CN104593501A - 检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的pcr方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)的有扩增内标的PCR方法及试剂盒，涉及生物技术领域，本方法使用方便、可靠性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准化操作。所述方法包括：(1)利用primer premier 6.0软件设计针对单增李斯特菌的一对特异性引物，再增加扩增原核生物16s rDNA保守序列的27F/1492R引物作为扩增内标，2对引物共同使用进行扩增；(2)取待检测样品增菌培养6-8小时；培养后的增菌液采用煮沸冻融法提取基因组DNA作为模板进行扩增；(3)取试剂盒的PCR反应预混液配置25μl反应体系进行扩增，琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察检测结果。

Description

检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测食品中单增李斯特菌的有扩增内标的PCR方法及试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)广泛存在于自然界中，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力，造成极大的经济损失。食品中存在的单增李氏菌严重危胁着人类的健康与食品安全，由于该菌不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在4℃的环境中仍可生长繁殖，是肉类、乳制品等冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。据调查，4-8％的水产品、5-10％的奶及其产品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪肉等而感染，约占85-90％的病例是由被污染的食品引起的。因此，单增李斯特菌在食品安全上具有非常重要的地位，在食品微生物检验中，必须加以重视。

目前，单增李斯特菌检测方法主要有培养法、实时荧光定量PCR(real-timePCR)方法、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法、免疫磁珠法、普通PCR法、酶联免疫吸附方法(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)等。目前，单增李斯特菌的国家标准检测方法(GB4789.30-2010)是培养法，培养法采集样品后，先增菌培养18-24h，再挑取可疑菌落进行生化鉴定；其缺点是：培养周期长，费时费力，而且对于仍然具有致病性的“活的非可培养状态”(Viable But Non-Culturable，VBNC)的细菌敏感性较低，可导致检测结果呈假阴性，尤其是污染率较高的冷冻食品假阴性率较高，造成极大的食品安全隐患。Real-time PCR方法和全自动微生物生化鉴定系统所用试剂和仪器都较昂贵，而且对操作人员的要求较高，尤其对于大批量样品的检测成本非常高，常规实验室难以接受；而且Real-time PCR和LAMP方法可能因为样品存在对酶活性具有抑制作用的物质而导致结果呈现假阴性；此外，LAMP方法敏感性高，但非常容易造成气溶胶污染，产生假阳性，造成检测结果错误；ELISA免疫学方法操作复杂，费时费力且不便于标准化及高通量操作。

发明内容

鉴于上述各种方法的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测周期短、敏感性高、特异性强、操作简单、成本低廉、可准确地检测食品中单增李斯特菌的试剂盒及方法，可在1d之内得到结果，同时无需昂贵的仪器和复杂的试剂，避免因为样品存在DNA聚合酶的抑制因子而得到假阴性结果，可用于多种食品中单增李斯特菌的检测等。

本发明的技术解决方案是：一种检测食品中单增李斯特菌的扩增内标PCR方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

(a)样品的采集：无菌采集可疑食品；

(b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的营养肉汤培养基225ml，37±1℃振荡培养6-8h，得增菌液；

(c)DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1.5ml于离心管中1000r/min离心1min，除去较大块的食品碎片，取上清10000r/min离心10min，除去上清液，用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，10000r/min离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000r/min离心5min，取上清液，得样品模板DNA；

(d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行；

依次取PCR反应预混液24ul、样品模板DNA 1ul加入至PCR反应管中混合均匀，制得样品模板DNA的PCR反应管；按样品模板DNA的PCR反应管的制备方法依次制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中的阴性对照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中提供的阳性对照品代替；每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照。

(e)扩增检测：将制备好的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物，PCR的具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.6℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min；

(f)检测结果判定：取1g琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷却，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物2-5ul加入凝胶孔中

进行电泳；电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果：①阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；②若阳性对照的凝胶孔没有出现条带，则说明提取的DNA中含有抑制PCR反应的因素，建议重新提取DNA后再进行检测；③若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；④阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；⑤被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为被检样品阳性。

本发明的有益效果：与现有的检测方法相比，本试剂盒及检测方法使用方便、可靠性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准化操作，又能鉴别因试剂中存在PCR反应抑制成分而导致的假阴性结果，对提高食品安全水平具有重要意义。

附图说明

图1检测成功的结果；

图2提取的DNA中有PCR抑制剂时扩增得到的结果；

图3PCR反应管制备过程中有交叉污染时扩增得到的结果；

图4检测样品中单增李斯特菌阴性时扩增得到的结果；

图5检测样品被单增李斯特菌污染，扩增呈阳性时得到的结果。

具体实施方式

实施例

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1.无菌采集可疑食品后取25g，用无菌研钵或研磨器研磨碎，或者用无菌均质袋均质2min，与225ml无菌营养肉汤增菌液混合，置于37±1℃增菌培养6-8h，得到增菌液；

2.增菌液振荡混匀后取1.5ml增菌液至离心管中，1000r/min离心1min去除食品碎片，取上清10000r/min离心10min，弃上清，用无菌去离子水重悬沉淀，10000r/min离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000r/min离心5min，取上清液，得样品模板DNA；

3.将试剂盒中的PCR反应预混液等置于冰上融化后，取PCR反应预混液24ul置于PCR反应管中，再加入模板DNA 1ul，用移液器吹打混合均匀；按照样品DNA的PCR反应管制备方法依次制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的模板DNA用试剂盒中的阴性对照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的模板DNA用试剂盒中提供的阳性对照品代替；每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照。

4.PCR反应管制备好之后置于PCR仪上进行扩增，具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.6℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。

5.PCR反应结束后，取2-5ul PCR产物进行电泳，紫外灯下观察检测结果。

图1到图5中，M：250bp DNA分子量标准；阳：阳性对照；阴：阴性对照；检：被检测样品。

如图1所示，阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，说明检测成功。

如图2所示，阳性对照没有条带，说明提取的DNA中含有酶抑制剂，建议去除可能的抑制因素后重新进行PCR检测。

如图3所示，阳性对照和阴性对照都有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测。

如图4所示，阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，样品孔只有1条约1500bp的条带，结果呈阴性，说明样品中没有单增李斯特菌。

如图5所示，阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，样品孔有2条带，说明被检样品呈阳性，样品中有单增李斯特菌污染。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)的试剂盒，其特征是：

该试剂盒包含：无菌去离子水，聚合酶链反应PCR反应预混液，对照品；

所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液，MgCl₂，脱氧核糖核苷三磷酸，检测用引物，Taq DNA聚合酶，DNA染料；

所述检测用引物为如下4条引物的混合物：

inlAF：ATGCTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG；

inlAR：TCGCTATCGCCAGTTGTAGGGAGTG；

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为无菌去离子水，阳性对照品为inlAF/inlAR和27F/1492R两对引物的扩增产物经凝胶电泳纯化回收得到的DNA片段。

2.如权利要求1所述的试剂盒检测食品中单增李斯特菌的方法，其特征在于：

具体操作步骤是：

(a)样品的采集：无菌采集可疑食品；

(b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的营养肉汤培养基225ml，37±1℃振荡培养6-8h，得增菌液；

(c)DNA提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1.5ml于离心管中1000r/min离心lmin，除去较大块的食品碎片，取上清10000r/min离心10min，除去上清液，用无菌去离子水重悬、洗涤沉淀，10000r/min离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴5min，冰浴5min，1000r/min离心5min，取上清液，得样品模板DNA；

(d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行；

依次取PCR反应预混液24ul、样品模板DNA 1ul加入至PCR反应管中混合均匀，制得样品模板DNA的PCR反应管；按样品模板DNA的PCR反应管的制备方法依次制备阴性对照品和阳性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中的阴性对照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中提供的阳性对照品代替；每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照；

(e)扩增检测：将制备好的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物，PCR的具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.6℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min；

(f)检测结果判定：取1g琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷却，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物2-5ul加入凝胶孔中进行电泳；电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果：①阳性对照的凝胶孔有两条电泳条带而阴性对照的凝胶孔无任何条带，则PCR反应检测成功；②若阳性对照的凝胶孔没有出现条带，则说明提取的DNA中含有抑制PCR反应的因素，建议重新提取DNA后再进行检测；③若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果不可靠，建议重新进行PCR检测；④阳性对照有2条带，阴性对照没有条带，被检样品的凝胶孔只出现1条约1500bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断为阴性；⑤被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一致，阴性对照无条带，则判定为被检样品阳性。

3.根据权利要求2所述的检测食品中单增李斯特菌的方法，其特征是：所述引物PCR反应体系为PCR反应液24μl、样品模板DNA 1μl。

4.根据权利要求2所述的检测食品中单增李斯特菌的方法，其特征是：进行PCR扩增时，具体反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、55.6℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。