：
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I invitrogen1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在170bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
8.根据权利要求6所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，所述扩增反应液还包括：
正向环引物LF-ipa 0.6-1.0uM
反向环引物LB-ipa 0.6-1.0uM。
9.根据权利要求7所述的志贺氏菌检测方法，其特征在于，当反应总体积为25ul时，所述反应体系具体为：
。
10.一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物或引物组的扩增反应液、酶；
所述扩增反应液中包括如下试剂：
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8个活性单位、终浓度0.16-0.64U/ul的的Bst DNA酶。
11.根据权利要求9所述的一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液还包括：
正向环引物LF-ipa 0.6-1.0uM
反向环引物LB-ipa 0.6-1.0uM。
12.根据权利要求10所述的一种志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，扩增反应液：包含1/10预定反应体积10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-ipa、1.6uM反向内引物BIP-ipa、0.2uM的正向外引物F3-ipa、0.2uM的反向外引物B3-ipa、0.8uM正向环引物LF-ipa、0.8uM反向环引物LB-ipa、1.4mM dNTP和1M甜菜碱；
所述酶为每微升含8个活性单位，0.32U/ul的Bst DNA酶。
13.根据权利要求9或10或11所述的志贺氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为1～100nM志贺氏菌基因组DNA。
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