CN102952852A - 一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于转基因动物中转基因成分的分子检测技术领域，具体涉及提供一种适用于转人乙肝表面抗原山羊的快速简便检测方法，本发明利用环介导等温扩增法原理，准确快速检测出转基因山羊中的人乙肝表面抗原基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供了实用的分子检测方法。

Description

一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便检测方法

技术领域

本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及适用于转人乙肝表面抗原基因转基因山羊的快速简便检测方法。

背景技术

转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。

乙型肝炎(Hepatitis B)是世界上分布最广泛的传染病之一，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的。而乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV包膜蛋白的组分，具有良好的免疫原性，且HBV的保护性抗原表位主要集中于HBsAg，目前所研制的所有乙肝基因工程疫苗都是由HbsAg组成。我国已经研制出了转人乙肝表面抗原转基因山羊，转基因动物及其产品市场化是将来发展的必然趋势，因此建立一种快速、简便的检测转人乙肝表面抗原的转基因检测的方法，具有必要性和紧迫性。

综合目前各国对转基因产品的检测技术，根据检测目标，可将其分为以下三个水平：插入的外源基因的检测；插入外源基因的表达产物(RNA或者蛋白质)的检测；插入的外源基因对受体生物基因表达的影响(外源基因的插入对位点附近的基因的影响从而对整个生物体的代谢的影响)的研究，而其中核酸水平的检测应用更为广泛。

核酸水平的检测，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR检测转基因产品，通常涉及以下技术：定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、热不对称交错PCR等。

PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法，需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，但必须依赖PCR仪和电泳仪等仪器设备，检测费用高，对检测人员有较高的技术要求，无法在条件较差的基层或现场进行。研发一种不需要设备，是与基层和现场快速检测转基因动物的方法具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的局限性，提供适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因山羊中人乙肝表面抗原基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。

实现本发明的技术方案如下：

(1)引物设计及合成：根据人乙肝表面抗原(HBsAg)基因(登录号：Genbank：AF223961)设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：

FIP：5′-CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3′，

BIP：5′-AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3′；

F3：5′-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3′，

B3：5′-AAACAGTGGGGGAAAGCC-3′；

(2)环介导等温扩增反应

以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μlEP管中，于90℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；

(3)环介导恒温扩增产物分析

1)琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(浓度为40％的甘油，0.2％溴酚蓝，59.8％0.25M Tris-HCl)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人乙肝表面抗原基因(即含有转基因成分)，若没有阶梯型条带则判定为不含人乙肝表面抗原基因。

2)荧光染料染色：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍(按体积计)后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝表面抗原基因。

本发明成功建立了对转人乙肝表面抗原基因快速、灵敏、特异而又简单实用的检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点：

1.本发明经济实用：反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，例如水浴锅即可。

2.本发明的灵敏度高：采用本方法可以检测下限至10个拷贝的转人乙肝表面抗原基因，比普通的PCR的灵敏度高10倍。

3.本发明的特异性强：本发明采用设计了4条引物，可识别6个特异性区域，增加了与目的基因结合的特异性。

4.本发明的检出率高：对5头转人乙肝表面抗原基因的转基因山羊进行检测，均检测出转基因成分，检出率为100％，对15个人的DNA样品进行了LAMP扩增，结果表示，检出率为100％。

5.本发明检测简单：直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是扩增的人乙肝表面抗原(HBsAg)基因(登录号：Genbank：AF223961)的部分核苷酸序列，序列长度为194bp。序列表SEQ ID NO：2-5分别是设计的引物序列(序列编号依次为：FIP；BIP；F3和B3)。

图1：本发明扩增的人乙肝表面抗原基因的特异片段，片段全长为194p，序列线条标记部分为引物所处位置，序列中方框所示位置为限制性内切酶HaeIII识别的酶切位点。

图2：PCR扩增人乙肝表面抗原基因电泳图，图中：M：DL2000 DNA marker；1-3：模板为人基因组DNA；4：模板为非转基因山羊基因组DNA；5：水。：

图3：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因电泳图，图中：M：DL2000 DNA marker；1-3：模板为人基因组DNA；4：模板为非转基因山羊基因组DNA；5：水。

图4：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因可视化结果，图中1-3：模板为人基因组DNA；4：模板为非转基因山羊基因组DNA；5：水。

图5：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因产物酶切组成图，图中方框所示部分为酶切后产物组成。

图6：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因产物酶切验证电泳图，图中：M：DL2000 DNA marker；1：LAMP扩增产物；2：酶切后的LAMP扩增产物。

图7：是本发明构建的pMD18T-HbsAg的结构图，图中显示了插入HBsAg(人乙肝表面抗原)基因片段。

图8：LAMP与PCR扩增人乙肝表面抗原基因检出限比较，图中：M：DL2000 DNA marker；1-7：pMD18T-HBsAg质粒拷贝数依次10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10、5拷贝；8：非转基因山羊；9：水。

图9：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因检出限试验可视化结果，图中：1-7：pMD18T-HBsAg质粒拷贝数依次10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10、5拷贝；8：非转基因山羊；9：水。

图10：LAMP检测转人乙肝表面抗原基因转基因山羊，图中：M：DL2000 DNA marker；1-5：转人乙肝表面抗原基因转基因山羊；6：阳性对照，pMD18T-HBsAg质粒；7：阴性对照，非转基因山羊基因组DNA；8：水。

图11：：LAMP检测转人乙肝表面抗原基因转基因山羊可视化结果，图中：1-5：转人乙肝表面抗原基因转基因山羊；6：阳性对照，pMD18T-HBsAg质粒；7：阴性对照，非转基因山羊基因组DNA；8：水。

图12：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因电泳图，图中：M：DL2000 DNA marker；1-15：模板为人基因组DNA；16：模板为阳性对照质粒；17：模板为非转基因山羊基因组DNA；18：水。

图13：LAMP扩增人乙肝表面抗原基因可视化结果，图中1-15：模板为人基因组DNA；16：模板为阳性对照质粒；17：模板为非转基因山羊基因组DNA；18：水。

具体实施方式

实施例1：对人乙肝表面抗原基因目的片段进行扩增

1、样品的获得

1)转人乙肝表面抗原(简称HBsAg)转基因山羊基因组DNA的耳组织样品由中国农业大学农业生物技术国家重点实验室提供。按照TIANGEN的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒及其说明书操作(试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)进行提取转基因山羊DNA。

2)人的血液样品(采自中国湖北省武汉市)，用于提取基因组DNA，构建阳性质粒，验证检出率。按照常规方法采集人血样，采用报道的酚-氯仿抽提法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京：2005版方法)抽提人基因组DNA，得到人基因组DNA。

2.常规PCR扩增

用常规的PCR扩增方法(萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京：2005)以两条外引物即编号为F3、B3的引物扩增人基因组DNA中人乙肝表面抗原基因的目的片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO：1和图1所示，序列全长194bp)。同时以非转基因山羊样品作为阴性对照。

1)反应体系：上游引物F3 0.2μM，下游引物B3 0.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM MgCl₂，75μM dNTPs，0.5UDNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。

2)反应程序：

95℃，5min；34个循环：95℃1min，58℃1min，72℃20s；72℃，5min。

3)结果判定：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：浓度为40％的(v/v)甘油，60％(v/v)0.25MTris-HCl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，然后在2％的琼脂糖凝胶中电泳30min后，通过凝胶成像系统成像，可见长度为194bp大小的扩增片段，结果如图2所示。

3、LAMP扩增

以引物FIP、引物BIP的核苷酸序列为内引物，以引物F3、引物B3所示的引物为外引物对人基因组DNA进行恒温扩增，同时以非转基因山羊基因组DNA作为阴性对照。

1)反应体系：试剂组成如下：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U BstDNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl。

2)反应程序：将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min；然后置80℃下5min终止反应。

3)结果分析与判定

①琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：40％(v/v)甘油，60％(V/V)0.25MTris-HCl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察是否有阶梯型条带出现，若有阶梯型条带则判定为含有人乙肝表面抗原基因，若没有阶梯型条带则判定不含有人乙肝表面抗原基因。

②荧光染料染色：SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝表面抗原基因。

③结果判定：在上述分析方法①中，在凝胶成相系统的紫外灯下，模板为人基因组DNA，即含有人乙肝表面抗原基因时，可以观察到阶梯型条带，而模板为非转基因山羊基因组DNA时，则观察不到阶梯型条带，其结果如图3所示。在上述分析步骤②中，当模板为人的基因组DNA，即含有人乙肝表面抗原基因时，扩增产物变为黄绿色，当模板为非转基因山羊基因组DNA时，扩增产物为棕黄色，其结果如4所示。

4)LAMP扩增产物特异性检验：对LAMP扩增产物进行酶切验证

LAMP扩增产物在电泳检测不是呈现一条带，而是呈现出由多条带组成的阶梯型条带，这是因为这种方法在扩增过程中形成以目的片段，连接在一起的长短不一的开环产物所造成。

本发明中人乙肝表面抗原基因目的片段(其核苷酸序列见图1所示)大小为194bp，在120bp处存在限制性内切酶HaeIII所识别的酶切位点，在酶切位点处切开的产物分别由图5中所示方框部分组成，酶切后的两段长度应分别是55bp和106bp。因此可使用HaeIII对LAMP扩增产物进行酶切，验证LAMP扩增得到的阶梯型条带是否由人乙肝表面抗原基因目的片段所组成，

①酶切反应体系：取3μlLAMP扩增产物，加入0.8μl限制性内切酶HaeIII(购自Fermentas公司)和1μlbuffer，双蒸水补至10μl。

②反应程序：于37℃恒温培养箱中酶切6小时。

③结果判定：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(配方：浓度为40％(v/v)甘油，60％(v/v)0.25MTris-HCl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察到酶切以后的LAMP扩增产物不再有阶梯型条带，结果如图6所示。结果说明本发明中LAMP扩增所得到的产物是人乙肝表面抗原基因。

实施例2：人乙肝表面抗原基因LAMP检测方法灵敏度试验

用含目的基因的质粒pMD18T-HBsAg作模板，验证基因LAMP检测方法的检出限，并与PCR方法的检出限作对比。具体步骤如下：

1、质粒pMD18T-HBsAg的构建

1)人乙肝表面抗原基因目的片段PCR产物的回收纯化

用PCR方法以两条外引物即引物F3(其序列见SEQ ID NO：4)、引物B3(其序列见SEQ ID NO：5)扩增人基因组DNA。反应体系：上游引物F3 0.2μM，下游引物B3 0.2μM，1μl PCR buffer，1.5mMMgcl₂，75μM dNTPs，0.5U DNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。反应程序：95℃，5min；34个循环：95℃1min，58℃1min，72℃20s，72℃，5min。

取50μL PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳30min，凝胶成相系统上成像。可以看到194bp大小的片段，结果如图2所示。将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)回收DNA。

2)目的片段PCR产物与pMD18-T载体连接：将回收产物与pMD18-T载体(购自武汉大风生物科技有限公司)连接，连接体系为：0.5μL pMD-18T载体，3.5μL solution I，3μL回收产物，将上述试剂混匀后4℃连接过夜。pMD18T-HbsAg的结构图如图7所示。

3)连接产物的转化、pMD18T-HBsAg质粒的鉴定及提取：取5μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃循环水中热击90s，快速冰浴1-2min使细胞冷却，加入500μL LB液体培养基，37℃摇床上培育45min，在4000rpm离心5min，弃去500μL上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100μL涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平皿上，37℃培养12h。用经高压蒸汽灭菌(121℃，灭菌30min)的10μL移液器头挑取菌落置于800μL含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养4h，然后通过菌液PCR挑选阳性菌液，然后送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果经比对确认以后，用质粒小提试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒的说明书介绍的方法操作)提取质粒，并测定质粒浓度。

4)计算质粒拷贝数

计算质粒拷贝数，其公式为：

(6.23×10²³拷贝/mol)×(浓度g/ml)÷[碱基数×(660道尔顿/碱基)]＝拷贝数/ml

用双蒸水将质粒pMD18T-HBsAg进行倍比稀释，使其终浓度为10⁶拷贝/μl，10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，5拷贝/μl。

2、LAMP方法检测检出限试验：

利用本实施例中所稀释好的质粒pMD18T-HBsAg为模板，采用LAMP方法和PCR方法进行检测的灵敏度试验。

1)LAMP方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T-HbsAg

以引物FIP、BIP为内引物，以引物F3、B3为外引物对本实施例中步骤1得到的质粒pMD18T-HBsAg进行LAMP扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：10⁶个，10⁵个，10⁴个，10³个，10²个，10，5个。

①反应体系：试剂组成如下：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl。

②反应程序：将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min；然后置80℃下5min终止反应。

2)PCR方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T-HBsAg

同时以两条外引物F3、B3进行PCR扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为：10⁶个，10⁵个，10⁴个，10³个，10²个，10个，5个.

①反应体系：上游引物F3 0.2μM，下游引物B3 0.2μM，1μl PCR buffer，1.5mM Mgcl₂，75μMdNTPs，0.5U DNA聚合酶，人基因组DNA 1μL，用双蒸水补齐至10μL。

②反应程序：95℃，5min；34个循环：95℃1min，58℃1min，72℃20s；72℃，5min。

2)结果分析：

经琼脂糖凝胶电泳后得到结果：当pMD18T-HBsAg质粒为10²个拷贝时，PCR方法能扩增出特异性条带，当pMD18T-HBsAg质粒为10个拷贝时，PCR方法未能扩增出特异性条带，因此判定PCR方法对pMD18T-HBsAg质粒的扩增下限为10²个拷贝；当pMD18T-HBsAg质粒为10个拷贝时，LAMP方法能扩增出阶梯型条带，而当pMD18T-HBsAg质粒为5个拷贝时，LAMP方法未能扩增出阶梯型条带，因此判定LAMP对pMD18T-HBsAg质粒的扩增下限为10个拷贝，PCR与LAMP比较的结果如图8所示。LAMP扩增产物中，取5μl加入0.5μlSYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果，结果：质粒拷贝数依次为：10⁶个，10⁵个，10⁴个，10³个，10²个，10个时，扩增产物变为黄绿色，而质粒拷贝数为5时，扩增产物则为棕黄色，结果如图9所示。

本实施例中，LAMP方法灵敏度高，采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人乙肝表面抗原目的基因，是普通PCR灵敏度高10倍。

实施例3：对转人乙肝表面抗原基因的转基因山羊及人基因组DNA进行LAMP检测

对5头转人乙肝表面抗原的转基因山羊DNA样品及15个人基因组DNA样品进行LAMP检测，试验中所用转基因山羊的基因组DNA以及人的基因组DNA样品，均稀释到20ng/μl。

1)LAMP扩增过程：

以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于90℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；

2)结果分析：

①琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(40％(v/v)甘油，60％(v/v)0.25M Tris-HCl，0.2％(w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则含有人乙肝表面抗原基因，若没有阶梯型条带则不含人乙肝表面抗原基因。

②荧光染料染色：将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人乙肝表面抗原基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含有人乙肝表面抗原基因。

③结果判定：本实施例的LAMP检测方法检测出了转人乙肝表面抗原基因山羊的人乙肝表面抗原基因成分，如图10、图11及人DNA样品中的人乙肝表面抗原基因成分，如图12、图13。

Claims (1)

1.一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速、简便检测方法，其步骤包括：

(1)引物设计及合成：根据人乙肝表面抗原基因的序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：

FIP：5’-CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3’，

BIP：5’-AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3’；

F3：5’-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3’，

B3：5’-AAACAGTGGGGGAAAGCC-3’；

(2)环介导等温扩增反应：

以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于90℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；

(3)环介导恒温扩增产物分析：

1)琼脂糖凝胶电泳：取2μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，该缓冲液包含浓度为40％的甘油、0.2％溴酚蓝和59.8％0.25M Tris-HCl，混匀，再按质量体积计加2％琼脂糖凝胶，于5V/cm下电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有梯形条带出现；

2)将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBRGreen I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。

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