CN101386892B

CN101386892B - 一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片及其检测方法

Info

Publication number: CN101386892B
Application number: CN2008100299889A
Authority: CN
Inventors: 黄吉城; 马文丽; 张海燕; 相大鹏; 幸芦琴; 钟玉清; 郭波旋; 胡龙飞; 洪烨; 师永霞; 李小波; 郑夔; 商涛; 郑文岭
Original assignee: Institute Of Genetic Engineering Of Southern Medical University; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Institute Of Genetic Engineering Of Southern Medical University; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2028-08-05
Also published as: CN101386892A

Abstract

本发明提供了一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片及其检测方法。本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测及分型基因芯片，包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针包括流感病毒探针、登革热病毒探针、黄热病病毒探针和乙脑病毒探针。本发明采用病毒核酸的限制性荧光标记的方法对待检核酸进行处理。本发明将流感病毒、登革热病毒、黄热病毒、乙脑病毒多种病毒的探针集合在同一芯片的多种病毒联合芯片，能准确检测出各种病毒核酸，同时可以对甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型、登革病毒I-IV型作分型。

Description

一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种基因芯片及其检测方法，特别是一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片及其检测方法。

背景技术

近期，越南已有十多人感染禽流感死亡。WHO专家已多次发出警告，一旦禽流感在人与人之间传播，有可能像前几次流感大流行一样，导致人类数以百万计死亡的大灾难。东南亚的人禽流感和登革热，非洲、美洲的黄热病等等，人类正面临各种新发传染病和死灰复燃的传染病的严峻挑战。广东省地处对外交流的前沿，每天出入境人员很多，各种病原体从外国传入并导致流行的危险性时刻存在。其中一个关键问题在于多种病原体至今仍缺乏快速准确的检测方法。

及时、准确、快速地诊断是病毒性传染病疾病防控非常关键的环节。由于病毒性传染病疾病早期症状都以发热为主，仅靠临床很难做出准确诊断。因此，实验室检测极为重要。病毒感染常规的病原学诊断包括电镜形态观察、病毒分离、血清中病毒抗体的检测，以及病毒抗原、病毒核酸的检测。病毒分离法是检测病毒的“金标准”方法，但病毒培养的周期较长，既费时又繁琐，不利于疾病的早期诊断；血清学检查常用的有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光分析法(IFA)、中和试验等，这些方法更多用于回顾性诊断，而非早期诊断；病毒核酸的检测，如RT-PCR和实时荧光PCR技术，具有高度的特异性和敏感性，已成为最常用的核酸诊断技术。然而病毒株的变异较快以及有些病毒具有多种血清型等因素，使得根据已知病毒序列设计出来的引物可能无法扩增出相应的基因片段，常常导致假阴性结果。而寻找新的亚型和病毒株也是常规PCR技术所无法胜任的。而且，这些方法基本上是要每一种病毒逐一排查，常常由于样品量不够，时间不允许，成本过高等因素变得无法在实际工作中得到落实。因此，急需一种高通量的技术来实现大范围的快速筛查，才能满足口岸卫生检疫既要确保国门安全、又要在高流量的情况下仍能做到人、物都快速通关的实际工作需要。

基因芯片技术是最近十几年国际上才兴起的一种快速、自动化基因检测新技术。利用计算机芯片制备过程中的精密加工技术，将大量DNA探针分子固化于平方厘米大小的固体表面，在特定的条件下与荧光标记的样品分子进行杂交，然后通过激光共聚焦显微镜或CCD相机扫描并收集杂交信号，并利用生物信息学软件对杂交结果进行进一步的分析。DNA芯片技术已广泛应用于基因表达分析、多态性检测、克隆选择与文库筛选、肿瘤及遗传性疾病的突变检测及诊断和致病机理研究、药物筛选等多个领域。也有应用于微生物鉴定方面的研究，但多数集中在细菌鉴定为主，病毒方面相对较少，国内外都开始这方面研究工作，但尚未见有多病毒基因芯片试剂盒研制成功的报道。国际上基因芯片制备技术取得了重大突破，但可用于临床基因诊断的产品尚未出现。在国内，已有个别就单个疾病的诊断芯片向国家SFDA开始了申报工作，但成熟产品尚未面市，多病毒诊断的综合性基因芯片产品尚未见报道。

发明内容

本发明的主要目的在于克服上述技术缺陷，提供一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片检测病毒的检测方法。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片，包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针包括流感病毒探针、登革热病毒探针、黄热病病毒探针和乙脑病毒探针。。

流感病毒探针包括流感病毒H1N1型和流感病毒H3N2型。

登革热病毒探针包括登革热病毒I型、登革热病毒II型、登革热病毒III型和登革热病毒IV型。

寡核苷酸探针序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22的寡核苷酸片段。

本发明的一种利用上述的出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片检测病毒的方法包括以下步骤：

(1)病毒核酸的提取及反转录；

(2)病毒核酸的限制性荧光标记；

(3)杂交和检测。

其中，步骤(2)病毒核酸的限制性荧光标记包括以下步骤：

(1)cDNA的限制性酶切：取逆转录得到的cDNA，用Sau3A I进行酶切，得到具有GATC的粘性末端的cDNA片段；

(2)将步骤(1)得到的酶切片段加接头：将步骤(1)得到的酶切片段与与两条寡核苷酸SIP、SIR退火，所述SIP的序列为pGATC^mCACACCAGCCAAACCCA、所述SIR的序列为GGTTTGGCTGGTGTG；

(3)以步骤(2)得到的已加接头的酶切片段为模板，用荧光标记的通用引物U进行PCR扩增。

本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片采用特异性的60mer寡核苷酸作为流感病毒、登革热病毒、黄热病病毒和乙脑病毒等病原体诊断芯片检测的探针，可以一次检测多种病原体，并能有效的分型。相对于一些PCR产物作为探针或短链的寡核苷酸来说，长链寡核苷酸作为探针具有较高的特异性，因而以60mer寡核苷酸作为探针可以有效的降低假阳性率。

本发明的一种利用上述出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片检测病毒的检测方法中采用了限制性荧光标记技术处理临床咽漱液及血清样品。临床样品中病毒的拷贝数可能比较低，用常规的随机引物延伸标记效率低，因而大多数研究者采用数对特异性引物进行PCR扩增后检测，这种方法不能体现芯片检测的优越性，且有漏诊的可能。采用限制性荧光标记，可对病毒全基因组进行扩增，从而对提高检出率有较大意义。此外，限制性标记技术并非针对特定靶片段设计，故无论样品中有何种病原体的核酸，都可以得到有效扩增，有效克服PCR扩增法荧光标记样品时多种引物互相干扰、扩增病毒核酸受很大限制等缺点，解决了一个检测芯片同时检测多种病毒时遇到的关键问题。应用在多种病原体高通量检测上，有重要的意义。大量的实验结果证实，该技术标记样品，芯片检测灵敏度、准确度都大幅度提高。

本发明将流感病毒探针、登革热病毒探针、黄热病病毒探针和乙脑病毒探针多种病毒探针集合在同一芯片的多种病毒联合芯片，在同一实验条件下，能准确检测出各种病毒核酸，同时可以对甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型、登革病毒I-IV型作分型。该类检测芯片不但可应用于出入境检验检疫系统口岸疾病监测时大规模样本的筛查，而且可应用于疾病预防控制系统、医院等单位的疾病监测，对及早发现和控制该类传染病非常重要。

附图说明

图1是本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片的芯片阵列设计图的一个优选实施例；

图2是甲型流感病毒H1N1、H3N2、登革病毒I-IV型、JEV(乙脑病毒)和YFV(黄热病毒)分别与本发明的基因芯片的杂交结果；

图3是DVI(登革热I型)RNA样品RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4是DVI(登革热I型)样品的芯片杂交结果；

图5是芯片稳定性实验结果；

图6是模拟样品污染实验杂交结果图；

图7是模拟样品降解实验杂交结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1

本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片的制备的一个优选实施例。

(1)60mer寡核苷酸探针及阵列的设计：根据以下原则：①Tm值在78℃±5℃；②重复的碱基连续不超过6个，③探针内部的发夹结构不超过6个；④BLAST与其它序列的相似性小于40％；⑤BLAST比较与其它基因的重复片段连续不超过20个碱基。另外加入阴性和空白对照各3个，将芯片设计成12×14的阵列。

(2)60mer寡核苷酸基因芯片的制备：参照斯坦福大学Pat Brown实验室方案，用poly-L-lysine溶液包被DAKO硅烷化玻片，室温放置2周备用。用ABI公司3900DNA合成仪合成寡核苷酸片段后，将其溶解在50％DMSO中，调整终浓度为1mg/mL，选取HBV 70mer oligo作为阴性对照，50％DMSO为空白对照，用Cartesian Pixsys 5500基因芯片打印仪将探针片段打印成12×14的阵列，将芯片正面朝下至于3×SSC盐水湿盒上方再水合化，然后迅速的置入100℃温箱中干燥，用紫外交联仪以65mJ的总能量进行交联固定，以使探针共价交联结合在玻片表面，用封闭液(335ml 1-甲基-2-吡咯酮烷，6g琥珀酸酐，15ml 1M硼酸钠pH 8)进行封闭后备用。

实施例2

本发明的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片阵列的一个优选实施例。

将根据试验结果筛选出的22条寡核苷酸探针、2条GFP阳性外对照探针和polyU阳性内对照探针一起打印在芯片上，同时设置空白对照，进一步优化多种病毒联合检测芯片实验条件。每个探针6个重复点，点距为300μm。阵列设计如图1。

实施例3

本发明的一种利用出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片检测病毒的检测方法中病毒核酸的提取及反转录步骤的一个优选实施例。

采用样品加等体积水饱合酚混匀，65℃加热10min后在迅速冰上冷却，加1/2体积氯仿抽提，取上清加1/10体积pH5.2的3M NaAc，2倍体积无水乙醇于-80℃沉淀30min，4℃离心沉淀，70％乙醇洗涤后干燥，加DEPC水溶解。取上述制备的RNA5μL，10mM dNTP 5μL，5×第一链缓冲液10μL，Rnase Inhibitor2.5μL，随机引物5μL，反转录酶SuperScript II 2.5μL，加DEPC处理水至50μL总体积。42℃反应50min。向第一链反应混合物中加入10×第二链缓冲液25μL，E.coli DNA Pol 4μL，E.coli RNAse H 1μL，E.coli DNA Ligase 1.5μL，加ddH₂O至总体积250μL，12℃1h，22℃1h，加入2.5μL 0.5M EDTA中止反应后用酚∶氯仿(25∶24)抽提一次，乙醇醋酸钠沉淀后溶于10μL ddH₂O中。

实施例4

本发明的一种利用出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片检测病毒的检测方法中病毒核酸的限制性荧光标记的一个优选实施例。

(1)cDNA的限制性酶切

取全量逆转录得到的cDNA，加入1.6μL Sau3A I，2.4μL 10×H酶切缓冲液，用ddH₂O将体积调定到24μL，在37℃下酶切4h，100℃水浴2min灭活，酶切后所有cDNA片段均具有GATC的粘性末端。

(2)酶切片段加接头

酶切片段两端加上的通用接头由两条单链寡核苷酸SIP(500μg/μL)、SIR(600μg/μL)逐渐降温退火而成，含有可与Sau3A I酶切位点互补的粘性末端。在EP管中加入5μL cDNA酶切反应液，3μL通用接头，2μL T4DNA连接酶，3μL10×buffer，17μL ddH₂O，16℃保持2h，最后以Pharmacia S-400离心柱除去接头二聚体和小于100bp的小片段，收集洗脱液作为限制性荧光标记的模板。

(3)限制性cDNA片段的荧光标记

根据接头序列和内切酶粘端序列设计荧光标记的通用引物U，于PE公司9700型PCR仪进行扩增并荧光标记，反应体系为3μL通用引物，1μL加接头的cDNA反应液，25μL2×PCR预混液，21μLddH₂O，反应参数为95℃变性5min，(95℃30s，60℃30s，72℃60s)共25个循环，72℃延伸7min，-20℃储存。

实施例5

杂交与检测分析的一个优选实施例。

(1)杂交：取5μl荧光标记好的限制性cDNA片段加入等体积的2×杂交液(50％Formamide、10×SSC、0.2％SDS)，95℃变性5min，最大速度离心2min冷却，滴加到阵列上，盖上盖玻片封闭，42℃杂交2h。然后依次在2×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC溶液中清洗玻片，灭菌水漂洗后，无水乙醇脱水，室温下干燥。

(2)扫描结果的分析及统计学处理：用Agilent 48道芯片扫描仪扫描芯片，FeatureExtraction软件分析数据处理分析：所有探针的以荧光强度取均值，以Cy5的杂交信号为参照，对Cy3荧光标记的检测信号进行均一化处理。芯片的诊断以均一化值ratio值来判断：均一化值计算：R1＝(探针Cy3荧光值-空白对照Cy3荧光值)/(探针Cy5荧光值-空白对照Cy5荧光值)；R2＝探针R1值×2/(阳性内对照1的R1值+阳性内对照2的R1值)；R3HIV探针的R2/阴性对照的R2(2.7～3.3)结果判断：R3小于2.7的为阴性；R3大于等于2.7和小于等于3.3的为可疑样本；R3大于3.3的为阳性。通过分析，确定芯片打印及杂交条件是否均一，评价结果的敏感度和精确度，并对点样和杂交的过程做进一步的优化。

实施例6

芯片特异性实验一个优选实施例。

芯片上打印有2条60mer的GFP寡核苷酸探针，针对不同的RNA或者DNA样品，在样品的标记过程中分别掺入相应的GFP基因的DNA和RNA，用RD标记后的样品与芯片杂交并检测其荧光信号，通过对芯片上荧光信号的判读来确定样品中是否含有要检测的目的基因。如果芯片上除了阳性内对照探针poly(U)外，其它探针全为阴性，那么可能样品并非真的阴性，而是反应条件的不佳或者操作的失误导致样品标记效率低所引起的；只有作为阳性外对照的GFP探针为阳性而诊断探针为阴性时才可以判断为阴性结果。经优化后设计的芯片能对甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、DV1～4型、JEV和YFV进行联合检测及分型。

不同样品与改进后的芯片杂交结果如图2所示，结果表明上述芯片能将甲型流感病毒H1N1、H3N2、登革病毒1～4型、JEV和YFV明确的分别检测出来。筛选出的oligo探针都能特异性地与相应样品杂交，检测到较强的荧光信号，而阴性及空白对照探针均没有检测到信号。

用所制备的芯片检测HBV、HCV、HDV等其他病毒样品，结果均为阴性，显示有较好的特异性。

实施例7

芯片检测灵敏度比较的一个优选实施例。

为了比较芯片与其它方法的灵敏度，我们将芯片方法与荧光RT-PCR检测方法在PCR产物水平进行了比较。将登革病毒I型的RNA样品进行10¹、10²和10³倍稀释，然后进行逆转录、荧光标记后分别与芯片进行杂交，扫描芯片并通过分析软件GenPix6.0分析荧光强度(方法同前)，同时用RT-PCR技术检测相应样品，RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖电泳检测。检测结果图如图3。登革病毒I型的RNA样品10¹、10²和10³倍稀释后，分别进行RT-PCR检测及与芯片进行杂交，其结果如图3、4所示，由上述结果可知病毒检测芯片的灵敏度与普通RT-PCR基本相同。

实验中将登革病毒I型的RNA样品进行10¹、10²和10³倍稀释后分别进行RT-PCR检测及与芯片进行杂交，RT-PCR检测结果表明当样品稀释至10²倍时，琼脂糖电泳不能检测出相应的条带片段，而芯片检测结果也是当样品稀释至10²倍时，相应的特异性探针未能检测出阳性荧光信号。说明上述方法制备的病毒检测基因芯片的灵敏度与普通RT-PCR基本相同。

实施例8

芯片稳定性实验的一个优选实施例。

将制备好的芯片取四片储存于37℃温箱中加速保存(此条件下保存1天相当于在4℃条件下保存1.5个月)的条件下对芯片的稳定性进行验证，留样观察期为8天，分别于第2、4、6、8天进行取样检测：①芯片外观，看有无颜色变化；②与荧光标记后的JEV样品杂交，观察杂交结果。杂交、洗脱、扫描及数据分析方法参照前面章节。结果见图5。

实验中通过将芯片储存于37℃温箱中加速保存的条件下对芯片的稳定性进行验证，在留样观察期8天内，第2、4、6、8天的取样检测结果均合格，并且与荧光标记后的JEV样品杂交后其杂交特异性良好，说明本实验室制备的芯片保质期至少为十二个月。

实施例9

芯片重复性实验的一个优选实施例。

选择登革病毒I型及甲型流感病毒H1N1、H3N2进行芯片检测的重复性实验，每样品分别用5张芯片进行检测，具体的样品处理、芯片的杂交、洗脱、扫描及数据分析方法参照前面章节。选择登革病毒1型及甲型流感病毒H1N1、H3N2进行芯片检测的重复性实验，具体的检测结果见表1，该检测结果表明应用上述方法制备的寡核苷酸芯片检测上述中传染性病毒样品具有较好的重复性。

选择登革病毒I型及甲型流感病毒H1N1、H3N2进行芯片检测的重复性实验，表1为芯片的重复性检测结果，表中数据表明，应用上述方法制备的寡核苷酸芯片检测传染性病毒样品具有较好的重复性。

表1

*SNR为每种病毒样品特异探针点的荧光信号值与背景信号值之比(信噪比)

实施例10

模拟样品污染实验

(1)取K562细胞加接头的连接产物(含GFP样品加接头产物)各5μL，分别加入至2个0.2mL的Ep管中，标记为实验管和对照管。

(2)取荧光标记DV1样品1μL，稀释100倍，从稀释液中各取1μL加入上述实验管和对照管中。

(3)在实验管中加入以下反应液：

反应物体积

Sau3A I 1μl

10×H缓冲液 1μl

ddH₂O 2μl

对照管中加入4μl ddH₂O，同时置于37℃1h，100℃2min终止反应。

(4)对上述实验管和对照管中的样品进行荧光标记具体方法参照实施例4。

(5)芯片的杂交、洗脱、扫描及数据分析方法参照实施例5所述。

(6)比较上述两样品的杂交结果。

杂交结果见图6，结果显示实验管样品的杂交结果未受到模拟污染片段的影响，而对照管样品的杂交结果则出现了假阳性。

实施例11

模拟样品降解实验

(1)取DV1和GFP混合RNA样品各9μl，分别加入至2个0.2mL的Ep管中，标记为实验管和对照管。

(2)取1μL RNa se A(20ug/mL)，稀释100倍，从稀释液中取1μL加入上述实验管中，对照管中加入1μl DEPC处理水。

(3)对上述实验管和对照管中的样品进行逆转录及荧光标记，具体方法参照实施例3和实施例4。芯片的杂交、洗脱、扫描及数据分析方法参照实施例5所述。

(4)比较上述两样品的杂交结果。

实验结果见图7，结果表明实验管样品的杂交结果受到RNaseA的影响，仅阳性内对照有阳性信号，出现了假阴性，而对照管样品的杂交结果则阳性内对照、阳性外对照以及特异性诊断探针均能检测出阳性信号。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

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<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>DNA

<213>YFV

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ggaggcccag ttagctctca caatcatatc cctggataca aggttcagac gaacggacct 60

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<160>26

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>DNA

<213>YFV

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<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>DNA

<213>JEV

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gaatgcagtg gacctcagtg tggttgtgaa caagcccgtg ggaagatatc gctcagcccc 60

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<160>26

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>DNA

<213>JEV

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gacctcagtg tggttgtgaa caagcccgtg ggaagatatc gctcagcccc taaacgccta 60

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<210>1

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<212>DNA

<213>JEV

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gacttcggct ttggcatcac atcaacccgt gtgtggctga aaattagaga ggagagcact 60

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<160>26

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<212>DNA

<213>SIP

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gatccacacc agccaaaccc a 21

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<213>SIR

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ggtttggctg gtgtg 15

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<212>DNA

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<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

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<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>DNA

<213>GFP2

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ctgttgtagt tgtactccag cttgtgcccc aggatgttgc cgtcctcctt gaagtcgatg 60

Claims

1.一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片，包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针包括流感病毒探针、登革热病毒探针、黄热病病毒探针和乙脑病毒探针，所述寡核苷酸探针序列为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22的寡核苷酸片段。

2.如权利要求1所述的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片，其特征在于：所述流感病毒探针包括流感病毒H1N1型和流感病毒H3N2型。

3.如权利要求1所述的一种出入境检疫中常见病毒联合检测分型基因芯片，其特征在于：所述登革热病毒探针包括登革热病毒I型、登革热病毒II型、登革热病毒III型和登革热病毒IV型。