CN102424841A

CN102424841A - 旋毛虫的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒

Info

Publication number: CN102424841A
Application number: CN2011104324701A
Authority: CN
Inventors: 黄留玉; 袁静; 李雪莲; 刘威; 邹大阳; 王雪松; 王中全
Original assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Current assignee: Institute of Disease Control and Prevention of PLA
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CN102424841B

Abstract

本发明公开了一种旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到旋毛虫，不需要复杂仪器，为旋毛虫的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测旋毛虫，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域中寄生虫的分子生物学检测方法，特别是涉及一种旋毛虫的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

旋毛虫病是由旋毛形线虫[Trichinella spiralis(Owen，1835)Railliet，1895](简称旋毛虫)引起的食源性人兽共患寄生虫病，在全世界66个国家或地区均有分布。目前，国际公认的旋毛虫属分为8个种及3个基因型，即旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)、米氏旋毛虫(T5)、纳氏旋毛虫(T7)、巴布亚旋毛虫(T10)及津巴布韦旋毛虫(T11)及T6、T8、T9。我国已发现存在有2种，即旋毛虫(T1)和乡土旋毛虫(T2)。

目前，已知猪、野猪、狗、鼠等150多种动物可作为旋毛虫的宿主，由这些动物互相残食或摄取尸肉而传播。人患旋毛虫病主要因生食或半生食含有幼虫囊包的猪肉或其它动物肉类所致，急性期患者表现为发热、水肿、肌痛、腹泻等症状，感染后可终生带虫，表现为肌肉酸痛无力，重者可因严重的并发症死亡，死亡率为3％～30％。

国际旋毛虫病委员会调查结果显示，自1995年1月至1997年7月已报道的旋毛虫感染人数达10,030人，估计全球至少有6,000万人感染该病。我国1964年至2005年已报道的病例达26,000余人，隐性感染人数达4000万人，由此产生巨大的医疗费用，仅急性感染者的治疗费用就高达数百亿元人民币，而隐性感染所造成的体质下降等各种间接损失则更为巨大。鉴于其暴发频率、感染人数及危害性，在欧盟2006年公布15种重要新发与再发性人兽共患病病种中，旋毛虫病作为唯一的食源性寄生虫病名列其中。

旋毛虫不仅严重危害人类健康，也给养猪业和肉类工业造成巨大的经济损失。世界各国均把屠宰动物的旋毛虫检验作为首检和强制性必检项目，以此切断其由动物向人的传播，由于大量人力、物力及财力的耗费，致使旋毛虫病成为了目前世界范围内投入控制费用最高的寄生虫病。仅以2004年生猪屠宰的旋毛虫病检验费用为例，欧盟5.7亿欧元/屠宰量为2亿头，美国10亿美元/屠宰量为3亿头，我国高达18亿元人民币/屠宰量为6.18亿头(3元人民币/头)。国际旋毛虫病委员会预测在未找到更为有效的检验方法以前，以上各国所公布的检验费用均不可能降低。

目前，迫切需要对旋毛虫感染进行有效的诊断和控制，前者的有效性依赖于检测方法的可靠性，但至今仍未发现有效的检测方法。对于屠宰动物旋毛虫病的检验，国际兽疫局的法规检验方法为镜检法及集样消化法，目前我国也在延用这两种方法。然而，以上两种方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，集样消化法虽可提高检出率，但仍十分繁琐。两种方法的敏感性均可造成肉类的漏检而引起人的感染，存在安全隐患。对于人旋毛虫病的诊断只能凭借病原学检查或血清学检查同询问病史相结合的方法。病原学检查取病人的肌肉压片镜检，查到旋毛虫幼虫囊包即可确诊，但是该方法对发病早期和轻度感染者的阳性率不高，而且不易被患者接受。血清学检查依靠从病人血清中查到旋毛虫特异抗体而确诊，该类方法比较简单、快速，但由于旋毛虫抗体在宿主体内出现的时间较晚，故不能用于旋毛虫病的早期诊断，而且假阳性率较高。因此，寻找早期、简单、特异的旋毛虫检测方法是旋毛虫病研究领域的热点。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H，MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res2000；28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.J Virol Methods.2007；141(2)：173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H，Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with aloop-mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7-8)：778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。该技术还用于检测其它与人类相关的病毒，如巨细胞病毒、埃博拉病毒、慢性伯基特淋巴瘤病毒、虹彩病毒、人类疮疹病毒、造血组织坏死病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前，LAMP技术在寄生虫方面的研究也有开展，如检测宿主体内的间日及恶性疟原虫、日本血吸虫、非洲锥虫、巴贝斯虫、黏液孢子虫、隐孢子虫、弓形虫、猪带及牛带绦虫等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测旋毛虫的LAMP专用引物与试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测旋毛虫的LAMP检测专用引物。

本发明所提供的用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。

具体来讲，所述用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

所述引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。

本发明的第二个目的是提供一种旋毛虫的LAMP检测方法。

本发明所提供的旋毛虫的LAMP检测方法，可包括以下步骤：

1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在旋毛虫，橙色表示待测样品中不存在旋毛虫；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在旋毛虫，浊度无变化表示待测样品中不存在旋毛虫。

在上述旋毛虫的LAMP检测方法中，所述步骤1)中的待测物包括肌肉、血液、粪便等；所述25μl LAMP反应体系可包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol FIP和BIP所示引物，20pmol LF和LB所示引物，5pmol F3和B3所示引物。

所述步骤1)中的LAMP扩增条件可为：置60-65℃恒温45-55min，优选为50min。

所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量可为1μl(终反应体系为26μl)，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。

本发明的第三个目的是提供一种用于对旋毛虫进行LAMP检测的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为旋毛虫的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。

具体说来，所述试剂盒中包括：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，钙黄绿素指示剂，旋毛虫的基因组DNA(25μl LAMP反应体系中使用2μl)和双蒸水。

采取以上设计，本发明具有以下优点：

1)高特异性：6条引物对旋毛虫靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；

2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍；

3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；

4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；

5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL。

综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到旋毛虫，不需要复杂仪器，为旋毛虫的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测旋毛虫，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明旋毛虫的LAMP检测方法对旋毛虫特异性的浊度仪检测结果

图2为本发明旋毛虫的LAMP检测方法对旋毛虫特异性的钙黄绿素染色检测结果

图3为本发明旋毛虫LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果

图4为本发明旋毛虫LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果

图5为对旋毛虫的PCR检测结果

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物设计

从美国基因数据库检索获得旋毛虫1.6kb重复序列(GenBank：X06625.1)通过BLAST软件进行同源性分析得知是旋毛虫的1.6kb特异保守序列(序列表中序列1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体引物序列如表1。应用中，三组引物对可以任意比例混合使用，实施例2反应体系中给出了一种具体优化组配作为示例。

表1用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物

实施例2、本发明旋毛虫的LAMP检测方法的建立

用实施例1获得的用于对旋毛虫进行LAMP检测的六条引物对旋毛虫河南株(来自郑州大学医学院人体寄生虫教研室)进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：

一、最佳反应体系的确定

在相同反应条件(置63℃恒温50min)下，在反应体系中添加不同浓度的Mg²⁺，以确定最佳反应体系，包括以下步骤：

1)以旋毛虫基因组DNA(用TIANGEN公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：含旋毛虫的基因组DNA 2μl，20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，分别添加(4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM)MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase(购自NEB公司)，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；反应条件为置63℃恒温水浴锅中50min。

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1μl的(终反应体系为26μl)含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果(原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg²⁺的变化)。绿色表示待测样品中存在旋毛虫(阳性)，橙色表示待测样品中不存在旋毛虫(阴性)；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)。浊度上升表示待测样品中存在旋毛虫(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在旋毛虫(阴性)。

在上述引物组合的引导下，用含有不同浓度MgSO₄的反应体系检测待测样品中的旋毛虫，结果含有8mM MgSO₄的反应体系的检测效果最好，因此，将本发明最佳的旋毛虫的LAMP检测体系定为：本发明最佳的旋毛虫的LAMP检测体系定为(25μl)：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U BstDNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。

二、最佳反应条件的确定

在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对旋毛虫的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，包括以下步骤：

1)以旋毛虫的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：旋毛虫的基因组DNA 2μl，20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。LAMP的扩增条件为：置60-65℃恒温40-60min。

2)结果判定

反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的旋毛虫LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温40-60min。

实施例3、本发明旋毛虫的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测

一、本发明旋毛虫的LAMP检测方法的特异性检测

分别以旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、伪旋毛虫(T4)、纳氏旋毛虫(T7)、似蚓蛔线虫、蛲虫、鞭虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、布氏姜片虫、日本血吸虫、猪带绦虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫(所有虫株均来自郑州大学医学院人体寄生虫教研室)的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的旋毛虫的LAMP检测方法的特异性。

本发明旋毛虫的LAMP检测方法对旋毛虫特异性的浊度仪检测结果如图1所示，钙黄绿素染色检测结果如图2所示(1，阴性对照(双蒸水)；2，旋毛虫(T1)；3，乡土旋毛虫(T2)；4，伪旋毛虫(T4)；5，纳氏旋毛虫(T7)；6，似蚓蛔线虫；7，蛲虫；8，鞭虫；9，十二指肠钩口线虫；10，华支睾吸虫；11，布氏姜片虫；12，日本血吸虫；13，猪带绦虫；14，牛带绦虫；15，曼氏迭宫绦虫)。图1浊度曲线显示2-5号样品浊度上升，表明检测到旋毛虫；图2中可以看出只有旋毛虫种株的样品2、3、4、5显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到旋毛虫，其余均未检测到旋毛虫。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的旋毛虫的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到旋毛虫。

二、本发明旋毛虫的LAMP检测方法的灵敏度检测

本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测旋毛虫的灵敏度，方法为：提取旋毛虫总DNA，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍)进行稀释，使1-10模板中总DNA的浓度分别为3620ng/μl、362ng/μl、36.2ng/μl、3.62ng/μl、362pg/μl、36.2pg/μl、3.62pg/μl、0.362pg/μl、0.036pg/μl、0.0036pg/μl，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为F3和B3)进行灵敏度检测。

本发明旋毛虫LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图3所示(代号1-10模板对应浓度分别为：3620ng/μl、362ng/μl、36.2ng/μl、3.62ng/μl、362pg/μl、36.2pg/μl、3.62pg/μl、0.362pg/μl、0.036pg/μl、0.0036pg/μl)，代号1-8号样品浊度上升表示检测到旋毛虫，表明本发明引物组合对旋毛虫的最低检测灵敏度为0.362pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图4所示(3620ng/μl、362ng/μl、36.2ng/μl、3.62ng/μl、362pg/μl、36.2pg/μl、3.62pg/μl、0.362pg/μl、0.036pg/μl、0.0036pg/μl)，其中1-8号试管显示出绿色，检测到旋毛虫，表明本发明引物组合对旋毛虫的最低检测灵敏度为0.362pg/μl；PCR检测结果如图5所示(3620ng/μl、362ng/μl、36.2ng/μl、3.62ng/μl、362pg/μl、36.2pg/μl、3.62pg/μl、0.362pg/μl、0.036pg/μl、0.0036pg/μl，M，DNA marker D2000)，其中1-6号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为36.2pg/μl。比较可知。本发明旋毛虫的LAMP检测方法可检测到0.362pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到36.2pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明旋毛虫的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。

实施例4、用于旋毛虫的LAMP检测的试剂盒

将20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，钙黄绿素指示剂(用染色法检测时使用)以及作为阳性对照的旋毛虫的基因组DNA 2μl，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系(双蒸水)共同包装，再配以产品使用说明书(记载染色法和浊度法两种检测方法)，得到用于旋毛虫的LAMP检测的试剂盒。

Claims

1.用于对旋毛虫进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的旋毛虫的特异性保守基因sb4重复序列设计的，用以定性检测待测样品中的旋毛虫。

2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。

3.根据权利要求2所述的专用引物，其特征在于：所述引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。

4.一种旋毛虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)以待测物的基因组DNA为模板，在权利要求1或2或3所述引物的引导下进行LAMP扩增；待测物为肌肉、血液或粪便等；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的；所述25μl LAMP反应体系包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol FIP和BIP所示引物，20pmolLF和LB所示引物，5pmol F3和B3所示引物。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温45-55min，优选为50min。

7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。

8.一种用于对旋毛虫进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2或3所述用于对旋毛虫进行LAMP检测的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为旋毛虫的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3，钙黄绿素指示剂，旋毛虫的基因组DNA和双蒸水。