CN102851386B

CN102851386B - 环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法

Info

Publication number: CN102851386B
Application number: CN201210367744.8A
Authority: CN
Inventors: 王静; 杨宇; 杨永莉; 刘丽娟; 赵婷婷; 王旺; 王莎莎
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: CN102851386A

Abstract

本发明公开了一种环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，LAMP方法操作简单，反应快速，在恒温条件下进行1小时完成，耗时短实现反应及产物检测一步完成，操作简便，检测成本低。本发明为贝氏柯克斯体的检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，对于提高卫生水平、保证人类生命安全和推动卫生检验事业的发展具有重要的意义。

Description

环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种改进的环介导等温扩增新方法及其在检测贝氏柯克斯体中的应用。

背景技术

贝氏柯克斯体又称伯纳特柯克斯体(Coxiella burnetti)，俗称Q热立克次体，是引起Q热的病原体，属于立克次体科、立克次体族、柯克斯体属，为革兰阴性小杆菌或球杆菌，能通过细菌滤器。电镜观察，伯纳特柯克斯体整个细胞可分为三部分：由微荚膜、细胞壁和胞质膜构成的外表层；胞质膜内的含核糖体颗粒的致密外周层；由染色体细丝缠绕而成的中央致密体。系统发育研究表明，贝氏柯克斯体与其他立克次体亲缘关系相距甚远，它属变形菌纲的γ亚群，与肺炎军团菌关系密切。

贝氏柯克斯体的实验室检测常用血清学诊断和病原体分离，但耗时长、检出率不高。因此，国内外都相继将聚合酶链反应(PCR)技术用于其实验室检测的研究，其方式各有差异。

发明内容

针对现有技术存在必须经电泳凝胶成像才可以观察结果,或浊度仪显示的结果信噪比低的问题，本发明的目的在于提供一种具有操作简单、反应快速、耗时短等优点的环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，包括：

根据贝氏柯克斯体com1基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，引物设计和合成过程中包括两个外引物和两个内引物的设计和合成，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2;内引物BIP(下端内引物)包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2序列，即5’-Blc-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合靶序列上的6个特异区域。

第一组靶基因序列及设计引物位置：

5′-TCCACCATTATTTAGTCAACCACCCAGAAGTTTTAGTAGAAGTATCCCAA

GCTCAACAAGCAATTAAAGAAAATGCAAA

GGCAATGTTACATTGGTTGAATTTT

TTGCAAA

TATCGTGAAACAAAATAAAAACCTCCGCGTTGTCTTCAAAGAACTGCCCATTTTTGGCGGCCAA-3’。

第二组靶基因序列及设计引物位置：

5’-AATACGCTGCCAAA

TCCACGACGCGCTGCTCAGT

ACAAATCACCC

TAAATGTTGCTCAGCTCAAAAAAGACATGGATAATCCTGCT

ATAACT

ACAGCTAGCAGGCACCCCGACGTTCGTCATTGGTAATAAAGCGTTA-3’。

设计外引物和内引物为下面序列或其全部对应的互补序列：

第一组：

第二组：

进一步，所述外引物、内引物优选第一组。

进一步，所述外引物：内引物＝比例范围为1：4~1：12。

进一步，所述外引物：内引物＝1：8。

进一步，所述环介导等温扩增温度为58℃~66℃。

进一步，所述环介导等温扩增温度为63℃。

进一步，所述环介导等温扩增时间为15分钟~60分钟。

进一步，所述环介导等温扩增时间为40~60分钟。

进一步，所述非诊断性方法包括步骤：

①提取基因组DNA：取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清，用dH₂O重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH₂O重悬，沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，-20℃冰箱放置备用或采用基因组DNA提取试剂盒进行提取；

②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、样品基因组NDA、酶、缓冲液配制25μL反应体系；

③环介导等温扩增。

进一步，所述25μL反应体系组分如下：

进一步，所述等温扩增可采用恒温水浴、PCR、Real-time PCR、LC320浊度仪、GenieII。

另外外引物可以作为单独PCR扩增反应引物来检测贝氏柯克斯体。

本发明的有益效果在于：环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermalamlication of DNA，简称LAMP）方法操作简单，反应快速，在恒温条件下进行1小时完成，耗时短；同时，可使用恒温水浴装置或普通PCR完成反应，但需要凝胶成像系统进行结果检测，若使用Real-time PCR、LC320浊度仪、GenieII，可实现反应及产物检测一步完成，操作简便，检测成本低，为贝氏柯克斯体的检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，对于提高卫生水平、保证人类生命安全和推动卫生检验事业的发展具有重要的意义。

附图说明

图1为内外引物浓度比不同的LAMP检测图；

图2为LAMP检测浊度反应速率图，图中CH1为空白，内外引物浓度比分别CH2：1：2，CH3：1：4，CH4：1：8，CH5：1：12；

图3a为58℃下LAMP扩增检测贝氏柯克斯体的实验结果图；

图3b为60℃下LAMP扩增检测贝氏柯克斯体的实验结果图；

图3c为63℃下LAMP扩增检测贝氏柯克斯体的实验结果图；

图3d为65℃下LAMP扩增检测贝氏柯克斯体的实验结果图；

图4为特异性实验结果（LAMP法）图，图中1空白、2基孔肯雅病毒、3登革热病毒、4汉坦病毒、5西尼罗病毒、6版纳病毒、7西伯利亚立克次体、8贝氏柯克斯体；

图5a和5b为LAMP检测贝氏柯克斯体灵敏度图；

图6a和6b为LAMP检测贝氏柯克斯体加有荧光染料灵敏度图。

图7为GenieII仪器扩增检测贝氏柯克斯体灵敏度图；

图8为荧光定量PCR仪扩增检测贝氏柯克斯体灵敏度图。

注：图1、图4、图5a、图6a中黑色区域表示为本底值，白色区域表示为扩增产物的量，条纹区域表示为检测阳性结果。

具体实施方式

LAMP的引物设计是一项复杂的程序，但是引物设计恰恰是LAMP法实现扩增的关键所在。LAMP最少需要4条引物，分别是正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3。正向内引物FIP包含F1C区段(同靶基因的F1C区段完全相同)、TTTT连接子和F2区段(同靶基因的F2C区段完全互补)；正向外引物F3同靶基因的F3C区段完全互补；反向内引物BIP包含B1C区段(同靶基因的B1C区段完全相同)，TTTT连接子和B2区段(同靶基因的B2C区段的完全互补)；反向外引物B3同靶基因的B3C区段完全互补。LAMP的引物设计规则与PCR相似，但是比传统的PCR复杂，其引物设计主要遵循以下原则：

1）引物间的距离F2与B2之间的碱基数约为120～180个；F2与F3或者B2与B3间的碱基数为20个以内；F2与F1或者B2与B1之间碱基数为40～60个；

2）引物的Tm值一般情况下Tm值为55～65℃；

3）GC含量与二级结构GC含量约50%～60%，尽量避免二级结构的产生,尤其是3′端，此外，还要注意3′端不可出现富AT结构；

4）引物末端的稳定性F1C与B1C的5′端，F2/B2、F3/B3的3′端6个碱基的dG值要小于-4kalmol^-1。

贝氏柯克斯体的基因序列为申请人使用试剂盒操作提取，或由GenBank上公布的序列合成。将得到的贝氏柯克斯体基因序列比对后，选取保守区域，用PrimerExplorer V4设计外引物F3、B3和内引物FIP、BIP。

具体实验操作步骤如下：

（1）样品DNA的提取

①取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清；

②用dH₂O重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH₂O重悬；

③沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，-20℃冰箱放置备用或采用基因组DNA提取试剂盒进行提取。

（2）环介导等温扩增（LAMP）

在试剂管内加入下列试剂：

（3）LAMP扩增程序：

扩增温度为63℃，扩增时间为60分钟，可用普通PCR仪进行扩增、恒温水浴锅，或在荧光定量PCR仪、浊度仪、GenieII（注需要加入荧光染料）中进行扩增。

（4）结果检测

普通PCR仪、或恒温水浴锅扩增的产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙啶染色，电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是梯状分布的条带；荧光定量PCR仪、浊度仪、GenieII扩增结果可以从仪器检测得到的荧光值判断结果。

（5）内外引物对的比例反应条件的优化实验

LAMP的大多数产物由FIP和BIP扩增，内引物在引导DNA的反应过程中起着重要作用，而外引物主要在环状结构DNA的形成起作用，内引物对反应的影响更大，固定外引物的量(0.2μM)，选择外引物：内引物在1：2~1：12的范围内进行条件优化。

据DNA Amplification Kit选择不同浓度比例的内外引物(1：2，1：4，1：8，1：12)、不同反应时间(15~60min)和温度(58℃，60℃，63℃，65℃)进行LAMP反应，从等温扩增仪扩增的结果中看出：内外引物浓度比为1：4，1：8，1：12时均可扩增出产物，但从扩增速率图1和图2综合考虑选择浓度比为1：8为最佳内外引物浓度反应条件。

LAMP扩增温度的选择，从图3a~3d中可以看出58℃，60℃，63℃，65℃这四个温度均可以扩增产物，但从扩展速率可看出，63℃时最先有产物扩增出来，所以选择63℃最为最佳反应温度。

（6）特异性实验

根据本发明建立的LAMP方法，对普氏立克次体、莫氏立克次体、汉坦病毒、大肠杆菌、单增李斯特菌、西伯利亚立克次体的DNA进行检测，六种病毒扩增均为阴性见图4；此外还对大肠埃希菌、副溶血性弧菌、假结核杆菌，牛型布鲁菌S19株、大肠杆菌O157:H7、土拉热弗朗西丝菌、中间耶尔森菌、伯氏耶尔森菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、小肠结肠炎耶尔森菌的模板DNA进行检测，扩增结果均为阴性，说明所建立方法的引物特异性强，没有非特异性扩增。

（7）灵敏度实验

将合成的质粒10倍倍比稀释，取各稀释浓度的质粒作为模板进行LAMP扩增，测试检测灵敏度，并将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时，将在同样的模板浓度下加入荧光染料（钙黄绿素）与不加入染料做对比，结果见图5、图6。浊度仪扩增得出的结论比电泳图跑出的结果灵敏度小一个梯度，如果单从浊度仪仪器得到的结果看得出的结论容易得到假阴性的结果，我们不应单从依赖浊度仪判断结果，还应从琼脂糖凝胶电泳图来判断结果，从电泳图中可看出不加入荧光染料钙黄绿素的检测灵敏度到达0.781fg/μL加有荧光染料钙黄绿素的检测灵敏度为7.81fg/μL，肉眼观察的结果可达到78.1fg/μL。

（8）GenieII仪器检测

使用GenieII仪器进行检测时，不需要进行电泳凝胶成像显示结果，通过GenieII仪器可直接实时检测合成产物的荧光信号，判断结果，在反应体系中需要添加SYBR Green I，通过对合成的质粒10倍倍比稀释，取各稀释浓度的质粒作为模板进行LAMP扩增，测试其检测灵敏度检测，结果见图7，从图中我们可以看出检测灵敏度达到0.781fg/μL，电泳结果与仪器检测显示的结果一致，也说明所建立的方法灵敏度高可达到fg级别。

（9）荧光定量PCR以检测

使用荧光定量PCR进行检测时，可在反应体系中添加钙黄绿素，选用的FAM作为检测通道，或在反应体系中添加SYBR Green I，选用的通道为SYBR，通过对合成的质粒10倍倍比稀释，取各稀释浓度的质粒作为模板进行LAMP扩增，测试其检测灵敏度检测，结果见图8，从图中我们可以看出检测灵敏度达到0.781fg/μL，电泳结果与仪器检测显示的结果一致。

实施例

血液样本检测的比较

（1）取30份血样品，利用基因组DNA提取试剂盒提取DNA；

（2）取一部分提取的DNA溶液进行普通PCR扩增；

（3）将剩余的DNA溶液进行贝氏柯克斯体LAMP扩增，利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、提取的基因组DNA、酶、缓冲液配制25μL反应体系；

（4）环介导等温扩增程序；

（5）电泳检测分析结果，比较普通贝氏柯克斯体PCR扩增和贝氏柯克斯体LAMP扩增。

结果得到有2份样品为阳性，这与普通PCR得到的结果是一致的，说明所建立方法与普通PCR方法没有差异。

鼠肾组织和蜱样品的检测

（1）取9份鼠肾组织样品和10份蜱样本，分别打碎处理为细胞悬液，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA；

（2）取一部分提取的DNA溶液进行普通PCR扩增；

（3）将剩余DNA溶液进行贝氏柯克斯体LAMP扩增，利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、提取的基因组DNA、酶、缓冲液配制25μL反应体系；

（4）环介导等温扩增程序；

检查结果显示19份不同样品为阴性，这与普通PCR得到的结果是一致的，说明所建立方法与普通PCR方法没有差异。

其他试剂对引物对的检测

用OptiGene公司的Rapid I Sthermal Mastermix试剂和合成的引物在Genie II仪器上做等温扩增，此仪器是检测荧光信号来判断结果的，不同的模板浓度进行的扩增可出现结果，并且电泳的结果与仪器显示结果一致。

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法

<130> 发明

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> com1-F3

<400> 1

GCATTGCAAAAAAAGACAGAA 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> com1-B3

<400> 2

GCTTGAATAACAGAATTCATGG 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> com1-FIP

<400> 3

GTGATGCAGGGTCGTTAAATAATTTGCGCAACAAGAAGAACAC 43

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> com1-BIP

<400> 4

CAGTGGCAGGCAATCCTCATTGGCCACATTGATAATCGA 39

Claims

1.环介导等温扩增技术检测贝氏柯克斯体的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

以贝氏柯克斯体com1基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，设计外引物F3、B3和内引物FIP、BIP为下面序列：

F3 5′-GCATTGCAAAAAAAGACAGAA-3′

B3 5′-GCTTGAATAACAGAATTCATGG-3′

FIP 5′-GTGATGCAGGGTCGTTAAATAATTTGCGCAACAAGAAGAACAC-3′

BIP 5′-CAGTGGCAGGCAATCCTCATTGGCCACATTGATAATCGA-3′

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物：内引物比例范围为1：4～1：12。

3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物：内引物比例范围为1：8。

4.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为58℃～65℃。

5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为63℃。

6.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为15分钟～60分钟。

7.如权利要求6所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为60分钟。

8.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述非诊断性方法包括步骤：

①提取样品基因组DNA:取培养后菌液于EP管，离心，收集后，弃上清,用dH₂O重悬洗涤细菌，离心，弃上清，重复一次，最后用dH₂O重悬沸水浴处理裂解细菌，离心，使细菌蛋白质等杂质沉淀于底部，取上清于EP管，即成上清DNA溶液，-20℃冰箱放置备用或使用基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取；

②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、提取的基因组DNA、酶、缓冲液配制25μL反应体系；

③环介导等温扩增。

9.如权利要求8所述的非诊断性方法，其特征在于，所述25μL反应体系组分如下：