CN103698516A - 一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂 - Google Patents

一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂，该试剂通过对等温环介导扩增所使用的引物组中的前内引物标记一种抗原同时对后内引物标记另一种抗原，能够在扩增鼠疫耶尔森菌特异性目的基因的同时对该基因进行标记。标记后使用配套的胶体金试纸能够快速检测目的基因的扩增产物，从而检测鼠疫耶尔森菌。本发明的检测试剂操作简单快速、特异性强、灵敏度高。

Description

一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂
技术领域
本发明涉及一种应用于核酸检测的试剂，具体讲，涉及一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂。 
背景技术
鼠疫耶尔森菌，俗称鼠疫杆菌，是鼠疫的病原菌。鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。直至十九世纪末，鼠疫耶尔森菌才被分离和命名。此菌引起的是啮齿动物中的自然疫源性疾病，传染性强，病死率高，易酿成大流行，从公元6～19 世纪发生过3 次大流行。此菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎。第二次世界大战期间，日本侵略军曾利用鼠疫耶尔森菌制造细菌武器，我国东北地区发生过流行。1994年印度发生了鼠疫的爆发流行，死亡率高达10%～30%。未治疗病人病情凶险，病程早期进行治疗可大大降低病死率。鼠疫耶尔森菌的快速检测对鼠疫的防控具有重要的意义。 
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的核酸检测技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，在60℃～65℃恒温扩增， 60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强等特点。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应。其扩增结果可以通过凝胶电泳、肉眼观察焦磷酸镁沉淀或加入荧光物质后的颜色改变来做初步的判断。但该方法也有一定的缺陷，主要表现在扩增结果检测环节，凝胶电泳检测容易造成污染，焦磷酸镁沉淀检测灵敏度较差，荧光物质变色方法受到荧光物质的成本或者需要使用检测仪器的限制。因此，在产物检测环节的限制，影响了该技术的推广应用。 
本发明公开了一种新型的等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂。该方法具有本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高，结果判断更准确的优势。 
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂。 
本发明的第二发明目的在于提供一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测方法。 
本发明的第三发明目的在于提供这种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂盒的应用。 
发明的主要技术方案为： 
1. 等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂的组成为：
（1）核酸恒温标记扩增反应试剂
核酸恒温扩增反应液中含有前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物、后内引物、dNTPs溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶（如：Bst DNA聚合酶等）、MgSO4、无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。
环介导等温扩增的缓冲液的最终工作浓度为20 mM Tris-HCl、10 mMKCl、10 mM  (NH4)2SO4、2 mM MgSO4以及质量浓度为0.1% Triton X-100，缓冲液的pH值为8.8。 
其中前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物、后内引物均为人工合成的脱氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、后外引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、前促环引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3、后促环引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4、前内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5、后内引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6，上述引物分别与待测基因的相应位置互为反义互补序列，上述引物能够在等温条件下以环介导的方式检测待测基因。将前内引物的5’端标记上生物素基团，将后内引物的5’端标记上异硫氰酸荧光素基团。 
各引物的具体核苷酸序列如下： 
SEQ ID NO:1 5’- agctttactgaacccccagcc-3’,
SEQ ID NO:2 5’- ccgattatttacagttggctgcc-3’,
SEQ ID NO:3 5’- ttgatgtatgagcaatacaccgg-3’,
SEQ ID NO:4 5’- ctctttatagtcggagaaatcacg-3’,
SEQ ID NO:5 5’- actcccacaactgggggggaattttttctgggcacaataaagcaaca-3’,
SEQ ID NO:6 5’- cccccccagtggctgggcttttcgcctcaatggatggcact-3’。
（2）标记核酸胶体金检测试纸条 
该试纸条的组成包括样品垫、金胶垫、醋酸纤维素膜（膜上由相应的抗体组成的检测线和质控线）和吸水垫等，具体组成参见附图1。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。
2.使用等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂的具体步骤为： 
（1）将待检测的DNA溶液，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中；在对照PCR管中分别加入阳性对照试剂和阴性对照试剂，将上述PCR管在60～65℃下扩增反应30～60分钟，优选条件为63℃下扩增反应60分钟。
（2）利用标记核酸胶体金检测试纸条，检测PCR管中反应后的核酸扩增产物。 
下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明： 
等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂能够在60～65℃下将鼠疫耶尔森菌的DNA进行扩增，在扩增的同时，由于前内引物和后内引物分别标记有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团，因此在DNA扩增产物上同时含有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。
上述扩增产物滴加在核酸胶体金检测试纸条的样品垫上，在层析作用下，扩增产物在经过金胶垫时双标记的核酸扩增产物由于携带有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团，因此能够和标记有金颗粒的抗生物素抗体结合形成核酸抗体复合物；核酸抗体复合物在醋酸纤维素膜上层析，经过检测线时该复合物由于带有异硫氰酸荧光素基团，因此能够和检测线上的抗异硫氰酸荧光素抗体结合，形成复合物，该复合物由于携带有有色的标记物（纳米金颗粒呈红色），此时检测线呈现红色；当核酸抗体复合物或者单独的标记抗生物素抗体经过质控线时，由于质控线上含有能够结合抗生物素抗体的二抗，所以只要有标记的抗生物素抗体层析至质控线，无论该抗体是否结合有标记的核酸，均能够形成二抗和标记抗体的复合物，该复合物由于携带有有色的标记物（纳米金颗粒呈红色），此时质控线呈现红色。 
本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高，结果判断更准确的优势。首先，本发明的新型恒温环介导核酸标记检测试剂，使用标记的引物，使得环介导等温扩增后，扩增产物携带了两种抗原标记物。这样的双标记核酸扩增产物，能够被制备好的胶体金试纸条检测出来。当含有双标记扩增产物的样本在胶体金试纸上层析时，双标记产物能够结合携带有有色颗粒标记的抗体，在检测线上呈现红色，这样目的扩增产物可以通过试纸上检测线的颜色改变显示出来。即使有很少的扩增产物也能够进行准确的检测，因此有效地提高了检测灵敏度。其次，检测反应的结果通过胶体金检测试纸的检测线得到，相对于浊度观察法和荧光燃料变色法读取结果更加准确，避免了由于检验人员主观判断带来的结果偏差。上述检测方法扩大了该检测试剂的应用范围，使之可以广泛应用于野外现场等特殊环境。此方法操作简单、时间短，同时也降低了检测成本，使得检测结果更加快速、可靠，具有免疫与核酸诊断试剂各自的优点。该技术由于操作简单、快速、低廉的成本和防止核酸扩增物对实验室的污染，对于病原体的检测具有重大意义。 
附图说明
附图1胶体金试纸条的组成。 
该试纸条的组成包括样品垫（1）、金胶垫（2）、醋酸纤维素膜（3）、质控线（4）、检测线（5）和吸水垫（6）。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。 
附图2 鼠疫耶尔森菌标记扩增检测结果 
加入的扩增DNA模板如下，1号条为假结核耶尔森菌DNA模板标准品；2号条为本待测样品DNA；3号条为鼠疫耶尔森菌DNA模板标准品。
下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。 
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅对本发明做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容进行限制。 
实施例1：鼠疫耶尔森菌DNA基因组梯度稀释标记扩增检测
取浓度已知的鼠疫耶尔森菌DNA基因组对其进行10倍梯度稀释，稀释至鼠疫耶尔森菌DNA中的目的基因终浓度为100拷贝/μL，取鼠疫耶尔森菌DNA模板标准品制备的阳性参照物，阴性参照物，以及鼠疫耶尔森菌DNA梯度稀释液（在PCR管中鼠疫耶尔森菌特异性目的基因的终浓度分别为104拷贝、103拷贝、102拷贝、101拷贝和100拷贝），做为模板进行标记扩增检测。
 
等温扩增中的各组分构成比例如下：
Figure 2013107338014100002DEST_PATH_IMAGE001
1倍缓冲液中各物质组成如下：20 mM Tris-HCl、10 mMKCl、10 mM  (NH4)2SO4、2 mM MgSO4以及质量浓度为0.1% Triton X-100，缓冲液的pH值为8.8，10倍缓冲液的各组份浓度是1倍缓冲液中各组份浓度的10倍。
将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增，扩增步骤为：60℃，30分钟；80℃，2分钟。 
将扩增产物加于胶体金检测试纸条上，在15分钟之内读取结果，当检测线和质控线都呈现红色时为阳性结果；当检测线无色、质控线呈现红色时为阴性结果；当质控线无色时，实验失败，需要重新进行实验。 
浓度已知的鼠疫耶尔森菌DNA基因组进行梯度稀释，分别加入为鼠疫耶尔森菌DNA模板标准品制备的阳性参照物、104-100拷贝目的基因的鼠疫耶尔森菌DNA和用于做参照的无菌水，扩增结果为其中阳性参照物和104-100拷贝目的基因的扩增产物均为阳性，阴性参照物的扩增结果为阴性。 
实施例2：鼠疫耶尔森菌的检测
样本：某DNA样本怀疑为鼠疫耶尔森菌。
取该样本进行等温标记扩增检测扩增 
等温扩增中的各组分构成比例如下：
Figure 2013107338014100002DEST_PATH_IMAGE002
1倍缓冲液中各物质组成如下：20 mM Tris-HCl、10 mMKCl、10 mM  (NH4)2SO4、2 mM MgSO4以及质量浓度为0.1% Triton X-100，缓冲液的pH值为8.8，10倍缓冲液的各组份浓度是1倍缓冲液中各组份浓度的10倍。
将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增，扩增步骤为：60℃，30分钟；80℃，2分钟。 
将扩增产物加于胶体金检测试纸条上，在15分钟之内读取结果，当检测线和质控线都呈现红色时为阳性结果；当检测线无色、质控线呈现红色时为阴性结果；当质控线无色时，实验失败，需要重新进行实验。 
实施例2的结果见附图2 所示，各扩增产物中加入的DNA模板如下，1号条为假结核耶尔森菌DNA模板标准品；2号条为本待测样品DNA；3号条为鼠疫耶尔森菌DNA模板标准品。 
<110>天津国际旅行卫生保健中心
<120>一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂
<160>6
<170>patent version 2.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>1
agctttactgaacccccagcc
      
 
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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ccgattatttacagttggctgcc              
 
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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ttgatgtatgagcaatacaccgg            
 
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ctctttatagtcggagaaatcacg
 
<210>5
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
actcccacaactgggggggaattttttctgggcacaataaagcaaca
 
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>6
cccccccagtggctgggcttttcgcctcaatggatggcact
 
 

Claims (6)

1.一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括鼠疫耶尔森菌等温环介导核酸标记扩增反应液，该反应液中含有前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、5’端标记生物素基团的前内引物、5’端标记异硫氰酸荧光素基团的后内引物、dNTPs溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶（如：Bst DNA聚合酶）、MgSO4、无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂，其特征在于，使用的前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物和后内引物的序列如下：
SEQ ID NO:1 5’- agctttactgaacccccagcc-3’,
SEQ ID NO:2 5’- ccgattatttacagttggctgcc-3’,
SEQ ID NO:3 5’- ttgatgtatgagcaatacaccgg-3’,
SEQ ID NO:4 5’- ctctttatagtcggagaaatcacg-3’,
SEQ ID NO:5 5’- actcccacaactgggggggaattttttctgggcacaataaagcaaca-3’,
SEQ ID NO:6 5’- cccccccagtggctgggcttttcgcctcaatggatggcact-3’。
3.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂，其特征在于，使用该试剂，能够在扩增目的基因的同时将扩增产物DNA上标记生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。
4.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂，其特征在于，将提取得到的待测DNA溶液作为扩增模板加入到装有核酸恒温标记扩增反应液的PCR管中，在60～65℃下扩增反应30～60分钟，优选63℃下扩增反应60分钟。
5.一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂所使用的胶体金检测试纸，其特征在于，胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。
6.根据权利要求4所述的一种新型等温环介导鼠疫耶尔森菌核酸标记检测试剂所使用的胶体金检测试纸，其特征在于，将待测标记扩增产物滴加在检测试纸的样品垫上，当检测线和质控线都呈现红色时表明DNA样品中含有鼠疫耶尔森菌的待测基因，当检测线无色而质控线呈现红色表明DNA样品中不含有鼠疫耶尔森菌的待测基因。
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