CN104328211B - PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 - Google Patents
PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104328211B CN104328211B CN201410682429.3A CN201410682429A CN104328211B CN 104328211 B CN104328211 B CN 104328211B CN 201410682429 A CN201410682429 A CN 201410682429A CN 104328211 B CN104328211 B CN 104328211B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- pml
- test kit
- seqidno
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 101001095089 Homo sapiens PML-RARA-regulated adapter molecule 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102100037019 PML-RARA-regulated adapter molecule 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 12
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 7
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HJTAZXHBEBIQQX-UHFFFAOYSA-N 1,5-bis(chloromethyl)naphthalene Chemical compound C1=CC=C2C(CCl)=CC=CC2=C1CCl HJTAZXHBEBIQQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062489 Leukaemia recurrent Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N arsenic trioxide Inorganic materials O1[As]2O[As]1O2 GOLCXWYRSKYTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 101150022630 prp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒；解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，根据PML-RARα基因序列，利用PrimerExplorer V4软件设计多组引物，筛选到一对特异性内引物F3、B3和一对特异性外引物FIP、BIP，并且建立了急性早幼粒白血病微小残留病PML-RARα基因检测的试剂盒。本试剂盒扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床上容易做到，检测时间不超过1个小时，比常规PCR节约一半以上时间。
Description
技术领域
本发明涉及基因的快速检测方法，尤其涉及一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(APL)是临床上最凶险的一类非淋巴细胞白血病，由于诱导分化剂全反式维甲酸和三氧化二砷的应用，APL完全缓解率已达到80％以上。但白血病复发一直是困扰临床进行缓解后巩固、维持治疗及影响患者总生存期的主要障碍，而复发的根源主要是来自体内残留白血病细胞，即急性白血病微小残留病(MRD)。缓解后的白血病患者需要定期检测微小残留细胞以预防复发，简便而准确的快速检测将会极大方便患者复查，提高复查率，及时就医，提高存活率。染色体t(15；17)(q22；q21)易位，形成PML-RARα融合基因是APL的特异性标志，阳性率约占98％。检测PML-RARα融合基因表达，可以了解白血病细胞在治疗中的消减情况，对监测MRD具有重要意义。
目前检查PML-RARα基因主要通过PCR或实时荧光定量PCR。PCR耗时长、灵敏度和特异性低、仪器要求高。实时荧光定量PCR方法虽然特异性和灵敏度有所提高，但是需要产生荧光的引物和探针，还需要昂贵的检测设备，而且需要2-3个小时。
环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点，可以不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，该方法推广期主要面对微生物检测，现在已经广泛应用于微生物检测领域，并有很多相关专利获得授权，但因研究人员了解不足，而且人体基因比微生物更复杂，目前国内外均未见使用LAMP方法检测白血病PML-RARα基因的报道。
针对同一段基因序列设计的LAMP引物存在扩增效率和特异性等多方面差异，LAMP引物可以通过软件自动生成，但是否能从众多引物组中筛选到快速、特异的引物是LAMP法检测基因的关键。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物，由内引物F3:其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；内引物B3:其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；外引物FIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；外引物BIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
上述引物在检测急性白血病微小残留病中的应用。
一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μLpH8.8的Tris-HCl，0.02μmol/μLKCl，0.016μmol/μLMgSO4，0.02μmol/μL(HN4)2SO4，0.002μl/μLTween20，6μmol/μL甜菜碱，0.0028μmol/μL×4种dNTPs，10U/μL逆转录酶，8U/μLBstDNA聚合酶，0.00005μmol/μL钙黄绿素，0.2pmol/μLF3，0.2pmol/μLB3，1.6pmol/μLFIP，1.6pmol/μLBIP；
所述阳性对照为：反应时在反应液中加入PML-RARαRNA表达阳性的NB4细胞的基因组RNA；
阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。
PML-RARα融合基因mRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。
上述试剂盒中LAMP反应液为1ml、阳性对照50μL、阴性对照1ml。
上述试剂盒还包括：反应管50个，10μL移液器头100个。
上述试剂盒的使用方法：取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min；用户在初次使用时需要设置阴性对照和阳性对照。
本发明的有益效果：
为了解决以往白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，本发明筛选到用LAMP法检测PML-RARα基因的引物，建立了急性早幼粒白血病微小残留病PML-RARα基因检测的基因及试剂盒。反应液中预先加有逆转录酶，逆转录和基因扩增一步完成，而不需要预先将RNA逆转录成cDNA再进行DNA扩增，简化了操作步骤。
本试剂盒扩增效率高、特异性好、对仪器设备要求低，只需要恒温水浴锅即可，临床上容易做到，检测时间不超过1个小时，比常规PCR节约一半以上时间，而且PCR结束之后需要通过电泳判断结果，电泳所用DNA染料EB有剧毒。相比之下，采用本试剂盒，实现了基因扩增和结果判定一步完成，操作简单、结果准确直观、特异性与敏感性高、对人体安全、不污染环境，适合于各级医院快速诊断M2型急性白血病微小残留病，排除了基层医院难以开展此类检查的障碍，患者可以就近检查，而不用再长途奔波到条件好的大医院，方便了患者，节省了费用，为救治生命节约了宝贵时间。
附图说明
图1为裸眼目视观察反应结果，其中，1号管为检测管，2号管为阳性对照，3号管为阴性对照；
图2为灵敏度检测，其中，1-6号管中加入的为倍比稀释的RNA，浓度依次为2000、200、20、2、0.2、0.02ng/μl，1-4号为阳性，5-6号为阴性；
图3为目视检测试剂盒特异性结果，1-5号管为白血病患者样本，6号管为NB4细胞，7-11号管为正常人样本；1-6号为阳性，7-11为阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1.材料与方法
1.1样本：用培养的NB4细胞的基因组总RNA作为标准品用于本方法的建立，临床样本采用抗凝外周血或骨髓0.2-1.0ml。
1.2基因组总RNA提取：利用商品化的RNA提取试剂盒(购自北京天恩泽生物技术有限公司，型号为3701-50)抽提总RNA，室温操作。
抽提总RNA具体操作步骤：
(1)将0.2-1.5mL抗凝全血13000g离心3分钟，弃上清；
(2)将1mL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解；
(3)将0.3mL的溶液B和0.2mL氯仿加入离心管，剧烈震荡30秒,13000g离心5分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
(4)加入0.5mL的溶液C和0.2mL的氯仿到上清液中，剧烈摇晃30秒，13000g室温离心3分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；
(5)在上清液中加入体积为其1/2的溶液D，剧烈摇晃30秒，13000g离心5分钟，移弃上清液；
(6)在离心管中加入1mL体积分数为75％的乙醇，振荡器上振荡混均30秒，离心13000g1分钟，吸弃上清液；
(7)室温放置2分钟，加入10-30μL无RNase水使RNA沉淀溶解，即为总RNA。
1.3引物设计及筛选
根据PML-RARα基因序列，利用PrimerExplorerV4软件(https://primerexplorer.jp)设计多组引物，每引物组包括一对特异性内引物F3、B3和一对特异性外引物FIP、BIP，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。筛选到的引物序列见表1。
表1筛选到的PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的最佳引物名称与序列
1.4LAMP反应体系
LAMP反应总体系为25μL，反应时加入20μL反应液，再加入5μL待检测RNA。同时设阳性对照和阴性对照。
阳性对照为：反应时在反应液中加入PML-RARαRNA5μL；
阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水5μL。
20μL反应液成分及含量见表2。
表2反应缓冲液成分及含量
1.5试剂盒设置
试剂盒内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照3管试剂，以50次反应计，试剂盒组装如表3所示。
表3PML-RARΑ融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒设置
1.6反应条件
取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min。初次使用本试剂盒建议设置阴性对照和阳性对照，但不是必要步骤。
2.结果判定
在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子，焦磷酸根离子浓度与DNA的生成量成正比。反应初期，钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。而且这种荧光在自然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，待检测样本DNA被扩增后反应液变为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生。
所以，反应液变为绿色的为阳性结果；反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果，如图1所示，1号管为检测管，2号管为阳性对照，反应结束后1、2号管中的液体变为绿色，为阳性，3号管中的液体仍保持淡橙色，为阴性。若反应时间延长至30min以上，可能会出现假阳性，结果判定以30分钟以内时为准。
3.敏感性检测
用微量分光光度计(购自美国Nanodrop公司，型号为ND-1000)检测样本RNA的浓度，并将RNA的浓度调整为2000ng/μl，用无RNA酶的双蒸水对待检测RNA进行10倍梯度稀释，得到所需要的不同浓度，即200、20、2、0.2、0.02ng/μl。按照1.6条件进行LAMP反应，检测出现阳性反应的最低模板浓度。如图2所示，1-4号管浓度为2000、200、20、2ng/μl，反应结束后变为绿色，为阳性。5、6号管浓度为0.2、0.02ng/μl，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。表明本试剂盒最低可检测到2ng/μl的基因组RNA。
4.特异性检测
选择正常人血液5例、急性白血病患者血液5例，PML-RARα表达阳性的白血病细胞株1例(NB4细胞)，提取RNA，按照1.6条件进行LAMP扩增。25分钟时，阳性结果5例，均为白血病患者的RNA，时间延长至40分钟，其他RNA仍为阴性，正确率100％，表明本试剂盒具有很高的特异性。如图3所示，1-5号管为PML-RARα表达阳性的白血病患者样本，6号管为PML-RARα表达阳性的NB4细胞，反应结束后1-6号管均变为绿色，为阳性。7-11号管为正常人样本，不表达PML-RARα，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。
5.利用本发明通过检测PML-RARα基因表达来检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病与现有常规检测方法的优劣对比，见表4。
表4本试剂盒检测与现有常规检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的方法对比
由表4可以看出，本发明的方法相对于现有常规检测急性早幼粒细胞白血病微小残留病的方法，不需要专用的仪器，操作过程简单，并且对操作者的要求较低，操作的时间少于1h，检测的灵敏度和特异性较高。
Claims (4)
1.一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物，其特征在于，内引物F3:其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；内引物B3:其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；外引物FIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；外引物BIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。
2.一种PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的试剂盒，其特征在于，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μLpH8.8的Tris-HCl，0.01μmol/μLKCl，0.016μmol/μLMgSO4，0.01μmol/μL(NH4)2SO4，0.04μl/20μLTween20，1.6μmol/μL甜菜碱，4种dNTPs的含量都为0.056μmol/μL，200U/μL逆转录酶，160U/μLBstDNA聚合酶，50pmol/μL钙黄绿素，1.6pmol/μL引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，1.6pmol/μL引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，0.2pmol/μL引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，0.2pmol/μL引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
所述阳性对照为：PML-RARα表达阳性的NB4细胞基因组总RNA；阴性对照为：超纯水。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，LAMP反应液为1ml、阳性对照50μL、阴性对照1ml。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包括：反应管50个，10μL移液器头100个。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410682429.3A CN104328211B (zh) | 2014-11-24 | 2014-11-24 | PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410682429.3A CN104328211B (zh) | 2014-11-24 | 2014-11-24 | PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104328211A CN104328211A (zh) | 2015-02-04 |
| CN104328211B true CN104328211B (zh) | 2016-06-22 |
Family
ID=52403016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410682429.3A Expired - Fee Related CN104328211B (zh) | 2014-11-24 | 2014-11-24 | PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104328211B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111850131B (zh) * | 2020-08-26 | 2023-06-27 | 苏州卫生职业技术学院 | 一种检测pml-rara融合基因的lamp引物组、试剂盒及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399901A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-04 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 结核杆菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| CN102424841A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-25 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 旋毛虫的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004089089A (ja) * | 2002-08-30 | 2004-03-25 | Srl Inc | ＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡ測定用核酸及びそれを用いたＰＭＬ−ＲＡＲＡキメラｍＲＮＡの測定方法 |
| CN101341260B (zh) * | 2005-10-07 | 2014-02-12 | 强生研究有限公司 | 多组分核酸酶及其使用方法 |
| CA2902167A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits |
| CN103725787B (zh) * | 2014-01-15 | 2015-07-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒 |
-
2014
- 2014-11-24 CN CN201410682429.3A patent/CN104328211B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102399901A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-04 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 结核杆菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
| CN102424841A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-04-25 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 旋毛虫的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Using reverse transcript loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of PML-RARA fusion gene;Zhang Y,et al;《 JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL HEMATOLOGY》;20121231;第53卷(第9期);PS-2-51 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104328211A (zh) | 2015-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tan et al. | Recent advances in recombinase polymerase amplification: Principle, advantages, disadvantages and applications | |
| Li et al. | Cas12aFDet: A CRISPR/Cas12a-based fluorescence platform for sensitive and specific detection of Listeria monocytogenes serotype 4c | |
| CN108060257B (zh) | 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法 | |
| CN111235313A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法 | |
| CN112239795A (zh) | 基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒 | |
| CN102816847B (zh) | 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒 | |
| CN113186313A (zh) | 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒 | |
| CN105039322B (zh) | Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒 | |
| CN106868220A (zh) | 一种用于扩增MERS‑CoV的LAMP引物组及试剂盒 | |
| Wang et al. | Primer dephosphorylation-initiated circular exponential amplification for ultrasensitive detection of alkaline phosphatase | |
| Gou et al. | The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3 | |
| CN103436602A (zh) | 双重分子信标-lamp法同时检测金黄色葡萄球菌基因和大肠杆菌基因的试剂盒及方法 | |
| CN115820939A (zh) | 用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用 | |
| Kim et al. | Advanced target‐specific probe‐based real‐time loop‐mediated isothermal amplification assay for the rapid and specific detection of porcine circovirus 3 | |
| Wang et al. | A novel real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification detection platform: application to diagnosis of COVID-19 | |
| CN104328209B (zh) | 白血病微小残留病wt1基因快速检测方法的引物和试剂盒 | |
| CN104328211B (zh) | PML-RARα融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 | |
| Chen et al. | Smartphone-assisted fluorescence-based detection of sunrise-type smart amplification process and a 3D-printed ultraviolet light-emitting diode device for the diagnosis of tuberculosis | |
| CN105039598A (zh) | 一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒 | |
| CN103698516A (zh) | 一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂 | |
| CN104328210B (zh) | Aml1/eto融合基因的环介导等温扩增检测方法的引物和试剂盒 | |
| CN104278024B (zh) | 用于鉴定人类腺病毒55型的引物组合物以及它们的应用 | |
| CN108676921A (zh) | 一种用于禽腺病毒检测的lamp引物组及检测方法及其应用 | |
| CN112980844A (zh) | 针对有转录活性的SARS-CoV-2的检测试剂盒和使用方法 | |
| CN112126695A (zh) | 一种结核分枝杆菌复合群环介导等温扩增检测用引物组合物及反应体系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210603 Address after: Room 1309, building 3, Dongdu International Plaza, 88 Gongye North Road, Licheng District, Jinan City, Shandong Province, 250132 Patentee after: Shandong ShuoKe Biotechnology Co.,Ltd. Patentee after: BEIJING LANPU BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. Address before: No.18877, Jingshi Road, Lixia District, Jinan City, Shandong Province, 250062 Patentee before: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE, SAMS Patentee before: BEIJING LANPU BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160622 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |