CN104328206A - 艰难梭菌二元毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明是根据艰难梭菌特异性保守基因cdtA和cdtB设计引物，然后以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增，再通过反应液的颜色变化或反应液浊度变化来快速定性检测待测样品是否携带艰难梭菌二元毒素；本发明可实现单独或同时检测艰难梭菌cdtA或/和cdtB，不需要复杂仪器即可在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测，可为艰难梭菌二元毒素的检测及毒素分型提供新的技术平台，指导临床诊疗及预防艰难梭菌高毒力菌株的暴发性流行，用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌二元毒素，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

技术领域

本发明涉及一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒，属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法技术领域。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile，Cd）为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于水、土壤等自然环境及动物和人的粪便中。艰难梭菌是一种条件致病菌，本身没有侵袭性，当人体肠道正常微环境遭到破坏时，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。

艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株的产毒因子主要包括毒素A和毒素B，由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受负向调节基因tcdC、正向调节基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE调节，以上基因共同构成了致病决定区。毒素A又称肠毒素，易导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。tcdC基因的多态性或部分碱基缺失可导致毒素A、B产生增加。此外，在北美洲和欧洲引起广泛暴发流行的027型艰难梭菌可以产生更强的毒素，即二元毒素（binary toxin，CDT）。CDT由CDT a 和CDT b这两种独立蛋白链组成，由致病性决定区外的2个染色体基因cdt A基因和cdt B基因编码。cdtA是一种ADP核糖转移酶，可阻断肌动蛋白片段的合成而诱导细胞死亡，cdtB是一种运输蛋白，被丝氨酸蛋白酶激活后，cdtB通过与宿主细胞结合，把cdtA转移至细胞液中，诱导细胞骨架解聚，生成微管突出物，增强艰难梭菌的定植。

据美国疾病预防控制中心报道，艰难梭菌共有150个PCR核酸型和24个毒素型，而毒力较强的菌株是027/B1/NAP1 （核酸电泳分型为027，限制性内切酶分型为BI，脉冲场凝胶电泳分型为NAP1），它产生毒素A、毒素B和CDT。该型tcdC基因存在18个碱基的缺失，导致毒力增强和毒素的增加，产生的毒素A和毒素B分别是传统毒株的16倍和23倍，特别该毒素Ⅲ型的出现及暴发性流行，导致该病的严重病例数、复发率和病死率均明显增高，耐药菌株也在增多。在荷兰分离出艰难梭菌菌株078/BK/NAP7，8（核酸电泳分型为078，限制性内切酶分型为BK，脉冲场凝胶电泳分型为NAP7，8），该菌株也产生毒素A、毒素B和CDT，该型tcdC基因有39bp缺失，并含第184位点突变，导致终止密码子提前产生。有证据表明，近年来艰难梭菌078型感染率逐年递增，人类和动物之间艰难梭菌078型基因序列高度一致，这意味着人和动物之间艰难梭菌078可能不存在种族壁垒，更有利于艰难梭菌078型的传播。此外，除了艰难梭菌023、045、130、122、267型等菌株含有CDT，CDT还广泛存在于产气荚膜梭菌E、螺旋形梭状芽胞杆菌、肉毒梭菌等梭菌中。

2000年至2003年，027/B1/NAP1型艰难梭菌在美国7个州8所医院暴发性流行。2009年艰难梭菌027型已在全美国流行，在芝加哥分离率为61%。2008年抽取欧洲34个国家106所医院进行CDI流行病学调查研究后发现，虽然欧洲各国CDI流行情况不一致，但总体呈增加趋势是比较肯定的（0.0~36.3，平均4.1/10000病人日）。日本、韩国、台湾、科威特等国家和地区的研究也支持CDI增加的结论。虽然各地报道的CDI发病率不一致，总的来说，加拿大医院感染监测中心估计，世界范围内的成人CDI发病率呈增加趋势（4.6/1000个入院患者，或者65/100000病人日）。随着CDI暴发频率增多、发病率增高、危害性变强，国民经济负担也随之加重。据Ghantoji等（Ghantoji SS， Sail K， Lairson DR et al. Economic healthcare costs of Clostridium difficile infection: a systematic review. J Hosp Infect 2010; 74:309–318.）的系统回顾分析，2010年美国用于控制CDI的费用是43.3千万-79.7千万/年。相继在欧洲和北美多次暴发和流行，中国艰难梭菌产毒株分离率达66.7%，近年在香港和广州有027型艰难梭菌的报道

(Wang P，Zhou, Y et al. Identification of Clostridium difficile ribotype 027 for the first time in Mainland China. Infect Control Hosp Epidemiol, 2014, 35(1): 95-98），这意味着高毒力027型菌株有可能在中国暴发性流行。目前鉴于其暴发频率、感染人数、危害性、国民的经济负担，迫切需要对艰难梭菌二元毒素进行有效的诊断和控制。

艰难梭菌二元毒素诊断的有效性依赖于检测方法的可靠性，目前国际流行的诊断方法包括脉冲电场凝胶电泳（PFGE）、限制性核酸内切酶分析（REA）、核酸检测（普通PCR和多重实时PCR），尚无统一的诊断“金标准”。脉冲电场凝胶电泳（PFGE）是根据不同大小的DNA 片段在一定大小孔径的琼脂糖凝胶中，由于电场的不断变化而改变其泳动方向的时间不同而将其分离。这种技术已被用于细菌和真菌的分型，显示出较好的鉴别力和重复性。不足之处：分型时间长、电泳条件复杂、需特殊的仪器和价格较高的试剂。限制性核酸内切酶分析（REA）是用高频裂解限制性核酸内切酶切割后，改变其片段的长度和数目，用常规凝胶电泳和溴乙啶染色，在紫外光下摄影可得不同图谱，根据流行病相关的菌株会产生相同或相似图谱的原理，用于细菌的分型。不足之处：DNA图谱条带太多，难以分辨，容易污染。目前国内最常用普通PCR和多重实时PCR检测艰难梭菌中的二元毒素，但因实验设备要求高、操作复杂、速度慢，扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤，不适合基层医院及现场快速检测的应用。因此，寻找快速、特异、敏感检测艰难梭菌中的二元毒素有助于及早筛选强毒力菌株，指导临床诊疗。

随着分子诊断技术的不断进步，T. Notomi (Notomi T， Okayama H， MasubuchiH， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 2000; 28(12): 63.)发明的一种新型核酸扩增技术—环介导恒温扩增技术（LAMP），该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在恒温（63~67℃）的条件下，利用高活性链置换DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），使得链置换DNA合成在不停地自我循环，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生，从而实现对目的基因的快速检测。该方法检测时间短（30~60min），无需特殊仪器，操作简便，配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结果。LAMP方法目前已经成功应用于细菌、病毒及寄生虫的定性和定量检测、胎儿性别鉴定和其他方面，成为常用的临床快速检验方法之一。但是迄今为止，市场上还未见用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP专用引物与试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法以及一种特异性和灵敏度较高的、用于上述检测艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法的专用引物。

本发明的目的还在于提供一种用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒。

本发明的技术方案如下：一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，包括如下步骤：

（1）引物的设计：分别对艰难梭菌cdtA和cdtB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的引物；

（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；所述待测物为人及动物的粪便或培养分离的菌株； 

（3）扩增反应结束后进行结果判定：扩增反应前，事先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应后反应液的颜色变化判断结果，反应液的颜色变绿色表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液的颜色变橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素。

经上述检测艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法步骤（1）设计优化获得用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的专用引物如下：

（1）用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的cdtA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：

F3：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG

B3：AATAGCTGATAGATAAGCTCCA

FIP：GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTTTAACTCTTACTTCCCCTGA

BIP：ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT

LF：AAATCATATTCAGGGGAA

LB：TTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTAC

所述cdtA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1； 

（2）用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的cdtB引物为以下两组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；所述各引物序列如下：

F3：GAGTCAAATACTGCTGGAGA

B3：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT

FIP：CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT

BIP：AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGTTTCCTTGATCAGTAGAGGCATG

所述cdtB引物中两组引物对（FIP和BIP）:（F3和B3）的摩尔比为8: 1。

采用本发明的检测方法，以上述专用引物进行LAMP扩增反应条件可为：检测cdtA时，扩增反应在57-64℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在57-68℃下恒温90min。

优选的，以上述专用引物进行LAMP扩增反应条件为：检测cdtA时，扩增反应在60℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在63℃下恒温90min；若同时检测艰难梭菌cdtA和cdtB，扩增反应条件为：61℃恒温90min。

本发明的检测方法中所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl（终反应体系为26μl），所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰。

以上述专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系优选如下：待测物的基因组DNA 2μl、20 mM Tris·HCl （pH 8.8）、10 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO₄、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA引物或cdtB引物，加双蒸水至体系总体积为25μL；所述引物加入量为：检测cdtA时，加入cdtA引物：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3）；检测cdtB时，加入cdtB引物：40 pmol（FIP和BIP）、5 pmol（F3和B3）。

一种用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒，包括上述用于对艰难梭菌二元毒素进行LAMP检测的cdtA引物及cdtB引物。

所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含二元毒素艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。

优选的，所述试剂盒中包括：20 mM Tris·HCl（pH 8.8）、10 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween 20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO₄、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA引物及cdtB引物、钙黄绿素指示剂、含二元毒素艰难梭菌的基因组DNA 和双蒸水；其中，cdtA引物为以下引物组合40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3）；所述cdtB引物为以下引物组合：40 pmol（FIP和BIP）、5 pmol（F3和B3）。

所述试剂盒可单独定性检测艰难梭菌cdtA或cdtB，还可以同时检测检测艰难梭菌cdtA和cdtB。

本发明相对于现有技术的有益效果如下：采取以上设计，本发明具有以下优点：

（1）高特异性：6条引物对艰难梭菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；

（2）高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；

（3）结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果（钙黄绿素显色），或可以直接用浊度仪判断结果（通过测定反应液的浊度判定的原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应，浊度上升表示待测样品中存在待测毒素（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在待测毒素（阴性））；

（4）操作简单：只要将检测样品（靶核酸）和检测试剂一起放入60-62℃恒温水浴锅或金属浴中90分钟后就可以判断结果；

（5）快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应90分钟内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL；

（6）同步：可按实验需要单独或同步检测cdtA和cdtB，快速检测艰难梭菌二元毒素携带情况。

本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌二元毒素携带情况，不需要复杂仪器，为艰难梭菌二元毒素的检测及毒素分型提供了新的技术平台，为临床诊疗及预后提供指导，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌二元毒素，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

附图说明

图1为实施例2艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。

图2为实施例2艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。

图3为实施例3艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。

图4为实施例3艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。

图5为实施例3艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。

图6为实施例3艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。

图7为实施例4艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。

图8为实施例4艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。

图9为实施例4艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。

图10为实施例4艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。

图11为实施例4艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。

图12为实施例4艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1通过以下步骤实施本发明：

1、用于对艰难梭菌二元毒素进行LAMP检测的引物设计

（1）用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌cdtA重复序列（GenBank: HQ639673.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQ ID NO：1），再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物的序列如表1。

表1  用于对艰难梭菌进行LAMP检测的cdtA引物

（2）用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌cdtB重复序列（GenBank: HQ639677.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQ ID NO：2），再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的引物，结果优化得到两组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，具体各引物的序列如表2。

表2  用于对艰难梭菌进行LAMP检测的cdtB引物          

2、艰难梭菌二元毒素的LAMP检测

（1）艰难梭菌cdtA的LAMP检测：以实施例1获得的用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的六条引物对艰难梭菌027/B1/NAP1 (来自南方医科大学南方医院消化内科，广东省胃肠疾病重点实验室）进行LAMP检测，步骤如下：

①以含cdtA艰难梭菌027/B1/NAP1的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增（由六条引物组成的cdtA引物的序列见序列表中SEQ ID NO：3），采用的25ul LAMP反应体系包括：艰难梭菌027/B1/NAP1基因组DNA 2μl，20 mM Tris·HCl (pH 8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.1% Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO₄，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，cdtA引物及其加入量为：40 pmol（FIP和BIP）、20pmol （LF和LB）、5 pmol（F3和B3），加ddH₂O至总容量25μl；LAMP的扩增条件为：置57-64℃，恒温90min；

②结果判定：用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果；

（2）艰难梭菌cdtB的LAMP检测：以实施例1获得的用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的四条引物对艰难梭菌027/B1/NAP1(来自南方医科大学南方医院消化内科，广东省胃肠疾病重点实验室）进行LAMP检测，步骤如下：

①以含cdtB艰难梭菌027/B1/NAP1的基因组DNA为模板，在实施例1获得的四条引物（表2）的引导下进行LAMP扩增（由四条引物组成的cdtB引物的序列见序列表中SEQ ID NO：4），其中，25ul LAMP反应体系包括：艰难梭菌027/B1/NAP1基因组DNA 2μl，20 mM Tris·HCl （pH 8.8），10 mM KCl，10 mM （NH₄）₂SO₄，0.1% Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO₄，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，cdtB引物及其加入量为：20 pmol （FIP和BIP）、5pmol （F3和B3），加ddH₂O至总容量25μl；LAMP的扩增条件为：置57-68℃，恒温90min；

（2）结果判定：用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果。

实施例2 在相同反应体系下，分别对不同反应条件含cdtA、cdtB艰难梭菌027/B1/NAP1的基因组DNA进行LAMP检测，以获得最佳反应温度。

经试验，本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图1所示）：58-62℃时，反应时间波动在47-48min，最佳反应条件为：60℃恒温90min。

本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图2所示）：61-65℃时，反应时间波动在35-40min，最佳反应条件为：63℃恒温90min。当艰难梭菌cdtA和cdtB同时检测，最佳反应条件为：61℃恒温90min。

实施例3 本发明艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法的特异性检测。

 一、本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌 O139 群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法的特异性。

本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图3所示，钙黄绿素染色检测结果如图5所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌 O139 群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14：鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：阴性对照，27：阳性对照）。

图3浊度曲线显示只有阳性对照曲线发生了上升，其他曲线均没有变化；图5中可以看出只有阳性对照显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌中的cdtA，其余均未检测到艰难梭菌cdtA。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌cdtA。

二、本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌 O139 群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法的特异性。

本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图4所示，钙黄绿素染色检测结果如图6所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌 O139 群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14:鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：阴性对照，27：阳性对照）。

图4浊度曲线显示只有阳性对照曲线发生了上升，其他曲线均没有变化；图6中可以看出只有阳性对照显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌cdtB，其余均未检测到艰难梭菌cdtB。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌cdtB。

实施例4 本发明艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法的灵敏度检测。

一、本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌cdtA的灵敏度，方法为：提取含二元毒素艰难梭菌027/B1/NAP1总DNA，然后以10倍梯度（1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍）进行稀释，使1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水），再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列为cdtA left和right，如表3所示）进行灵敏度检测。

表3用于PCR方法的引物序列

。

本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图7所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、 0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），代号1-4号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌cdtA，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtA的最低检测灵敏度为24.8pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图9所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），其中1-4号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌cdtA，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtA的最低检测灵敏度为24.8pg/μl；PCR检测结果如图11所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl l、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），其中1-3号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为248pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测方法可检测到24.8pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到248pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌cdtA的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。

二、本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌cdtB的灵敏度，方法为：提取含二元毒素艰难梭菌027/B1/NAP1总DNA，然后以10倍梯度（1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍）进行稀释，使1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水），再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列为cdtB left和right，如表4所示）进行灵敏度检测。

表4用于PCR方法的引物序列

。

本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图8所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、 0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），代号1-4号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌cdtB，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtB的最低检测灵敏度为24.8pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图10所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），其中1-4号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌cdtB，表明本发明引物组合对艰难梭菌cdtB的最低检测灵敏度为24.8pg/μl；PCR检测结果如图12所示（代号1-9模板中总DNA的浓度分别为24.8ng/μl、2.48ng/μl、248pg/μl、24.8pg/μl、2.48pg/μl、0.248pg/μl、0.0248pg/μl、0.00248pg/μl、0.000248 pg/μl，10模板为阴性对照（去离子水）），其中1-3号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为248pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测方法可检测到24.8pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到248pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌cdtB的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。

实施例5 用于艰难梭菌二元毒素的LAMP检测的试剂盒。

（1）用于艰难梭菌cdtA的LAMP检测的试剂盒：将20 mM Tris·HCl （pH 8.8），10 mM KCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.1% Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO₄，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，cdtA引物：40pmol （FIP和BIP）、20 pmol （LF和LB）、5pmol（ F3和B3）、钙黄绿素指示剂（用染色法检测时使用）以及作为阳性对照的含二元毒素A艰难梭菌的基因组DNA，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系（双蒸水）共同包装，再配以产品使用说明书（记载染色法和浊度法两种检测方法），得到用于检测艰难梭菌cdtA的LAMP试剂盒。

（2）用于艰难梭菌cdtB的LAMP检测的试剂盒：将20 mM Tris·HCl（pH 8.8），10 mM KCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.1% Tween20，0.8 M 甜菜碱，8 mM MgSO₄，1.4 mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，cdtB引物：40pmol （FIP和BIP）、5pmol （F3和B3）、钙黄绿素指示剂（用染色法检测时使用）以及作为阳性对照的含二元毒素B艰难梭菌的基因组DNA，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系（双蒸水）共同包装，再配以产品使用说明书（记载染色法和浊度法两种检测方法），得到用于检测艰难梭菌cdtB的LAMP试剂盒。

（3）用于艰难梭菌cdtA和cdtB同时检测：当需要同时进行艰难梭菌cdtA和cdtB的LAMP检测时，将上述（1）和（2）两种试剂盒同时使用，使用的最佳反应条件为：61℃恒温90min。

<110>申请人名称：南方医科大学南方医院

<120> 艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

<160> 4

 

<210> 1

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaaaat ttaggaaaca taaaaggatt agtaattgta tatctatatt gttgatatta 60

tatctaactt taggtggttt gttacctaat aacatttatg cacaagactt acaaagctat 120

agtgaaaaag tttgcaatac tacttacaag gctcctatag aaagaccaga agattttctt 180

aaagataaag aaaaggctaa agaatgggaa agaaaagaag cagaaagaat agagcaaaaa 240

cttgaaagat ctgaaaaaga agcattagaa tcatataaaa aagattctgt agaaataagt 300

aaatattctc agacaagaaa ttatttttat gattatcaaa tagaagcaaa ttctcgagaa 360

aaagaatata aagaacttcg aaatgctata tcaaaaaata aaatagataa acctatgtat 420

gtctattatt ttgaatctcc agaaaaattt gcatttaata aagtaataag aacagaaaat 480

caaaacgaaa tttcattaga aaaatttaat gagtttaaag aaactataca aaacaaatta 540

tttaagcaag atggatttaa agatatttct ttatatgaac ctggaaaagg tgatgaaaaa 600

cctacaccat tacttatgca cttaaaatta cctagaaata ctggtatgtt accatataca 660

aatactaaca atgtaagtac attaatagag caaggatata gtataaaaat agataaaatt 720

gttcgtatag ttatagatgg gaagcactat attaaagcag aagcatctgt tgtaagtagt 780

cttgatttta aagatgatgt aagtaagggg gactcttggg gtaaagcaaa ttataatgat 840

tggagtaata aattaacacc taatgaactt gctgatgtaa atgattatat gcgtggagga 900

tatactgcaa ttaataatta tttaatatca aatggtccag taaataatcc taacccagaa 960

ttagattcta aaatcacaaa cattgaaaa tgcattaaaac gtgaacctat tccaactaat 1020

ttaactgtat atagaagatc tggtcctcaa gaatttggtt taactcttac ttcccctgaa 1080

tatgatttta acaaactaga aaatatagat gcttttaaat caaaatggga aggacaagca 1140

ctgtcttatc caaactttat tagtactagt attggtagtg tgaatatgag tgcatttgct 1200

aaaagaaaaa tagtactacg tataactata cctaaaggtt ctcctggagc ttatctatca 1260

gctattccag gttatgcagg tgaatatgaa gtgcttttaa atcatggaag caaatttaaa 1320

atcaataaaa ttgattctta caaagatggt actataacaa aattaattgt tgatgcaaca 1380

ttgatacctt aa

 

<210> 2

<211> 1957

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaaatac aaatgaggaa taaaaaggta ttaagttttt taacacttac agctatagtt 60

agtcaagcac tagtatatcc tgtatatgct caaactagta caagtaatca ttctaataag 120

aaaaaagaaa ttgtaaatga agatatactc ccaaacaatg gattaatggg atattatttc 180

acagatgagc actttaaaga tttaaaatta atggcaccca taaaagatgg taatttaaaa 240

tttgaagaaa agaaagtaga taaacttctg gataaagaca aatcagatgt aaaatctata 300

cgatggacag gaagaataat tccttctaag gatggtgaat atacattatc aactgataga 360

gatgatgtct taatgcaagt aaatactgag agtactatat caaatacact taaagttaat 420

atgaaaaagg gtaaagaata taaagttaga atagagctac aagataaaaa tttaggttca 480

atagataatt tatcatcacc taatctttat tgggaattag atggtatgaa gaaaattata 540

ccagaagaaa atttattctt aagagattat tctaatatag aaaaagatga tccatttatc 600

ccaaataaca atttctttga cccaaagttg atgtctgatt gggaagacga agatttggat 660

acagataatg ataatatacc agattcatat gaacgaaatg gatatactat taaggactta 720

attgcagtta agtgggaaga tagttttgca gaacaaggct ataagaaata tgtatcaaat 780

tatttagagt caaatactgc tggagatcca tatacagatt atgaaaaagc ttcaggttct 840

tttgacaagg ctataaagac tgaagcaaga gatccgttag ttgcagcata tccaattgtt 900

ggagtaggta tggaaaaatt aattatatct acaaatgaac atgcctctac tgatcaaggt 960

aaaactgttt ccagagctac tactaacagt aaaactgaat ctaatacagc tggtgtgtct 1020

gttaatgtag gatatcaaaa tggattcaca gctaatgtaa ctacaaatta ttcccataca 1080

acagataatt caactgctgt tcaagatagt aatggagaat catggaatac tggattaagt 1140

ataaacaaag gagaatctgc atatataaat gcaaatgtta gatattacaa cacaggtact 1200

gcacctatgt acaaagtgac accaacaaca aatttagtgt tagatggaga tacattatca 1260

actatcaaag cacaagaaaa tcaaattggc aataatctat ctcctggaga tacttatccc 1320

aaaaaagggc tttcacctct agctcttaac acaatggatc aatttagctc tagactgatt 1380

cctataaatt atgatcaatt aaaaaaatta gatgctggaa agcaaatta aattagaaaca 1440

acacaagtaa gtggaaattt tggtacaaaa aatagttctg gacaaatagt aacagaagga 1500

aatagttggt cagactatat aagtcaaatt gacagtattt ctgcatctat tatattagat 1560

acagagaatg aatcttacga aagaagagtt actgctaaaa atttacagga tccagaagat 1620

aaaacacctg aacttacaat tggagaagca attgaaaaag cttttggcgc tactaaaaaa 1680

gatggtttgt tatattttaa tgatatacca atagatgaaa gttgtgttga actcatattt 1740

gatgataata cagccaacaa gattaaagat agtttaaaaa ctttgtctga taaaaagata 1800

tataatgtta aacttgaaag aggaatgaat atacttataa aaacaccaac ttactttact 1860

aattttgatg attataataa ttaccctagt acatggagta atgtcaatac tacgaataaa 1920

gatggtttac aaggctcagc aaataaatta aatggtg

 

<210> 3

<211> 1008

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

taaagataaa gaaaaggcta aagaatggga aagaaaagaa gcagaaagaa tagagcaaaa 60

acttgaaaga tctgaaaaag aagcattaga atcatataaa aaagattctg tagaaataag 120

ataatattct cagacaagaa attattttta tgattatcaa atagaagcaa attctcgaga 180

aaaagaatat aaagaacttc gaaatgctat atcaaaaaat aaaatagata aacctatgta 240

tgtctattat tttgaatctc cagaaaaatt tgcatttaat aaagtaataa gaacagaaaa 300

tcaaaacgaa atttcattag aaaaatttaa tgagtttaaa gaaactatac aaaacaaatt 360

atttaagcaa gatggattta aagatatttc tttatatgaa cctggaaaag gtgatgaaaa 420

acctacacca ttacttatgc acttaaaatt acctagaaat actggtatgt taccatatac 480

aaatactaac aatgtaagta cattaataga gcaaggatat agtataaaaa tagataaaat 540

tgttcgtata gttatagatg ggaagcacta tattaaagca gaagcatctg ttgtaagtag 600

tcttgatttt aaagatgatg taagtaaggg ggactcttgg ggtaaagcaa attataatga 660

ttggagtaat aaattaacac ctaatgaact tgctgatgta aatgattata tgcgtggagg 720

atatactgca attaataatt atttaatatc aaatggtcca gtaaataatc ctaacccaga 780

attagattct aaaatcacaa acattgaaaa tgcattaaaa cgtgaaccta ttccaactaa 840

tttaactgta tatagaagat ctggtcctca agaatttggt ttaactctta cttcccctga 900

atatgatttt aacaaactag aaaatataga tgcttttaaa tcaaaatggg aaggacaagc 960

actgtcttat ccaaacttta ttagtactag tattggtagt gtgaatat

 

<210> 4

<211> 1151

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

taatgggata ttatttcaca gatgagcact ttaaagattt aaaattaatg gcacccataa 60

aagatggtaa tttaaaattt gaagaaaaga aagtagataa acttctggat aaagacaaat 120

cagatgtaaa atctatacga tggacaggaa gaataattcc ttctaaggat ggtgaatata 180

cattatcaac tgatagagat gatgtcttaa tgcaagtaaa tactgagagt actatatcaa 240

atacacttaa agttaatatg aaaaagggta aagaatataa agttagaata gagctacaag 300

ataaaaattt aggttcaata gataatttat catcacctaa tctttattgg gaattagatg 360

gtatgaagaa aattatacca gaagaaaatt tattcttaag agattattct aatatagaaa 420

aagatgatcc atttatccca aataacaatt tctttgaccc aaagttgatg tctgattggg 480

aagacgaaga tttggataca gataatgata atataccaga ttcatatgaa cgaaatggat 540

atactattaa ggacttaatt gcagttaagt gggaagatag ttttgcagaa caaggctata 600

agaaatatgt atcaaattat ttagagtcaa atactgctgg agatccatat acagattatg 660

aaaaagcttc aggttctttt gacaaggcta taaagactga agcaagagat ccgttagttg 720

cagcatatcc aattgttgga gtaggtatgg aaaaattaat tatatctaca aatgaacatg 780

cctctactga tcaaggtaaa actgtttcc agagctacta ctaacagtaa aactgaatcta 840

atacagctgg tgtgtctgtt aatgtaggat atcaaaatgg attcacagct aatgtaacta 900

caaattattc ccatacaaca gataattcaa ctgctgttca agatagtaat ggagaatcat 960

ggaatactgg attaagtata aacaaaggag aatctgcata tataaatgca aatgttagat 1020

attacaacac aggtactgca cctatgtaca aagtgacacc aacaacaaat ttagtgttag 1080

atggagatac attatcaact atcaaagcac aagaaaatca aattggcaat aatctatctc 1140

ctggagatac t

 

Claims (10)

1.一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）引物的设计：分别对艰难梭菌cdtA和cdtB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的引物；

（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；所述的待测物为人及动物的粪便或培养分离的菌株；

（3）扩增反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应后反应液的颜色变化判断结果，反应液的颜色变绿色表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液的颜色变橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素。

2.根据权利要求1所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：经所述步骤（1）设计优化获得用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的专用引物如下：

（1）用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的cdtA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：

F3：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG

B3：AATAGCTGATAGATAAGCTCCA

FIP：GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTTTAACTCTTACTTCCCCTGA

BIP：ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT

LF：AAATCATATTCAGGGGAA  

LB：TTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTAC

所述cdtA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1；

（2）用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的cdtB引物为以下两组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；所述各引物序列如下：

F3：GAGTCAAATACTGCTGGAGA

B3：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT

FIP：CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT

BIP：AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGTTTCCTTGATCAGTAGAGGCATG

所述cdtB引物中两组引物对（FIP和BIP）:（F3和B3）的摩尔比为8: 1。

3.根据权利要求1或2所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤（1）获得的引物按步骤（2）进行LAMP扩增的反应条件为：检测cdtA时，扩增反应在57-64℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在57-68℃下恒温90min。

4.根据权利要求3所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应条件为：检测cdtA时，扩增反应在60℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在63℃下恒温90min；同时检测艰难梭菌cdtA和cdtB的扩增反应条件为：61℃恒温90min。

5.根据权利要求1所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰。

6.根据权利要求2所述的艰难梭菌二元毒素LAMP检测方法，其特征在于：以上所述专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系如下：待测物的基因组DNA 2μl、20 mM Tris·HCl （pH 8.8）、10 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO₄、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA引物或cdtB引物，加双蒸水至体系总体积为25μL；所述专用引物及其加入量为：检测cdtA时，加入cdtA引物为：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LB 和LF），5 pmol（F3 and B3）；检测cdtB时，加入cdtB引物为：40 pmol（FIP和BIP）、5 pmol（F3和B3）。

7.一种用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的用于对艰难梭菌二元毒素进行LAMP检测的cdtA引物或cdtB引物。

8.根据权利要求7所述的用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含二元毒素艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。

9.根据权利要求7所述的用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：20 mM Tris·HCl（pH 8.8）、10 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、0.1% Tween 20、0.8 M 甜菜碱、8 mM MgSO₄、1.4 mM dNTP each、8U Bst DNA 聚合酶、cdtA引物或cdtB引物、钙黄绿素指示剂、含二元毒素艰难梭菌的基因组DNA 和双蒸水；所述cdtA引物为以下引物组合：40 pmol（FIP和BIP）、20 pmol（LF和LB）、5 pmol（F3和B3）；所述cdtB引物为以下引物组合：40 pmol（FIP和BIP）、5 pmol（F3和B3）。

10.根据权利要求7~9中任一项所述的用于检测艰难梭菌二元毒素的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒可单独或同时定性检测艰难梭菌cdtA 或/和cdtB。