CN110592250A - 用于检测肠道致病菌的lamp引物组合及其应用 - Google Patents

用于检测肠道致病菌的lamp引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请提出一种LAMP引物组合，用于检测肠道致病菌，其包括下列引物组中的至少一种；引物组I，用于检测空肠弯曲杆菌；引物组II，用于检测沙门氏菌；引物组III，用于检测志贺氏菌；引物组IV，用于检测幽门螺杆菌；引物组V，用于检测霍乱弧菌O1群；引物组VI，用于检测霍乱弧菌O139群；其具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。

Description

用于检测肠道致病菌的LAMP引物组合及其应用
技术领域
本申请涉及微生物检测技术。
背景技术
腹泻是夏秋季节的常见病、多发病，危害严重，发病的原因复杂，易感人群广泛，其主要病原体有：细菌、病毒、生物因素等，而细菌性感染又是腹泻最常见的病因。另外，食品安全国家标准(GB29921-2013)中规定了食品中致病菌限量要求。因此肠道致病菌是临床诊断及食品安全检验的重要检测项目。
肠道致病菌主要有空肠弯曲杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群等。
肠道致病菌的检测主要有以下几种方法：(1)细菌培养。该方法能够得到肠道致病菌数量和特性等方面的定性及定量结果，但大都需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离培养、挑单个可疑菌落做生物化学试验和血清学分型鉴定等步骤，整个过程工作量大，检测周期长，通常需要4-7天，且所检测的细菌增殖要为可见菌落，灵敏度偏低，容易发生错检和漏检。(2)免疫学检测方法是一种可以定性、定量和定位的综合技术，将高度专一性的抗原-抗体反应与高度敏感的酶催化作用相结合，但免疫学方法也存在一定的缺点，免疫学检测方法一般需足够数量的纯化细菌，需对样品进行浓缩来提高菌液浓度，一般需要进行较长时间的前增菌，因而在短时间内很难得到检测结果。(3)分子生物学检测方法。分子生物学技术已被大量应用于流感的早期快速诊断。聚合酶链式反应PCR和环介导等温扩增技术LAMP是目前发展最成熟的分子诊断技术，可以从基因水平检测肠道致病菌。
LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，目前建立的LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像、焦磷酸沉淀或荧光来判定结果。琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像只能分析LAMP反应的最终结果，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定；焦磷酸沉淀或荧光法检测虽然避免了气溶胶污染。
近几年发展起来的分子检测技术,特别是PCR技术,在微生物快速鉴定和检测方面的应用,为肠道致病菌的快速检测开辟了新的途径。但是,PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受到限制。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6～8个区域的4～6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的肠道致病菌。
发明内容
鉴于上述问题，本发明旨在提出一种LAMP引物组合，以快速、准确检测肠道致病菌。
第一方面，本申请提出一种LAMP引物组合，用于检测肠道致病菌，其包括下列引物组中的至少一种；
引物组I，用于检测空肠弯曲杆菌，其包括如下序列：
序列1，TTTGCCTTTTCTGGAGCACT，作为外引物F3；
序列2，TTTTCAACCTGCTGAAGAGG，作为外引物B3；
序列3，TCTTAAAAAAGGTGCGATGATGGCTTCCATGACCACCCCTTCCAAT，作为内引物FIP；
序列4，AGGCATATTGTGCCATCCAAAAACGGTGCTAAGGCAATGATAGAAG，作为内引物BI
序列5，CTTCGGATAGTTATAGTATTGAAGT，作为环引物LF；
序列6，TCACTATCAAATTTTTCAAACAATCC，作为环引物LB；
引物组II，用于检测沙门氏菌，其包括如下序列：
序列7，TGGTAAATTTCGGCGCATTA，作为外引物F3；
序列8，GACCACTACGCCGACATC，作为外引物B3
序列9，TACGCTGAATTTTTTCGCTCGTACCTACAGCGGCAATTTCAACCAT，作为内引物FIP；
序列10，GGTCTGGATTCGCAGGTCAATTTAACATTATCCGAAGCGATAGCCT，作为内引物BIP；
序列11，CCTCCGGCTTTTGGCCTG，作为环引物LF；
序列12，CAATGCGTCTTATCGCTACGC，作为环引物LB；
引物组III，用于检测志贺氏菌，其包括如下序列：
序列13，TCCGGATTCCGTGAACAG，作为外引物F3；
序列14，GGAACATTTCCCTGCCCA，作为外引物B3；
序列15，ATCAGCAGCAACAGCGAAAGACCTGCATGGCTGGAAAAACTC，作为内引物FIP；
序列16，CGCGCTCACATGGAACAATCTCAGCGCCGGTATCATTATCGA，作为内引物BIP；
序列17，TCGAAGCTCCGCAGAGGCAC，作为环引物LF；
序列18，GTCCATCAGGCATCAGAAGGC，作为环引物LB；
引物组IV，用于检测幽门螺杆菌，其包括如下序列：
序列19，GGAAGAATGTTGTGTTCACCA，作为外引物F3；
序列20，CTGCAATCAATCATGCGTTAG，作为外引物B3；
序列21，CGCACTATGCACACTTTCCACACTTTAATAATATCAGGAGCGTGTCC，作为内引物FIP；
序列22，CAATAGCTGCCATAGTGTCTTCCACCAGACAAATACGATGTGCAAGTC，作为内引物BIP；
序列23，CTGAAGGTGCTGGCGGC，作为环引物LF；
序列24，CTTCATTCAAAGTGTCTGTGTG，作为环引物LB；
引物组V，用于检测霍乱弧菌O1群，其包括如下序列：
序列25，TGTGCACATCTTCAAAGCAA，作为外引物F3；
序列26，GCTTGTCGGATCAATATCCAT，作为外引物B3；
序列27，GGTACTGGGTACGCCACTGGTATTATCTTCGGTAAGCGATGATACG，作为内引物FIP；
序列28，ATTGTTAGATAAGGTAACCGCTCGTCCGTTTAGGCCCCAACACC，作为内引物BIP；
序列29，GCAGAAGATTGAAGCTTCGCTT，作为环引物LF；
序列30，ACAGACTCGAGCAATGGCAAG，作为环引物LB；
引物组VI，用于检测霍乱弧菌O139群，其包括如下序列：
序列31，CGGATCTGAGTCATATCCCA，作为外引物F3；
序列32，GGACACACCACAGCAATT，作为外引物B3；
序列33，AACCACATCCGCACCTTCCAACCAGTTACCATCAAAGGCTATG，作为内引物FIP；
序列34，GTTGCACGTAAGCCGGGTATGTCTGCCAATGCTTTCACAATG，作为内引物BIP；
序列35，AGGCGTTGGGTCTTCAC，作为环引物LF；
序列36，ATCTGTTCAATGTGAACGCTG，作为环引物LB。
第二方面，本申请还提出一种试剂盒，其包上述的LAMP引物组合。
第三方面，本申请提出一种利用上述的LAMP引物组合检测待测细菌的方法，其包括：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述的LAMP引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有空肠弯曲杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有志贺氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有幽门螺杆菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有霍乱弧菌O1群。
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有霍乱弧菌O139群。
第四方面，本申请还提出上述的LAMP引物组合在检测待测细菌或待测样本的应用。
本发明提出的LAMP引物组合，用于检测肠道致病菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。
附图说明
图1为采用引物组I的验证结果图；
图2为采用引物组II的验证结果图；
图3为采用引物组III的验证结果图；
图4为采用引物组IV的验证结果图；
图5为采用引物组V的验证结果图；
图6为采用引物组VI的验证结果图；
图7为样本I的检测结果图；
图8为样本II的检测结果图；
图9为样本III的检测结果图；
图10为样本IV的检测结果图；
图11为样本V的检测结果图；
图12为样本VI的检测结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
试剂盒的制备
试剂盒包括六个LAMP引物组，每个引物组用于检测一种肠道致病菌。
用于检测空肠弯曲杆菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列1)：TTTGCCTTTTCTGGAGCACT
外引物B3(序列2)：TTTTCAACCTGCTGAAGAGG
内引物FIP(序列3)：TCTTAAAAAAGGTGCGATGATGGCTTCCATGACCACCCCTTCCAAT
内引物BI(序列4)：AGGCATATTGTGCCATCCAAAAACGGTGCTAAGGCAATGATAGAAG
环引物LF(序列5)：CTTCGGATAGTTATAGTATTGAAGT
环引物LB(序列6)：TCACTATCAAATTTTTCAAACAATCC
用于检测沙门氏菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列7)：TGGTAAATTTCGGCGCATTA
外引物B3(序列8)：GACCACTACGCCGACATC
内引物FIP(序列9)：TACGCTGAATTTTTTCGCTCGTACCTACAGCGGCAATTTCAACCAT
内引物BIP(序列10)：GGTCTGGATTCGCAGGTCAATTTAACATTATCCGAAGCGATAGCCT
环引物LF(序列11)：CCTCCGGCTTTTGGCCTG
环引物LB(序列12)：CAATGCGTCTTATCGCTACGC
用于检测志贺氏菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列13)：TCCGGATTCCGTGAACAG
外引物B3(序列14)：GGAACATTTCCCTGCCCA
内引物FIP(序列15)：ATCAGCAGCAACAGCGAAAGACCTGCATGGCTGGAAAAACTC
内引物BIP(序列16)：CGCGCTCACATGGAACAATCTCAGCGCCGGTATCATTATCGA
环引物LF(序列17)：TCGAAGCTCCGCAGAGGCAC
环引物LB(序列18)：GTCCATCAGGCATCAGAAGGC
用于检测幽门螺杆菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列19)：GGAAGAATGTTGTGTTCACCA
外引物B3(序列20)：CTGCAATCAATCATGCGTTAG
内引物FIP(序列21)：CGCACTATGCACACTTTCCACACTTTAATAATATCAGGAGCGTGTCC
内引物BIP(序列22)：CAATAGCTGCCATAGTGTCTTCCACCAGACAAATACGATGTGCAAGTC
环引物LF(序列23)：CTGAAGGTGCTGGCGGC
环引物LB(序列24)：CTTCATTCAAAGTGTCTGTGTG
用于检测霍乱弧菌O1群引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列25)：TGTGCACATCTTCAAAGCAA
外引物B3(序列26)：GCTTGTCGGATCAATATCCAT
内引物FIP(序列27)：GGTACTGGGTACGCCACTGGTATTATCTTCGGTAAGCGATGATACG
内引物BIP(序列28)：ATTGTTAGATAAGGTAACCGCTCGTCCGTTTAGGCCCCAACACC
环引物LF(序列29)：GCAGAAGATTGAAGCTTCGCTT
环引物LB(序列30)：ACAGACTCGAGCAATGGCAAG
用于检测霍乱弧菌O139群引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列31)：CGGATCTGAGTCATATCCCA
外引物B3(序列32)：GGACACACCACAGCAATT
内引物FIP(序列33)：AACCACATCCGCACCTTCCAACCAGTTACCATCAAAGGCTATG
内引物BIP(序列34)：GTTGCACGTAAGCCGGGTATGTCTGCCAATGCTTTCACAATG
环引物LF(序列35)：AGGCGTTGGGTCTTCAC
环引物LB(序列36)：ATCTGTTCAATGTGAACGCTG
用于检测空肠弯曲杆菌的引物组命名为引物组I。用于检测沙门氏菌的引物组命名为引物组II。用于检测志贺氏菌的引物组命名为引物组III。用于检测幽门螺杆菌的引物组命名为引物组IV。用于检测霍乱弧菌O1群的引物组命名为引物组V。用于检测霍乱弧菌139群的引物组命名为引物组VI。
实施例2
特异性验证
待测菌为志贺氏菌(ATCC 700407)、空肠弯曲杆菌(ATCC43464)、沙门氏菌(ATCC700136)、幽门螺杆菌(ATCC700392)、霍乱弧菌O1群(CVCC 1969)及霍乱弧菌O139群(2.2086)。
1、提取待测菌的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：5.0μL反应液(北京热景生物技术股份有限公司产品)、1μL引物混合物和0.5pg～50ng模板DNA，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温30min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
采用引物组I的结果见图1。只有当待测菌为空肠弯曲杆菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为空肠弯曲杆菌以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组II的结果见图2。只有当待测菌为沙门氏菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为沙门氏菌以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组III的结果见图3。只有当待测菌为志贺氏菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为志贺氏菌以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组IV的结果见图4。只有当待测菌为幽门螺杆菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为幽门螺杆菌以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组V的结果见图5。只有当待测菌为霍乱弧菌O1群的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为霍乱弧菌O1群以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组VI的结果见图6。只有当待测菌为霍乱弧菌O139群的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为霍乱弧菌139群以外的其它五种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，本发明提供的六组引物组分别对其靶标菌具有很高的特异性。
实施例3
灵敏度验证
以30min为标准，分别稀释对应基因组模板，换算成基因组拷贝数为103，102，101；引物组I检测靶标菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系，引物组II检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组III检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组IV检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系，引物组V检测靶标菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系，引物组VI检测靶标菌的灵敏度为102个拷贝数/反应体系。
实施例4
待测样本为如下的样本
样本一：已通过细菌培养鉴定确认含有空肠弯曲杆菌的腹泻物；
样本二：已通过细菌培养鉴定确认含有沙门氏菌的腹泻物；
样本三：已通过细菌培养鉴定确认含有志贺氏菌的腹泻物；
样本四：已通过细菌培养鉴定确认含有幽门螺杆菌的腹泻物；
样本五：已通过细菌培养鉴定确认含有霍乱弧菌O1群的腹泻物；
样本六：已通过细菌培养鉴定确认含有霍乱弧菌O139群的腹泻物。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系与反应条件均同实施例3。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
样本一的结果见图7。只有采用引物组Ⅰ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本二的结果见图8。只有采用引物组Ⅱ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本三的结果见图9。只有采用引物组III的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本四的结果见图10。只有采用引物组IV的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本五的结果见图11。只有采用引物组V的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本六的结果见图12。只有采用引物组VI的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组VI以外的其它五个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，利用本发明提供的引物组合进行肠道致病菌的检测，结果准确可靠。
以上结果表明，利用本发明提供的引物组合进行肠道致病菌的检测，结果准确可靠。
序列表
表1：检测肠道致病菌的LAMP引物

Claims (4)

1.一种LAMP引物组合，用于检测肠道致病菌，其包括下列引物组中的至少一种；
引物组I，用于检测空肠弯曲杆菌，其包括如下序列：
序列1，TTTGCCTTTTCTGGAGCACT，作为外引物F3；
序列2，TTTTCAACCTGCTGAAGAGG，作为外引物B3；
序列3，TCTTAAAAAAGGTGCGATGATGGCTTCCATGACCACCCCTTCCAAT，作为内引物FIP；
序列4，AGGCATATTGTGCCATCCAAAAACGGTGCTAAGGCAATGATAGAAG，作为内引物BI
序列5，CTTCGGATAGTTATAGTATTGAAGT，作为环引物LF；
序列6，TCACTATCAAATTTTTCAAACAATCC，作为环引物LB；
引物组II，用于检测沙门氏菌，其包括如下序列：
序列7，TGGTAAATTTCGGCGCATTA，作为外引物F3；
序列8，GACCACTACGCCGACATC，作为外引物B3
序列9，TACGCTGAATTTTTTCGCTCGTACCTACAGCGGCAATTTCAACCAT，作为内引物FIP；
序列10，GGTCTGGATTCGCAGGTCAATTTAACATTATCCGAAGCGATAGCCT，作为内引物BIP；
序列11，CCTCCGGCTTTTGGCCTG，作为环引物LF；
序列12，CAATGCGTCTTATCGCTACGC，作为环引物LB；
引物组III，用于检测志贺氏菌，其包括如下序列：
序列13，TCCGGATTCCGTGAACAG，作为外引物F3；
序列14，GGAACATTTCCCTGCCCA，作为外引物B3；
序列15，ATCAGCAGCAACAGCGAAAGACCTGCATGGCTGGAAAAACTC，作为内引物FIP；
序列16，CGCGCTCACATGGAACAATCTCAGCGCCGGTATCATTATCGA，作为内引物BIP；
序列17，TCGAAGCTCCGCAGAGGCAC，作为环引物LF；
序列18，GTCCATCAGGCATCAGAAGGC，作为环引物LB；
引物组IV，用于检测幽门螺杆菌，其包括如下序列：
序列19，GGAAGAATGTTGTGTTCACCA，作为外引物F3；
序列20，CTGCAATCAATCATGCGTTAG，作为外引物B3；
序列21，CGCACTATGCACACTTTCCACACTTTAATAATATCAGGAGCGTGTCC，作为内引物FIP；
序列22，CAATAGCTGCCATAGTGTCTTCCACCAGACAAATACGATGTGCAAGTC，作为内引物BIP；
序列23，CTGAAGGTGCTGGCGGC，作为环引物LF；
序列24，CTTCATTCAAAGTGTCTGTGTG，作为环引物LB；
引物组V，用于检测霍乱弧菌O1群，其包括如下序列：
序列25，TGTGCACATCTTCAAAGCAA，作为外引物F3；
序列26，GCTTGTCGGATCAATATCCAT，作为外引物B3；
序列27，GGTACTGGGTACGCCACTGGTATTATCTTCGGTAAGCGATGATACG，作为内引物FIP；
序列28，ATTGTTAGATAAGGTAACCGCTCGTCCGTTTAGGCCCCAACACC，作为内引物BIP；
序列29，GCAGAAGATTGAAGCTTCGCTT，作为环引物LF；
序列30，ACAGACTCGAGCAATGGCAAG，作为环引物LB；
引物组VI，用于检测霍乱弧菌O139群，其包括如下序列：
序列31，CGGATCTGAGTCATATCCCA，作为外引物F3；
序列32，GGACACACCACAGCAATT，作为外引物B3；
序列33，AACCACATCCGCACCTTCCAACCAGTTACCATCAAAGGCTATG，作为内引物FIP；
序列34，GTTGCACGTAAGCCGGGTATGTCTGCCAATGCTTTCACAATG，作为内引物BIP；
序列35，AGGCGTTGGGTCTTCAC，作为环引物LF；
序列36，ATCTGTTCAATGTGAACGCTG，作为环引物LB。
2.一种试剂盒，其包括权利要求1所述的LAMP引物组合。
3.一种利用权利要求1所述的LAMP引物组合检测待测细菌的方法，其包括：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述的LAMP引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有空肠弯曲杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有志贺氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有幽门螺杆菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有霍乱弧菌O1群。
如果采用所述引物组Ⅵ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有霍乱弧菌O139群。
4.权利要求1所述的LAMP引物组合在检测待测细菌或待测样本的应用。
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