CN104328211A - PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 - Google Patents
PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒；解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，根据PML-RARα基因序列，利用PrimerExplorer V4软件设计多组引物，筛选到一对特异性内引物F3、B3和一对特异性外引物FIP、BIP，并且建立了急性早幼粒白血病微小残留病PML-RARα基因检测的试剂盒。本试剂盒扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床上容易做到，检测时间不超过1个小时，比常规PCR节约一半以上时间。
Description
技术领域
本发明涉及基因的快速检测方法，尤其涉及一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(APL)是临床上最凶险的一类非淋巴细胞白血病，由于诱导分化剂全反式维甲酸和三氧化二砷的应用，APL完全缓解率已达到80％以上。但白血病复发一直是困扰临床进行缓解后巩固、维持治疗及影响患者总生存期的主要障碍，而复发的根源主要是来自体内残留白血病细胞，即急性白血病微小残留病(MRD)。缓解后的白血病患者需要定期检测微小残留细胞以预防复发，简便而准确的快速检测将会极大方便患者复查，提高复查率，及时就医，提高存活率。染色体t(15；17)(q22；q21)易位，形成PML-RARα融合基因是APL的特异性标志，阳性率约占98％。检测PML-RARα融合基因表达，可以了解白血病细胞在治疗中的消减情况，对监测MRD具有重要意义。
目前检查PML-RARα基因主要通过PCR或实时荧光定量PCR。PCR耗时长、灵敏度和特异性低、仪器要求高。实时荧光定量PCR方法虽然特异性和灵敏度有所提高，但是需要产生荧光的引物和探针，还需要昂贵的检测设备，而且需要2-3个小时。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点，可以不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，该方法推广期主要面对微生物检测，现在已经广泛应用于微生物检测领域，并有很多相关专利获得授权，但因研究人员了解不足，而且人体基因比微生物更复杂，目前国内外均未见使用LAMP方法检测白血病PML-RARα基因的报道。
针对同一段基因序列设计的LAMP引物存在扩增效率和特异性等多方面差异，LAMP引物可以通过软件自动生成，但是否能从众多引物组中筛选到快速、特异的引物是LAMP法检测基因的关键。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物，由内引物F3:其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；内引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；外引物FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；外引物BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述引物在检测急性白血病微小残留病中的应用。
一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μL pH 8.8的Tris-HCl，0.02μmol/μL KCl，0.016μmol/μL MgSO4，0.02μmol/μL(HN4)2SO4，0.002μl/μL Tween20，6μmol/μL甜菜碱，0.0028μmol/μL×4种dNTPs，10U/μL逆转录酶，8U/μL Bst DNA聚合酶，0.00005μmol/μL钙黄绿素，0.2pmol/μL F3，0.2pmol/μL B3，1.6pmol/μL FIP，1.6pmol/μL BIP；
所述阳性对照为：反应时在反应液中加入PML-RARαRNA表达阳性的NB4细胞的基因组RNA；
阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。
PML-RARα融合基因mRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
上述试剂盒中LAMP反应液为1ml、阳性对照50μL、阴性对照1ml。
上述试剂盒还包括：反应管50个，10μL移液器头100个。
上述试剂盒的使用方法：取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min；用户在初次使用时需要设置阴性对照和阳性对照。
本发明的有益效果：
为了解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，本发明筛选到用LAMP法检测PML-RARα基因的引物，建立了急性早幼粒白血病微小残留病PML-RARα基因检测的基因及试剂盒。反应液中预先加有逆转录酶，逆转录和基因扩增一步完成，而不需要预先将RNA逆转录成cDNA再进行DNA扩增，简化了操作步骤。
本试剂盒扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床上容易做到，检测时间不超过1个小时，比常规PCR节约一半以上时间，而且PCR结束之后需要通过电泳判断结果，电泳所用DNA染料EB有剧毒。相比之下，采用本试剂盒，实现了基因扩增和结果判定一步完成，操作简单、结果准确直观、特异性与敏感性高、对人体安全、不污染环境，适合于各级医院快速诊断M2型急性白血病微小残留病，排除了基层医院难以开展此类检查的障碍，患者可以就近检查，而不用再长途奔波到条件好的大医院，方便了患者，节省了费用，为救治生命节约了宝贵时间。
附图说明
图1为裸眼目视观察反应结果，其中，1号管为检测管，2号管为阳性对照，3号管为阴性对照；
图2为灵敏度检测，其中，1-6号管中加入的为倍比稀释的RNA，浓度依次为2000、200、20、2、0.2、0.02ng/μl，1-4号为阳性，5-6号为阴性；
图3为目视检测试剂盒特异性结果，1-5号管为白血病患者样本，6号管为NB4细胞，7-11号管为正常人样本；1-6号为阳性，7-11为阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1.材料与方法
1.1样本：用培养的NB4细胞的基因组总RNA作为标准品用于本方法的建立，临床样本采用抗凝外周血或骨髓0.2-1.0ml。
1.2基因组总RNA提取：利用商品化的RNA提取试剂盒(购自北京天恩泽生物技术有限公司，型号为3701-50)抽提总RNA，室温操作。
抽提总RNA具体操作步骤：
(1)将0.2-1.5mL抗凝全血13000g离心3分钟，弃上清；
(2)将1mL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解；
(3)将0.3mL的溶液B和0.2mL氯仿加入离心管，剧烈震荡30秒,13000g离心5分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
(4)加入0.5mL的溶液C和0.2mL的氯仿到上清液中，剧烈摇晃30秒，13000g室温离心3分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
(5)在上清液中加入体积为其1/2的溶液D，剧烈摇晃30秒，13000g离心5分钟，移弃上清液；
(6)在离心管中加入1mL体积分数为75％的乙醇，振荡器上振荡混均30秒，离心13000g 1分钟，吸弃上清液；
(7)室温放置2分钟，加入10-30μL无RNase水使RNA沉淀溶解，即为总RNA。
1.3引物设计及筛选
根据PML-RARα基因序列，利用Primer Explorer V4软件(https://primerexplorer.jp)设计多组引物，每引物组包括一对特异性内引物F3、B3和一对特异性外引物FIP、BIP，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。筛选到的引物序列见表1。
表1筛选到的PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的最佳引物名称与序列
1.4LAMP反应体系
LAMP反应总体系为25μL，反应时加入20μL反应液，再加入5μL待检测RNA。同时设阳性对照和阴性对照。
阳性对照为：反应时在反应液中加入PML-RARαRNA 5μL；
阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水5μL。
20μL反应液成分及含量见表2。
表2反应缓冲液成分及含量
1.5试剂盒设置
试剂盒内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照3管试剂，以50次反应计，试剂盒组装如表3所示。
表3 PML-RARΑ融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒设置
1.6反应条件
取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min。初次使用本试剂盒建议设置阴性对照和阳性对照，但不是必要步骤。
2.结果判定
在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子，焦磷酸根离子浓度与DNA的生成量成正比。反应初期，钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。而且这种荧光在自然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，待检测样本DNA被扩增后反应液变为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生。
所以，反应液变为绿色的为阳性结果；反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果，如图1所示，1号管为检测管，2号管为阳性对照，反应结束后1、2号管中的液体变为绿色，为阳性，3号管中的液体仍保持淡橙色，为阴性。若反应时间延长至30min以上，可能会出现假阳性，结果判定以30分钟以内时为准。
3.敏感性检测
用微量分光光度计(购自美国Nanodrop公司，型号为ND-1000)检测样本RNA的浓度，并将RNA的浓度调整为2000ng/μl，用无RNA酶的双蒸水对待检测RNA进行10倍梯度稀释，得到所需要的不同浓度，即200、20、2、0.2、0.02ng/μl。按照1.6条件进行LAMP反应，检测出现阳性反应的最低模板浓度。如图2所示，1-4号管浓度为2000、200、20、2ng/μl，反应结束后变为绿色，为阳性。5、6号管浓度为0.2、0.02ng/μl，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。表明本试剂盒最低可检测到2ng/μl的基因组RNA。
4.特异性检测
选择正常人血液5例、急性白血病患者血液5例，PML-RARα表达阳性的白血病细胞株1例(NB4细胞)，提取RNA，按照1.6条件进行LAMP扩增。25分钟时，阳性结果5例，均为白血病患者的RNA，时间延长至40分钟，其他RNA仍为阴性，正确率100％，表明本试剂盒具有很高的特异性。如图3所示，1-5号管为PML-RARα表达阳性的白血病患者样本，6号管为PML-RARα表达阳性的NB4细胞，反应结束后1-6号管均变为绿色，为阳性。7-11号管为正常人样本，不表达PML-RARα，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。
5.利用本发明通过检测PML-RARα基因表达来检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病与现有常规检测方法的优劣对比，见表4。
表4本试剂盒检测与现有常规检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的方法对比
由表4可以看出，本发明的方法相对于现有常规检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的方法，不需要专用的仪器，操作过程简单，并且对操作者的要求较低，操作的时间少于1h，检测的灵敏度和特异性较高。
Claims (6)
1.一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物，其特征在于，由内引物F3:其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；内引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；外引物FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；外引物BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒，其特征在于，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μL pH 8.8的Tris-HCl，0.01μmol/μL KCl，0.016μmol/μL MgSO4，0.01μmol/μL(HN4)2SO4，0.04μl/20μLTween20，1.6μmol/μL甜菜碱，0.056μmol/μLх4种dNTPs，200U/μL逆转录酶，160U/μL BstDNA聚合酶，50pmol/μL钙黄绿素，1.6pmol/μL引物F3，1.6pmol/μL引物B3，0.2pmol/μL引物FIP，0.2pmol/μL引物BIP；
所述阳性对照为：反应时在反应液中加入PML-RARα表达阳性的NB4细胞基因组总RNA；阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，LAMP反应液为1ml、阳性对照50μL、阴性对照1ml。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包括：反应管50个，10μL移液器头100个。
5.如权利要求3-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min。
6.如权利要求5所述的使用方法，其特征在于，初次使用本试剂盒时设置阴性对照和阳性对照。
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